岳思恩，狄 巖，陳曉珩

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）也稱為慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎，是最普遍的器官特異性自身免疫性疾病[1]。HT的特點(diǎn)是甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有特異性抗體的產(chǎn)生，其中甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（Thyroid peroxidase antibody，TPOAb）和甲狀腺球蛋白抗體（Thyroglobulin antibody，TGAb）是最重要的致病抗體[2]。HT會(huì)引起甲狀腺組織的慢性炎癥，疾病后期常伴有甲狀腺功能改變[3]。目前主要采用糖皮質(zhì)激素、左旋甲狀腺素和特定飲食治療HT，但其有效性遭到質(zhì)疑。因此，開(kāi)發(fā)新的藥物改善HT過(guò)程中的甲狀腺功能和病理形態(tài)具有重要意義[4]?；钛`方（Huoxue Xiaoying Fang，HXXYF）是活血化瘀、散結(jié)消癭的有效方[5]。已有研究[6]顯示，活血消癭片可降低橋本甲狀腺炎伴結(jié)節(jié)患者TPOAb和TGAb水平，療效較好。但關(guān)于HXXYF對(duì)HT大鼠甲狀腺功能和病理形態(tài)的影響尚不清楚。相關(guān)研究顯示，抑制Notch通路來(lái)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）/輔助性T細(xì)胞17（Thelper17cell，Th17）平衡可對(duì)HT小鼠發(fā)揮保護(hù)作用[7]。但HXXYF能否通過(guò)調(diào)控Notch/Treg/Th17通路影響HT大鼠甲狀腺功能和病理形態(tài)尚不明確。因此，本研究主要探究HXXYF對(duì)HT大鼠甲狀腺功能和病理形態(tài)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠共84只，8周齡，體質(zhì)量為230～240 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守本院動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2020-0013，并通過(guò)倫理委員會(huì)審批（批號(hào)：2021-00926）。

1.2 藥物與試劑 HXXYF由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥劑科提供，主要由土鱉蟲(chóng)10 g、蜣螂蟲(chóng)10 g、桃仁10 g、蜈蚣5 g、貓爪草10 g、柴胡10 g、王不留行10 g、莪術(shù)10 g等組成，將上述藥物用250 mL水浸泡30 min后煎煮至200 mL，濾出濾渣收集濾液150mL，再向?yàn)V渣中加入200mL水煎煮至150mL，合并兩次濾液，用生理鹽水稀釋成生藥質(zhì)量濃度為2.112 g/mL保存于4 ℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

碘化鈉（上海金穗生物科技有限公司，批號(hào)：J43587）；豬甲狀腺球蛋白（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：JKH0040）；弗氏完全佐劑（批號(hào)：F5881）、弗氏不完全佐劑（批號(hào)：F5506）均購(gòu)自上海瓦蘭生物科技有限公司；左旋甲狀腺素鈉（levothyroxine sodium，LTSD）（武漢峰耀同輝化學(xué)制品有限公司，批號(hào)：S20193）；Notch激活劑Jagged1（美國(guó)MCE公司，批號(hào)：HYP1846A）；大鼠游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）（批號(hào)：EK-R38601）、游離甲狀腺素（Free Thyroxine，F(xiàn)T4）（批號(hào)：EK-R38599）、促甲狀腺激素（Thyroid-stimulating hormone，TSH）（批號(hào)：EK-R37067）、TPOAb（批號(hào)：EK-R37527）、TGAb（批號(hào)：EK-R37664）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17ELISA試劑盒（批號(hào)：EK-R36872）、IL-10 ELISA試劑盒（批號(hào)：EK-R36786）均購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司；大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒（武漢賽奧斯生物科技有限公司，批號(hào)：MED-1019）；流式抗體Rat-APC-IL-17（批號(hào)：73812-80-50）、Rat-FITC-CD4（批號(hào)：11-0040-85）、Rat-PEFoxp3（批號(hào)：61-5773-82）均購(gòu)自北京孚博生物科技有限公司；兔源一抗叉頭框蛋白P3（Forkhead Box Protein P3，F(xiàn)oxp3）（批號(hào)：ab215206）、Notch1（批號(hào)：ab167441）、GAPDH（批號(hào)：ab8245）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)：ab6721）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；維甲酸相關(guān)孤核受體γt（retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt）（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：K24419-OBS）。

