時(shí)萌萌，周 坤，顧洪偉，劉春芳，馬 良

（1.武漢市精神衛(wèi)生中心，湖北 武漢 430022；2.武漢市心理醫(yī)院，湖北 武漢 430022）

高泌乳素血癥（hyperprolactin，HPRL）為臨床內(nèi)分泌科常見(jiàn)疾病，其病因廣泛，HPRL可由生理因素、病理因素和藥物治療因素等導(dǎo)致[1-2]。該病可導(dǎo)致患者性功能障礙、骨密度降低、月經(jīng)紊亂、乳房異常發(fā)育、溢乳、下丘腦-垂體-性腺軸抑制，嚴(yán)重時(shí)可增加乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前，臨床上針對(duì)HPRL多采用多巴胺受體激動(dòng)劑-溴隱亭、卡麥角林治療。但由于治療過(guò)程中極易產(chǎn)生耐藥性和嚴(yán)重不良反應(yīng)，并且溴隱亭和卡麥角林激活多巴胺受體會(huì)導(dǎo)致使用多巴胺受體拮抗劑的精神障礙患者治療失敗，故采用上述兩藥治療HPRL的遠(yuǎn)期風(fēng)險(xiǎn)可能大于收益[4-5]。中醫(yī)藥在緩解HPRL方面具有優(yōu)勢(shì)[6-7]，當(dāng)前中藥方劑芍藥甘草湯[8-11]和生麥芽[12-15]治療HPRL已有成熟的報(bào)道。其療效溫和持久、不良反應(yīng)少，但其作用機(jī)制尚不明確。

高泌乳素血癥是泌乳素瘤的典型臨床表現(xiàn)。溴隱亭、卡麥角林可能通過(guò)自噬和凋亡途徑誘導(dǎo)泌乳素瘤細(xì)胞死亡[16-17]，進(jìn)而抑制泌乳素分泌。Akt/mTOR通路是調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典信號(hào)通路之一[18]，芍藥甘草湯和生麥芽是否也是通過(guò)調(diào)控自噬通路減輕藥理性高泌乳素血癥有待研究。因此，本研究采用隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)方法研究芍藥甘草湯和生麥芽對(duì)HPRL大鼠血清泌乳素水平的影響，并結(jié)合蛋白免疫印跡法（Western blotting）、免疫組化法（immunohistochemistry，IHC）考察大鼠乳腺組織中p-Akt、p-mTOR、LC3等分子水平，探究?jī)烧咧委烪PRL作用機(jī)制，為尋找更加安全、有效的中藥復(fù)方提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為后期深入的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 奧林巴斯生物顯微鏡（上海通灝光電科技有限公司，型號(hào)：BX53）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司，型號(hào)：FlexStation 3）；微型高速離心機(jī)（美國(guó)Labnet公司，型號(hào)：C2500-R-230V）；電泳儀（上海天能科技有限公司，型號(hào)：EPS-600）。

1.2 藥物與試劑 生麥芽（批號(hào)：2005209）、白芍（批號(hào)：2121070104）、炙甘草（批號(hào)：1907105）均購(gòu)自湖北辰美中藥有限公司，經(jīng)武漢市精神衛(wèi)生中心藥學(xué)部副主任中藥師劉春芳鑒定白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、炙甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根莖加工品、生麥芽為禾本科植物大麥（Hordeum vulgare L.）的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品，質(zhì)量均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》相關(guān)項(xiàng)下的規(guī)定。鹽酸甲氧氯普胺注射液（河南潤(rùn)弘制藥股份有限公司，批號(hào)：1903072）；甲磺酸溴隱亭片（匈牙利吉瑞大藥廠，批號(hào)：T06042B）；泌乳素（PRL）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-R3006）、促黃體生成素（LH）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0026c）、雌二醇（ES）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-0152c）、孕酮（Pg）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-0154c）、促卵泡素（FSH）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0391c）均購(gòu)自伊萊瑞特生物科技股份有限公司；GAPDH兔多抗（杭州賢至生物有限公司，批號(hào)：AB-P-R 001）；mTOR兔單抗（批號(hào)：BM4182）、Akt1兔多抗（批號(hào)：A00024）、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（批號(hào)：BA1054）、mTOR（批號(hào)：BM4182）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；p-mTOR兔單抗（批號(hào)：5536）、p-Akt兔單抗（批號(hào)：4060）、LC3兔單抗（批號(hào)：3868）、Phospho-mTOR（Ser2448）（批號(hào)：5536）、Phospho-Akt（Ser473）（批號(hào)：4060）、LC3（批號(hào)：3868）均購(gòu)自Cell Signaling Technology。其余所用試劑均為分析純。

