榮耀軍，古韶東，張貴育，楊光義，2，巢陽發(fā)，綦林華，郝曉將，李曉林，張舞紅，何偉燕

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院，廣東 深圳 518000；2.深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

大腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率及死亡率排名第一的消化道惡性腫瘤。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）預(yù)測未來50年全球癌癥居首的是CRC[1]。目前西醫(yī)主要采用手術(shù)、放療、化療及靶向治療等方法治療本病，存在生存率低和放療、化療的耐藥性高、毒性高等問題。早期CRC患者的5年生存率為90%，局部晚期CRC患者的5年生存率為70%，轉(zhuǎn)移性CRC患者的5年生存率為15%[2]，臨床上大多數(shù)CRC患者在診斷時已處于中晚期[3]。因此，尋找更加安全有效的臨床藥物是很重要的。

腸道菌群（intestinal flora，IF）參與了大腸癌發(fā)生發(fā)展，一些腸道微生物能通過塑造腫瘤微環(huán)境或形成生物膜驅(qū)動腫瘤的發(fā)生。腸道微生物通過屏障效應(yīng)和抑制DNA損傷來保護(hù)腸黏膜，抵抗病原體入侵，并調(diào)節(jié)腸黏膜細(xì)胞的增殖[4]。腸道菌群能影響膽汁酸的合成、代謝和組成，通過改變患者體內(nèi)膽汁酸的種類或數(shù)量來減輕炎癥。補(bǔ)充有益菌、移植或改或改善腸道菌群的組成，能緩解疾病的進(jìn)展[5-6]。有研究表明，腫瘤微環(huán)境中TNF-α和IL-1β對核因子-κB（NF-κB）的激活以及IL-6對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子STAT3的激活可加強(qiáng)結(jié)腸炎癥，誘導(dǎo)不受控制的細(xì)胞增殖，并進(jìn)一步促進(jìn)CRC進(jìn)展[7-9]。

芍藥湯（Shaoyao decoction，SYD）由白芍、當(dāng)歸、黃連、檳榔、木香、炙甘草、大黃、黃芩、肉桂組成，具有清熱燥濕、調(diào)和氣血之功。SYD經(jīng)過煎煮濃縮后的主要成分有小檗堿、芍藥苷、漢黃芩素及沒食子酸等化合物[10]。SYD對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型有保護(hù)作用，包括抑制炎癥、抑制受刺激的STAT3和NF-κB信號通路及改善結(jié)腸中的腸道屏障功能[11]。SYD也能通過抑制IL-1β、IL-6和TNF-α炎癥因子，減弱TAM浸潤和NF-κB活化，抑制Snail誘導(dǎo)的EMT來改善CRC[12]。有研究表明，SYD能通過激活GPX4、抑制上皮細(xì)胞鐵死亡和進(jìn)一步恢復(fù)屏障功能來減輕腸道炎癥[13]，并能通過激活Nrf2通路和上調(diào)Nrf2下游Ⅱ期酶的表達(dá)，有效增強(qiáng)抗氧化能力[14]。SYD能在抗炎和抗氧化共同作用下，通過Keap1-Nrf2-ARE信號通路，預(yù)防和治療與潰瘍結(jié)腸炎相關(guān)的CRC[15]。SYD也能通過抗炎和調(diào)節(jié)IF改善濕熱腹瀉大鼠的預(yù)后[16]，然而，SYD防治CRC是否與IF有關(guān)，尚未見報道。

因此，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）分析SYD中主要活性成分，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法，從IF角度探究SYD防治CRC活性成分、關(guān)鍵靶點及主要通路，進(jìn)一步闡明SYD調(diào)控IF防治CRC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 白芍30 g（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：2102181）、當(dāng)歸15 g（亳州市永剛飲片有限公司，批號：210620）、黃連15 g（亳州市永剛飲片有限公司，批號：201220）、檳榔6 g（廣東匯群中藥飲片股份有限公司，批號：20210301）、木香（后下）6 g（亳州市盛林藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：CP-030-201201）、炙甘草6 g（廣州至信中藥飲片有限公司，批號：210601）、大黃9 g（廣東匯群中藥飲片股份有限公司，批號：20210501）、黃芩15 g（亳州廣源堂中藥飲片有限公司，批號：210401）、肉桂（后下）7.5 g（安徽亳藥千草中藥飲片有限公司，批號：2106034）均購自深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，中藥均經(jīng)深圳寶安區(qū)中醫(yī)院張貴育執(zhí)業(yè)中藥師鑒定為正品。