1.3 主要儀器 iMark型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；BD FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；CX53型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DYCZ24DN型蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.4 分組與造模 按照隨機(jī)數(shù)字表法將84只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（NC組）、模型組（Model組）、低劑量HXXYF組（HXXYFL組）、高劑量HXXYF組（HXXYF-H組）、左旋甲狀腺素鈉組（LTSD組）、Jagged1（Notch激活劑）組、HXXYF-H+Jagged1組，每組12只。除NC組外，其他組大鼠均構(gòu)建HT模型，在第1周時(shí)向大鼠足墊處注射0.2 mL弗氏完全佐劑乳化的豬甲狀腺球蛋白（4 mg/mL），2次/周以進(jìn)行初次免疫，并在第2周和第4周分別一次性注射等劑量的不完全弗氏佐劑乳化的豬甲狀腺球蛋白加強(qiáng)免疫[8]。根據(jù)TPOAb、TGAb水平變化確定造模是否成功[9]。全部造模成功后，進(jìn)行給藥處理。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 NC組大鼠飲用雙蒸水，其他組大鼠均飲用0.05%碘化鈉溶液直至造模結(jié)束。除NC組外，其他組大鼠均參照“1.4”所述方法構(gòu)建HT模型，建模結(jié)束后，進(jìn)行給藥處理，HXXYF-L組、HXXYF-H組[10]、LTSD組[7]大鼠分別灌胃給予0.5g/kg HXXYF、2 g/kg HXXYF、0.1 mg/kg LTSD，且均腹腔注射等體積的生理鹽水；Jagged1組[11]大鼠腹腔注射0.67 mg/kg Jagged1，且灌胃給予等體積的生理鹽水；HXXYF-H+Jagged1組大鼠灌胃給予2 g/kg HXXYF且腹腔注射0.67 mg/kg Jagged1；NC組、Model組大鼠均灌胃給予等體積的生理鹽水且腹腔注射等體積的生理鹽水。給藥1次/d，持續(xù)4周。

1.6 觀察指標(biāo) 末次處理24 h后，收集各組大鼠3 mL血液，經(jīng)離心得血清，用于FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb、IL-17、IL-10水平的檢測(cè)；收集各組大鼠2mL外周血用于Treg、Th17比例的檢測(cè)。血液收集完畢后，麻醉并處死大鼠，收集大鼠甲狀腺組織，分為兩部分，每部分包含每組6只大鼠甲狀腺組織，一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE染色，另一部分凍存于-80 ℃冰箱用于Western blotting實(shí)驗(yàn)。

1.6.1 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb、IL-17、IL-10水平 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清中FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb、IL-17、IL-10水平。

1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組大鼠外周血中Treg、Th17比例 利用大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒分離外周血單核細(xì)胞，且調(diào)整單核細(xì)胞密度為106個(gè)/mL。將50 μL單核細(xì)胞懸液加入流式管中，加入Rat-PE-Foxp3、Rat-FITC-CD4抗體來(lái)標(biāo)記Treg細(xì)胞，在室溫下避光孵育30 min，經(jīng)洗滌、離心、重懸后，利用流式細(xì)胞儀分析Treg比例；將50 μL單核細(xì)胞懸液加入流式管中，并向流式管中加入Rat-APC-IL-17、Rat-FITC-CD4抗體來(lái)標(biāo)記Th17細(xì)胞，在室溫下避光孵育30 min，經(jīng)洗滌、離心、重懸后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17比例。

1.6.3 HE染色檢測(cè)大鼠甲狀腺組織病理變化 將固定于4%多聚甲醛中的甲狀腺組織包埋在石蠟中，經(jīng)脫蠟、水化后，切成4 μm厚的切片，將切片用HE染色后，利用顯微鏡觀察切片病理變化。

1.6.4 Western blotting法檢測(cè)甲狀腺組織中Foxp3、RORγt、Notch1蛋白表達(dá) 在RIPA裂解緩沖液中裂解并提取甲狀腺組織勻漿總蛋白，將蛋白質(zhì)進(jìn)行定量、電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，將膜用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與一抗Foxp3（1∶2 000）、RORγt（1∶2 000）、Notch1（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后與HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗在常溫下孵育1 h，加入ECL試劑可視化蛋白，使用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶光密度進(jìn)行量化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，使用單因素方差分析進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)比較，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HXXYF對(duì)各組大鼠甲狀腺功能的影響 與NC組比較，Model組大鼠血清中FT3、FT4水平降低（P＜0.05），TSH水平升高（P＜0.05）；與Model組比較，HXXYF-L組、HXXYF-H組、LTSD組大鼠血清中FT3、FT4水平升高（P＜0.05），TSH水平降低（P＜0.05）；與Model組比較，Jagged1組大鼠血清中FT3、FT4水平降低（P＜0.05），TSH水平升高（P＜0.05）；與HXXYF-H組比較，HXXYFH+Jagged1組大鼠血清中FT3、FT4水平降低（P＜0.05），TSH水平升高（P＜0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠血清中FT3、FT4、TSH 水平比較 （）