芍藥甘草湯制備：參照文獻(xiàn)[9]，取芍藥、甘草（質(zhì)量比為3∶1）適量，藥材加水至沒(méi)過(guò)藥物表面3～5 cm，浸泡30 min，武火煮沸，然后用文火煎煮30 min，取煎液。繼續(xù)加水至沒(méi)過(guò)藥渣表面約3 cm，按上述方法重復(fù)煎煮1次，混合兩次煎液，過(guò)濾，將煎煮液濃縮至質(zhì)量濃度為2.0 g/mL的流浸膏，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用時(shí)稀釋。

生麥芽煎煮液制備：取生麥芽藥材適量，加水至超過(guò)藥物表面3～5 cm，浸泡30 min，武火煮沸，然后用文火煎煮30 min，取煎液。繼續(xù)加水至超過(guò)藥渣表面約3 cm，按上述方法重復(fù)煎煮1次，混合兩次煎液，過(guò)濾，將煎煮液濃縮至質(zhì)量濃度為2.5 g/mL的流浸膏，放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)稀釋。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性（未孕）SD大鼠40只，體質(zhì)量（203.2±3.7）g，購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：42010200 004627，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012。所有大鼠飼養(yǎng)在華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在20～26 ℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%，晝夜各半循環(huán)照明，飼養(yǎng)期間大鼠自由飲水飲食。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有操作均符合科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的要求。

2 方法

2.1 模型建立、分組及給藥 隨機(jī)取8只大鼠作為正常組，其余大鼠為造模組。造模組大鼠背部皮下注射鹽酸甲氧氯普胺注射液（50 mg/kg），2次/d，連續(xù)注射7 d[19]。7 d后取血清檢測(cè)泌乳素（PRL），造模組大鼠PRL明顯高于正常組（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的32只大鼠分為模型組、芍藥甘草湯組、生麥芽組和溴隱亭組，每組8只。大鼠給藥劑量以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的體表面積比換算，人和大鼠按體表面積折算的等效劑量比值為0.018，計(jì)算大鼠劑量（mg/kg）=系數(shù)（6.3）×人的劑量（mg/kg）。芍藥甘草湯組給藥劑量為12.6 g/（kg·d），生麥芽組給藥劑量為31.5 g/（kg·d），溴隱組給藥劑量為0.53 mg/（kg·d），正常組和模型組給予等體積蒸餾水，各組均采用灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥30 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 樣本采集與樣品制備 于末次給藥結(jié)束12 h后，以10%水合氯醛腹腔注射行大鼠麻醉術(shù)，麻醉劑量按照0.3 mL/100 g計(jì)，麻醉后腹主動(dòng)脈采血，所取血液用高速離心機(jī)離心（3 000 r/min，10 min，離心半徑為8.55 cm）取上層血清；同時(shí)剝離每組大鼠的乳腺，分離其第2、3對(duì)乳腺組織，備用。

2.2.2 檢查方法與檢測(cè)指標(biāo)

2.2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠血清激素水平 將得血液樣本經(jīng)高速離心（3000r/min，10min，離心半徑為8.55cm）取上層血清，采用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定泌乳素（PRL）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（Pg）、促卵泡素（FSH）水平，實(shí)驗(yàn)操作流程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，于450 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀讀取光密度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中上述指標(biāo)的含量。

2.2.2.2 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)大鼠乳腺組織中自噬相關(guān)因子表達(dá) 取乳腺組織塊于4 ℃預(yù)冷的勻漿緩沖液中勻漿，高速離心（12000r/min，5min，離心半徑為8.55 cm），取上清液作為樣品，BCA法測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，加樣后電泳轉(zhuǎn)模，室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗GAPDH（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-Akt（1∶2 000）、mTOR（1∶500）、p-mTOR（1∶1 000）。4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜；加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶50 000）37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光液孵育后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，使用Gel-Proanalyzer 4圖像分析軟件讀取灰度值并統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)各組大鼠乳腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達(dá)水平。

2.2.2.3 免疫組化檢測(cè)大鼠乳腺組織中自噬相關(guān)因子表達(dá)分別取各組大鼠乳腺組織包埋、切片、脫蠟，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清封閉，加一抗mTOR（1∶100）、PhosphomTOR（Ser2448）（1∶100）、Akt（1∶200）、Phospho-Akt（Ser473）（1∶200）、LC3（1∶100）；加酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶100），加顯色劑，復(fù)染、脫水、封片，將晾干的切片在顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.2.2.4 乳腺組織病理特征 分別取各組大鼠乳腺組織，用甲醛固定，石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，于高倍顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示。若計(jì)量資料滿(mǎn)足正態(tài)分布和方差齊性，則多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；不滿(mǎn)足方差齊性的情況下采用Games-Howell法比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清激素水平比較 模型組大鼠血清PRL水平高于正常組（P＜0.01），F(xiàn)SH、LH、Pg、E2水平低于正常組（P＜0.01），表明造模成功。溴隱亭組大鼠血清PRL水平低于模型組（P＜0.01），LH、FSH、Pg和E2水平高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）；芍藥甘草湯組、生麥芽組大鼠血清PRL水平低于模型組（P＜0.01），芍藥甘草湯組大鼠血清FSH、Pg水平高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），生麥芽組大鼠血清FSH、Pg和E2水平高于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠血清激素水平比較 （）