1.2 主要儀器 質(zhì)譜儀（型號：Q ExactiveTMHF，德國Thermo Fisher）；色譜儀（型號：Vanquish UHPLC，德國Thermo Fisher）；色譜柱[型號：Hypesil Gold column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），美國Thermo Fisher]；低溫離心機(jī)（型號：D3024R，美國Scilogex）。

1.3 樣品的制備 采用水煎方法制備SYD，煎煮2次合并，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，使藥物質(zhì)量濃度為2 g/mL，儲存于-20 ℃冰箱中。將樣品（100 μL）置于EP管中并用預(yù)冷的80%甲醇通過井渦旋，然后將樣品在冰上孵育5 min，在15 000×g，4 ℃離心20 min，部分上清液稀釋至最終LC-MS級水測定含53%甲醇的濃度。隨后將樣品轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中，在15 000×g，4 ℃離心20 min。最后，將上清液注入LC-MS/MS系統(tǒng)分析[17-18]。

1.4 SYD的活性成分及靶點基因篩選 通過LC-MS對SYD化合物進(jìn)行檢測，并結(jié)合文獻(xiàn)，篩選出主要活性成分；利用SwissADME數(shù)據(jù)庫對SYD的主要活性成分進(jìn)一步篩選，根據(jù)胃腸道吸收（Gastrointestinal，GI）評分及藥物相似性（Drug likeness）大于3個“YES”，并使用PubChem數(shù)據(jù)庫獲得SYD主要活性成分2D結(jié)構(gòu)式，將2D結(jié)構(gòu)式輸入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，預(yù)測出SYD主要活性成分的靶點基因。

1.5 CRC及IF 的靶點基因篩選 通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）及TTD 數(shù)據(jù)庫（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）搜索“Colorectal cancer”“Intestinal flora”，篩選去重后，獲得CRC及IF的靶點基因。

1.6 交集靶點、蛋白互作分析及Hub基因篩選 通過Draw venn diagram軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲取SYD、CRC及IF的交集靶點基因；將交集靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，選擇Homo Sapiens，進(jìn)行蛋白互作分析；使用Cytoscape 3.8.0軟件，利用cytoHubba插件，通過MCC、MNC、EPC、Degree及Closeness 5種算法，取前10的Hub基因，并獲得最終Hub基因。

1.7 富集分析 將交集靶點基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫，設(shè)置基因物種H.sapiens，選取Custom Analysis，分別對KEGG通路及GO功能（GO Biological Processes、GO Cellular Components、GO Molecular Functions）進(jìn)行富集分析，將KEGG通路及GO功能數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件，繪制KEGG氣泡圖及GO柱形圖。

1.8 分子對接 將Hub基因?qū)險iprot數(shù)據(jù)庫，設(shè)置篩選條件。種類：Homo Sapiens，狀態(tài)：Reviewed，獲得蛋白結(jié)構(gòu)，輸入RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲得Hub基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)，并使用Pymol 2.6.0軟件去除水分子和小分子；從PubChem數(shù)據(jù)庫獲得SYD主要活性成分的2D結(jié)構(gòu)式，使用Open Babel GUI 2.4.1軟件將2D結(jié)構(gòu)式轉(zhuǎn)換3D mol2格式；將大分子和SYD主要活性成分分別導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6加氫，并設(shè)置為受體及配體；使用半柔性對接，導(dǎo)入大分子和SYD成分pdbqt文件，設(shè)置參數(shù)，Number of GA Runs：50，其余為默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行對接，獲得結(jié)合自由能。使用Pymol 2.6.0軟件將對接結(jié)果可視化，構(gòu)建分子對接模式圖。