表1 各組大鼠血清中FT3、FT4、TSH 水平比較 （）

注：與NC組比較，aP＜0.05；與Model組比較，bP＜0.05；與HXXYF-L組比較，cP＜0.05；與HXXYF-H組比較，dP＜0.05。

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2.2 HXXYF對(duì)各組大鼠甲狀腺抗體分泌及炎性因子分泌的影響 與NC組比較，Model組大鼠血清中TPOAb、TGAb、IL-17水平升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）；與Model組比較，HXXYF-L 組、HXXYF-H 組、LTSD 組大鼠血清中TPOAb、TGAb、IL-17水平降低（P＜0.05），IL-10水平升高（P＜0.05）；與Model組比較，Jagged1組大鼠血清中TPOAb、TGAb、IL-17水平升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）；與HXXYF-H組比較，HXXYF-H+Jagged1組大鼠血清中TPOAb、TGAb、IL-17水平升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠血清中TPOAb、TGAb、IL-17、IL-10水平比較 （）

表2 各組大鼠血清中TPOAb、TGAb、IL-17、IL-10水平比較 （）

注：與NC組比較，aP＜0.05；與Model組比較，bP＜0.05；與HXXYF-L組比較，cP＜0.05；與HXXYF-H組比較，dP＜0.05。

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2.3 HXXYF對(duì)各組大鼠外周血中Treg、Th17比例的影響 與NC組比較，Model組大鼠外周血中Treg比例降低（P＜0.05），Th17比例升高（P＜0.05）；與Model組比較，HXXYF-L組、HXXYF-H組、LTSD組大鼠外周血中Treg比例均升高（P＜0.05），Th17比例均降低（P＜0.05）；與Model組比較，Jagged1組大鼠外周血中Treg比例降低（P＜0.05），Th17比例升高（P＜0.05）；與HXXYF-H組比較，HXXYF-H+Jagged1組大鼠外周血中Treg比例降低（P＜0.05），Th17比例升高（P＜0.05）。（見(jiàn)圖1、表3）

圖1 各組大鼠外周血中Treg、Th17 流式圖

表3 各組大鼠外周血中Treg、Th17比例比較 （）

表3 各組大鼠外周血中Treg、Th17比例比較 （）

注：與NC組比較，aP＜0.05；與Model組比較，bP＜0.05；與HXXYF-L組比較，cP＜0.05；與HXXYF-H組比較，dP＜0.05。

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2.4 HXXYF對(duì)各組大鼠甲狀腺組織病理變化的影響 NC組大鼠甲狀腺濾泡完整且分布均勻，甲狀腺組織中幾乎沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Model組大鼠甲狀腺濾泡紊亂，甲狀腺濾泡周圍可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與Model組比較，HXXYF-L組、HXXYF-H組、LTSD組大鼠甲狀腺組織病理?yè)p傷減輕；與Model組比較，Jagged1組大鼠甲狀腺組織病理?yè)p傷更為嚴(yán)重；與HXXYF-H組比較，HXXYF-H+Jagged1組大鼠甲狀腺組織病理?yè)p傷加重。（見(jiàn)圖2）

圖2 各組大鼠甲狀腺組織病理切片圖 （HE，×200）

2.5 HXXYF對(duì)各組大鼠甲狀腺組織中Foxp3、RORγt、Notch1蛋白表達(dá)的影響 與NC組比較，Model組大鼠甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），RORγt、Notch1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與Model組比較，HXXYF-L組、HXXYF-H組、LTSD組大鼠甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），RORγt、Notch1蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）；與Model組比較，Jagged1組大鼠甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），RORγt、Notch1蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；與HXXYF-H組比較，HXXYF-H+Jagged1組大鼠甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），RORγt、Notch1蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。（見(jiàn)圖3、表4）

圖3 各組大鼠甲狀腺組織中Foxp3、RORγt、Notch1蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表4 各組大鼠甲狀腺組織中Foxp3、RORγt、Notch1 蛋白表達(dá)比較 （）