表1 各組大鼠血清激素水平比較 （）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＞0.05，cP＜0.01，dP＜0.05。

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3.2 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠乳腺組織未呈現(xiàn)增生狀，乳腺小葉數(shù)量少、體積小、分布均勻，乳腺腺泡和導(dǎo)管無(wú)增生，腔內(nèi)無(wú)分泌物。與正常組比較，模型組大鼠乳腺小葉數(shù)量明顯增多、體積增大，小葉腺泡數(shù)量增多，腺泡和導(dǎo)管明顯擴(kuò)張，腔內(nèi)有大量分泌物；與模型組比較，芍藥甘草湯組和生麥芽組大鼠乳腺增生情況均改善，乳腺小葉、腺泡和導(dǎo)管增生減少，腔內(nèi)無(wú)分泌物或僅有少量分泌物出現(xiàn)。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠乳腺組織切片圖 （HE，×400）

3.3 Western blotting檢測(cè)各組大鼠乳腺組織中自噬相關(guān)因子表達(dá)情況 模型組大鼠乳腺組織中LC3-Ⅱ/Ⅰ高于正常組（P＜0.01），說(shuō)明模型組大鼠乳腺組織中自噬水平較高；芍藥甘草湯組、生麥芽組和溴隱亭組大鼠乳腺組織中及LC3-Ⅱ/Ⅰ均低于模型組（P＜0.01），表明芍藥甘草湯、生麥芽和溴隱亭可以抑制甲氧氯普胺注射造成的自噬水平提升。模型組大鼠乳腺組織p-Akt和p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常組（P＜0.01），芍藥甘草湯組、生麥芽組和溴隱亭組大鼠乳腺組織p-Akt和p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于模型組（P＜0.01），表明芍藥甘草湯、生麥芽和溴隱亭可抑制p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)。（見(jiàn)圖2、表2）

圖2 各組大鼠乳腺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表2 各組大鼠乳腺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值比較 （）

表2 各組大鼠乳腺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值比較 （）

注：與正常組比較，aP＞0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＞0.05，dP＜0.01。

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3.4 IHC檢測(cè)各組大鼠乳腺組織中自噬相關(guān)因子表達(dá)情況 模型組大鼠乳腺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達(dá)水平高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果與Western blotting檢測(cè)結(jié)果相互佐證。芍藥甘草湯組、生麥芽組、溴隱亭組大鼠乳腺組織中p-Akt、p-mTOR、LC3蛋白表達(dá)水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；芍藥甘草湯組、溴隱亭組大鼠乳腺組織中mTOR蛋白表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。（見(jiàn)圖3、表3）

圖3 各組大鼠乳腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達(dá) （免疫組化，×400）

表3 各組大鼠乳腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達(dá)水平比較 （）

表3 各組大鼠乳腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3蛋白表達(dá)水平比較 （）

注：與正常組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＞0.05，dP＜0.05，eP＜0.01。

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4 討論

高泌乳素血癥在中醫(yī)學(xué)上屬于“閉經(jīng)”“月經(jīng)失調(diào)”“乳泣”等范疇[20]。女性月經(jīng)、胎孕、乳汁均與臟腑氣血化生密切相關(guān)。腎藏精，肝藏血，肝腎同源。腎精虧則肝木無(wú)所涵養(yǎng)、氣血不足，血無(wú)法下行胞宮為月經(jīng)，反上逆為乳汁，因而表現(xiàn)為溢乳、閉經(jīng)等[21]。腎虛精虧、肝失疏泄而致氣血失和、瘀血內(nèi)阻，可見(jiàn)肝、脾、腎三臟功能失調(diào)為高泌乳素血癥主要病因，氣滯、肝郁、痰濁、瘀血為主要病機(jī)。高泌乳素血癥主要辨證為肝郁氣滯證、肝郁腎虛證、痰濕阻滯證、脾虛血瘀證4個(gè)證型[22]。芍藥甘草湯對(duì)肝郁氣滯證、肝郁腎虛證、痰濕阻滯證和脾虛血瘀證均有較好的調(diào)理作用。方中白芍苦、酸、微寒，歸肝、脾經(jīng)，可治療肝血虧虛、月經(jīng)不調(diào)、肝脾不和和胸脅脘腹疼等。其作用特點(diǎn)在于能補(bǔ)能瀉，專(zhuān)行血海，女人調(diào)經(jīng)胎產(chǎn)，一切肝病，皆宜用之。甘草甘平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，可治療脾胃虛弱、倦怠乏力、心悸氣短、咳嗽痰多、癰腫瘡毒等。其作用在于補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、調(diào)和諸藥，脾、胃、肺、心四臟同調(diào)。白芍、甘草相合，共奏酸甘化陰、滋陰柔肝、調(diào)合營(yíng)衛(wèi)、調(diào)氣疏郁之功，對(duì)氣滯、肝郁、痰濁、瘀血等為主要病機(jī)的高泌乳素血癥有較好地緩解作用。因而芍藥甘草湯在高泌乳素血癥相關(guān)癥狀的緩解和治療上具有其獨(dú)到之處?；诖吮狙芯靠疾焐炙幐什轀珜?duì)高泌乳素血癥相關(guān)癥狀的緩解和治療作用，并結(jié)合相關(guān)技術(shù)手段探究其作用機(jī)制。