2 結(jié)果

2.1 SYD主要活性成分分析 通過LC-MS檢測出SYD的化合物，其中正離子模式峰值比負(fù)離子模式峰值多，正離子模式檢測出384種化合物，負(fù)離子模式檢測出333種化合物，共717種化合物。（見圖1～2）將SYD化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比對[10，19]，確定其名稱、分子式、相對分子量、保留時間及質(zhì)荷比等，共鑒定出18種主要活性成分。（見表1）

表1 芍藥湯化學(xué)成分鑒定表

圖1 正離子模式下的總離子流圖

圖2 負(fù)離子模式下的總離子流圖

2.2 SYD活性成分靶點及CRC、IF靶點篩選 通過SwissADME數(shù)據(jù)庫對SYD主要活性成分進(jìn)行篩選，最終確定11種主要活性成分，分別為檳榔堿、沒食子酸、3-甲基吲哚、小檗堿、桂皮醛、異甘草素、白楊素、芒柄花黃素、洋川芎內(nèi)酯A、漢黃芩素、大黃素。11種主要活性成分經(jīng)過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測，去重后共獲得500個靶點基因。（見圖3）通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫及TTD數(shù)據(jù)庫分別獲得CRC靶點基因1122個，IF靶點基因463個。

圖3 SYD 成分-靶點圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及Hub基因 將SYD、CRC、IF的靶點基因取交集，共獲得31個交集靶點，并構(gòu)建Venn圖。（見圖4）將31個交集靶點通過String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作分析，拓樸分析得出共有31個節(jié)點、231條邊，平均節(jié)點度值為14.9。（見圖5）。通過cytoHubba插件，最終獲得6個Hub基因，為ALB、TNF、IL1B、MMP9、PTGS2、PPARG（見圖6），對應(yīng)8種活性成分，為沒食子酸、芒柄花黃素、小檗堿、白楊素、大黃素、異甘草素、漢黃芩素、洋川芎內(nèi)酯A。

圖4 SYD、CRC 與IF 交集靶點Venn 圖

圖5 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 富集結(jié)果分析 KEGG富集主要涉及癌癥通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路等前20條通路。（見圖7～8）。根據(jù)KEGG富集分析獲得前20條信號通路，以及對應(yīng)關(guān)鍵靶點、活性成分，構(gòu)建出藥物-成分-疾病-菌群-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)圖。（見圖9）前10條GO-BP功能分析主要包括炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程；前10條GO-CC功能分析主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、核膜及蛋白激酶復(fù)合物等細(xì)胞組分；前10條GO-MF功能分析主要包括血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、雌激素2-羥化酶活性等分子功能。

圖7 KEGG 富集分析氣泡圖

圖8 GO 富集分析柱狀圖

圖9 藥物-成分-疾病-菌群-靶點-通路圖

2.5 分子對接結(jié)果 將6個Hub基因及對應(yīng)8種主要活性成分進(jìn)行分子對接，共對接15次。其結(jié)合自由能值越低，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，發(fā)生相互作用越大。分子對接結(jié)果顯示：SYD活性成分與Hub基因結(jié)合自由能均低于-4 kcal/mol，其對接結(jié)果較好，具有一定的可信度。（見表2）將結(jié)合自由能最低值導(dǎo)入Pymol 2.6.0軟件進(jìn)行可視化。（見圖10）

表2 分子對接結(jié)果

圖10 分子對接圖

3 討論

CRC在中醫(yī)學(xué)中屬“腸蕈”“臟毒”“腸風(fēng)”“痢疾”“鎖肛痔”“便血”等范疇。芍藥湯“下血調(diào)氣。經(jīng)曰：溲而便膿血，氣行而血止，行血則便自愈，調(diào)氣則后重自除?！保ā端貑柌C(jī)氣宜保命集·卷之中》）癥狀與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)CRC的黏液鼻涕樣血便有著相似之處。CRC發(fā)病機(jī)制通常與信號通路相關(guān)，如Wnt信號通路[20]、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通路[21-22]、法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）信號通路[23]、NF-κB信號通路[24]等。杜懷棠認(rèn)為CRC的病機(jī)與“氣”密切相關(guān)，正氣虧虛，氣機(jī)紊亂，毒結(jié)留滯是致病之源；氣滯、痰凝、血瘀、毒結(jié)，膠結(jié)留滯腸道，壅聚不散，日久生積是CRC產(chǎn)生的基礎(chǔ)[25]。劉完素以“行血調(diào)氣”為法，創(chuàng)立芍藥湯，此方用大黃之蕩滌邪滯，木香、檳榔之理氣，當(dāng)歸、肉桂之行血；病多因濕熱而起，故用黃芩、黃連之苦寒以燥濕清熱；用芍藥、甘草，緩其急而和其脾。全方配伍，以清熱燥濕為主，兼以調(diào)和氣血，用于防治CRC。