表4 各組大鼠甲狀腺組織中Foxp3、RORγt、Notch1 蛋白表達(dá)比較 （）

注：與NC組比較，aP＜0.05；與Model組比較，bP＜0.05；與HXXYF-L組比較，cP＜0.05；與HXXYF-H組比較，dP＜0.05。

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3 討論

HT是最常見(jiàn)的自身免疫性甲狀腺疾病，目前尚無(wú)有效的預(yù)防和治療方法。HT通?？梢酝ㄟ^(guò)左旋甲狀腺素治療，其可減少甲狀腺體積并補(bǔ)充激素的不足。盡管進(jìn)行了甲狀腺激素替代治療，一些HT患者仍會(huì)持續(xù)出現(xiàn)降低生活質(zhì)量的癥狀[12]。甲狀腺抗體TPOAb和TGAb被認(rèn)為是預(yù)測(cè)HT和甲狀腺功能減退癥發(fā)展的最可靠的預(yù)后因素[13]。本研究顯示，與NC組比較，Model組大鼠血清中TPOAb、TGAb水平均升高，提示HT大鼠模型構(gòu)建成功。TSH是一種可參與調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞增殖及甲狀腺激素合成的激素。研究[14]表明，F(xiàn)T3、FT4、TSH是評(píng)估甲狀腺功能的有效指標(biāo)。本研究顯示，與NC組比較，Model組大鼠血清中FT3、FT4水平降低，TSH水平升高，表明HT大鼠甲狀腺功能異常；此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠甲狀腺組織病理?yè)p傷程度明顯高于NC組，表明HT大鼠甲狀腺病理?yè)p傷嚴(yán)重，提示HT大鼠甲狀腺功能及病理形態(tài)異常。

HXXYF是由王不留行、柴胡、莪術(shù)、桃仁、土鱉蟲(chóng)、蜣螂蟲(chóng)、貓爪草、蜈蚣等中藥組成的中藥復(fù)方制劑。已有研究[15]報(bào)道，HXXYF治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫具有一定的優(yōu)勢(shì)。HXXYF治療HT具有較好的臨床療效,且能明顯降低患者血清中炎癥因子水平[16]。而關(guān)于HXXYF對(duì)HT大鼠甲狀腺功能及病理形態(tài)的影響尚不明確。本研究顯示，HXXYF可改善HT大鼠甲狀腺功能及病理形態(tài)，且HXXYF劑量越高，改善作用越明顯。而HXXYF-H組與LTSD組比較，其對(duì)HT大鼠甲狀腺功能及病理形態(tài)的改善作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示HXXYF可能成為治療HT的潛在有效藥物。

Notch信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞因子的水平來(lái)介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，從而參與多種自身免疫性疾病[17]。以Foxp3為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的Treg是一種具有獨(dú)特功能的CD4+T細(xì)胞亞群，Treg主要分泌IL-10，Treg數(shù)量的減少或功能障礙導(dǎo)致免疫系統(tǒng)不能對(duì)自身抗原的刺激產(chǎn)生良好的免疫耐受性，從而導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生[18-19]。以RORγt為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的Th17主要分泌IL-17，其主要功能是聚集炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞，引起細(xì)胞浸潤(rùn)和組織破壞[20]。在正常情況下，Treg和Th17處于免疫平衡狀態(tài)。然而，當(dāng)Treg的數(shù)量不足或其功能有缺陷時(shí)，它們的免疫抑制能力下降，導(dǎo)致Th17過(guò)度增殖，這可引起多種自身免疫性疾病。本研究顯示，與NC組比較，Model組Treg比例、Foxp3蛋白表達(dá)、IL-10水平降低，Th17比例、RORγt蛋白表達(dá)、IL-17水平升高，表明Treg/Th17細(xì)胞軸的免疫失衡參與了HT的發(fā)展。此外，與Model組比較，Jagged1組大鼠甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達(dá)降低，RORγt、Notch1蛋白表達(dá)升高，證實(shí)Notch/Treg/Th17通路確實(shí)參與了HT過(guò)程中的甲狀腺功能及病理形態(tài)異常。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)HXXYF可上調(diào)甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達(dá)，下調(diào)RORγt、Notch1蛋白表達(dá)，且HXXYF劑量越高，對(duì)應(yīng)的作用越明顯。推測(cè)HXXYF可能通過(guò)抑制Notch通路來(lái)調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡進(jìn)而改善HT大鼠甲狀腺功能和病理形態(tài)。為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究在高劑量HXXYF作用的基礎(chǔ)上再加上Notch激活劑Jagged1來(lái)干預(yù)HT大鼠，結(jié)果顯示，Jagged1減弱了高劑量HXXYF對(duì)HT大鼠甲狀腺功能和病理形態(tài)的改善作用，這證實(shí)了猜想是正確的。

綜上所述，HXXYF可能通過(guò)抑制Notch通路來(lái)調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡，進(jìn)而改善HT大鼠甲狀腺功能和病理形態(tài)。HXXYF可能成為治療HT的潛在有效藥物。