芍藥甘草湯（質(zhì)量比為3∶1）和生麥芽均可降低泌乳素水平，但生麥芽在降低HPRL的同時(shí)，能夠同時(shí)升高FSH、Pg、E2水平，且升高三者的幅度較芍藥甘草湯更明顯，尤其是升高E2水平幾乎與溴隱亭療效相當(dāng)。這在臨床上具有重要意義，從而印證了生麥芽在治療乳汁異常分泌、不孕癥、高泌乳素血癥方面有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

研究發(fā)現(xiàn)，PRL對(duì)乳腺組織有直接刺激作用，可抑制Pg、FSH、LH的分泌，從而加速乳腺組織的過(guò)度增殖；此外，PRL還可與雌激素和Pg一起促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致乳腺增生[23]。本研究結(jié)果表明，芍藥甘草湯和生麥芽均可改善大鼠乳腺增生，在改善增生形態(tài)、減少增生數(shù)量、抑制分泌物形成等方面都表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)及免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芍藥甘草湯組和生麥芽組大鼠乳腺組織中p-AKT、p-mTOR、LC3-Ⅱ/Ⅰ水平顯著低于模型組，進(jìn)一步印證了芍藥甘草湯與生麥芽可能通過(guò)調(diào)控乳腺組織自噬相關(guān)蛋白水平而治療高泌乳素血癥。

孟延兵[11]研究認(rèn)為升高FSH、抑制垂體PRL mRNA、泌乳素調(diào)節(jié)元結(jié)合蛋白（PREB）mRNA表達(dá)是芍藥甘草湯治療高泌乳素血癥作用機(jī)制。龔曉云[13]研究發(fā)現(xiàn)麥芽治療高泌乳素血癥作用機(jī)制包括3個(gè)方面：（1）通過(guò)依賴(lài)于多巴胺D2受體的單靶點(diǎn)途徑發(fā)揮抗高泌乳素血癥作用；（2）直接作用于PKA，通過(guò)抑制PKA活性降低PRL水平；（3）上調(diào)DRD2與DAT受體水平啟動(dòng)cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路。曹鈺羚等[24]研究表明麥芽治療高泌乳素血癥作用機(jī)制與多巴胺介導(dǎo)的泌乳素通路調(diào)控相關(guān)。郭潤(rùn)竹[25]研究認(rèn)為麥芽治療高泌乳素血癥作用機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB/MAPK12信號(hào)通路的活化有關(guān)。朱夢(mèng)軍等[26]研究表明麥芽治療高泌乳素血癥作用機(jī)制是通過(guò)降低高泌乳素血癥大鼠腦垂體PRL的表達(dá)而達(dá)到治療作用。前期研究[27]表明，芍藥甘草湯可能通過(guò)調(diào)控FoxO、HIF-1、PRL、Jak-STAT、PI3K-Akt和MAPK等信號(hào)通路發(fā)揮治療HPRL的作用。本研究證實(shí)芍藥甘草湯和生麥芽均能通過(guò)降低大鼠乳腺組織中p-Akt、p-mTOR、LC3蛋白表達(dá)水平而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，芍藥甘草湯、生麥芽可通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路的相互作用治療高泌乳素血癥。研究結(jié)果體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療多部位、多靶點(diǎn)和整體調(diào)節(jié)的治療特色。

芍藥甘草湯、生麥芽在治療劑量下降低高泌乳素血癥大鼠血清PRL水平的效果相當(dāng)，且能夠不同程度抑制乳腺組織p-Akt、p-mTOR及LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平，其作用機(jī)制可能與減輕乳腺組織中自噬作用相關(guān)。本研究結(jié)果可為芍藥甘草湯和生麥芽治療高泌乳素血癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。