本研究采用LC-MS技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選出SYD調(diào)控IF防治CRC的活性成分、關(guān)鍵靶點及主要通路。SYD、CRC和IF交集靶點基因中的ALB、TNF、IL1B、MMP9、PTGS2、PPARG為Hub靶點基因，其對應(yīng)8種主要活性成分。其中小檗堿可以減少炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠的腫瘤數(shù)量，并重塑小鼠中致病菌和有益菌的組成。小檗堿能增加糞便丁酸、乙酸和丙酸水平，但不改變異丁酸、異戊酸、戊酸和己酸。此外，小檗堿能降低結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生小鼠糞便中脂多糖的含量。小檗堿可以通過TLR4/p-NF-κB p65/IL-6/p-STAT3炎癥-癌癥轉(zhuǎn)化通路抑制炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌[26]。沒食子酸可以逆轉(zhuǎn)環(huán)境壓力導(dǎo)致腸道微生物群和代謝紊亂，顯著降低幼犬腹瀉的發(fā)生率并減輕多種環(huán)境應(yīng)激源引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[27]。芒柄花黃素可能是一種潛在的益生元，可以有效調(diào)節(jié)腸道微生物群，改善宿主代謝和全身炎癥，并能通過提高醋酸乳酸和乳酸丁酸的產(chǎn)生來預(yù)防飲食的有害影響[28]。白楊素能夠干擾果糖對腸道的影響水平，增加大鼠腸道中的厚壁菌門與擬桿菌門的比例，這可能有助于治療果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征[29]。大黃素可以增加糞便中的乳酸桿菌，通過調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌和腸道干細(xì)胞發(fā)育，減輕結(jié)腸炎癥，并能抑制沙門氏菌感染引起的杯狀細(xì)胞損失[30]。異甘草素能降低大腸桿菌和腸球菌等病原體，升高菌群中普氏菌屬、丁酸桿菌屬、梭菌屬和瘤胃球菌的豐度，從而抑制大腸癌的發(fā)展[31]。漢黃芩素等黃酮類提取物可以在病理狀態(tài)下增加腸道菌群的生物轉(zhuǎn)化能力，通過抑制體內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活來改善甲型流感病毒（IAV）誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷（ALI）[32]。洋川芎內(nèi)酯類化合物在抗氧化損傷、抗炎、抗凝血、抗動脈粥樣硬化、抗腦缺血再灌注損傷等方面有較好的應(yīng)用前景[33]。8種SYD主要活性成分均具有調(diào)節(jié)IF的作用，因此，SYD能夠改善腸道中菌群種類和豐度。

在CRC發(fā)生過程中，次級膽汁酸水平升高能通過多種機(jī)制對結(jié)腸上皮的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生有害影響，包括NF-κB信號通路的激活、DNA的氧化損傷和結(jié)腸細(xì)胞的過度增殖[34]。此外，食物在腸道中可以被微生物發(fā)酵為短鏈脂肪酸——乙酸、丙酸和丁酸等，它們對腸道免疫至關(guān)重要。其中丁酸梭菌菌體可下調(diào)IL-17信號通路、TNF信號通路等炎癥相關(guān)通路，從而緩解炎癥[35]。KEGG富集分析顯示，SYD防治CRC的通路與上述通路基本一致，其中ALB、TNF、IL1B、MMP9、PTGS2、PPARG靶點均可參與到炎癥反應(yīng)中[36-39]，表明SYD可能通過調(diào)節(jié)IF，參與相關(guān)炎癥通路（如IL-17、TNF、NF-κB等），發(fā)揮防治CRC的功效。但SYD防治CRC與IF的作用機(jī)制，還需進(jìn)一步實驗驗證。