高 娃，包斯琴，王青亮，都格爾，錫林其其格，烏漢其木格,

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)藥研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065）

蒙藥額爾敦-烏日勒，又名“桑培奴布日布”[1]、欽達(dá)穆尼組方[2]、珍寶丸[3]等，由制珍珠、沉香、訶子、紅花等29味蒙藥材組成[4]。其可改善血液濃度，疏通經(jīng)絡(luò)，修復(fù)陳舊組織的神經(jīng)血管損傷[5]，具有清熱安神、舒筋活絡(luò)、去黃水、化痰活血、醒腦開(kāi)竅、消瘀止痛、扶正固本之功效[6-7]。額爾敦-烏日勒是蒙醫(yī)治療白脈病、腦出血、腦血栓、神經(jīng)損傷、神經(jīng)根炎等疾病的首選藥物[8-9]，在臨床上應(yīng)用廣泛。如額爾敦-烏日勒與奧拉西坦聯(lián)合治療血管性癡呆效果顯著[10]；額爾敦-烏日勒結(jié)合西醫(yī)治療老年2型糖尿病合并高血壓有明顯療效[11-12]；額爾敦-烏日勒在腦出血治療中有顯著的增益作用[13-15]，可促進(jìn)微血管增生，保護(hù)和改善受損神經(jīng)功能，改善腦缺血及腦梗死[16-18]；額爾敦-烏日勒還可有效預(yù)防和治療神經(jīng)源炎性痛敏性偏頭痛[19]，但有關(guān)其活性成分和作用機(jī)理研究相當(dāng)缺乏。已報(bào)道的神經(jīng)保護(hù)活性成分有紅花、肉豆蔻、甘草、草果、川楝子、梔子、土木香、木香、蓽茇和黑種草所含16種小分子化合物[20]，但其作用機(jī)理尚不明確。揭示其藥效作用機(jī)理，明確其入血成分是首要條件。

本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）鑒定額爾敦-烏日勒大鼠灌胃給藥后的入血成分，并分析差異代謝物及相關(guān)通路，旨在為明確額爾敦-烏日勒的活性成分及作用機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠6只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。大鼠購(gòu)回后，第一時(shí)間按雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房。飼養(yǎng)條件：室溫（23±3）℃，相對(duì)濕度為40%～60%，明暗周期12 h，大鼠自由攝取動(dòng)物飼料和飲用純凈水，隔1 d換清潔級(jí)墊料。本研究所有程序都是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)原則下進(jìn)行的，并得到內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2022-004）。

1.2 藥物與試劑 額爾敦-烏日勒（批號(hào)：20190828，規(guī)格：60丸/盒）由內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院國(guó)家蒙藥制劑中心提供；LC-MS級(jí)甲醇（批號(hào)：A456-4）、LC-MS級(jí)甲酸（批號(hào)：A117-50）、色譜級(jí)醋酸銨（批號(hào)：A114-50）均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；LC-MS級(jí)水（批號(hào)：1.15333.2500）購(gòu)于美國(guó)Merck公司。

1.3 主要儀器 Q ExactiveTMHF質(zhì)譜儀（德國(guó)賽默飛世爾公司）；Vanquish UHPLC色譜儀（德國(guó)賽默飛世爾公司）；Hypesil Gold column色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）（德國(guó)賽默飛世爾公司）；D3024R低溫離心機(jī)（美國(guó)賽洛捷克公司）。

2 方法

2.1 分組和給藥 將6只SD大鼠隨機(jī)分為空白組（KB）和給藥組（ED），每組3只。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)14 d后禁食、不禁水12 h，給藥組大鼠按0.54 g/kg劑量灌胃給予額爾敦-烏日勒，空白組大鼠灌胃生理鹽水，灌胃體積均為1 mL/100 g。給藥90 min后腹主動(dòng)脈采血，血液收集在普通采血管中，于室溫靜置1 h進(jìn)行凝固分層，于室溫下1 610×g離心10 min，取上清液分裝到1.5 mL離心管中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 樣本處理 取100 μL血清樣本置于離心管中，加入400 μL質(zhì)譜級(jí)甲醇，渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，于4 ℃條件下15 000×g，離心10 min，取一定量的上清液加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中再次于4 ℃條件下，以15 000×g，離心10 min，收集上清液，進(jìn)行LC-MS分析。

2.3 儀器參數(shù)

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Hyperil Gold column（C18）（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；正模式：流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為甲醇；負(fù)模式：流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨，流動(dòng)相B為甲醇[21]。色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

2.3.2 質(zhì)譜條件 掃描范圍選擇（m/z）100～1 500；ESI源的設(shè)置如下：噴霧電壓為3 200 V；鞘氣流速為40 arb；輔助氣流速為10 arb；離子傳輸管溫度為320 ℃。極性為正極、負(fù)極；MS/MS二級(jí)掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描。

2.4 數(shù)據(jù)處理 將LC-MS原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer3.1（CD3.1,Thermo Fisher）搜庫(kù)軟件中，進(jìn)行保留時(shí)間、質(zhì)荷比等參數(shù)的簡(jiǎn)單篩選，然后對(duì)不同樣品根據(jù)保留時(shí)間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 ppm進(jìn)行峰對(duì)齊，使鑒定更準(zhǔn)確，隨后根據(jù)設(shè)置的質(zhì)量偏差為5 ppm、信號(hào)強(qiáng)度偏差為30%、信噪比為3、最小信號(hào)強(qiáng)度為100 000、加合離子等信息進(jìn)行峰提取，同時(shí)對(duì)峰面積進(jìn)行定量，再整合目標(biāo)離子，然后通過(guò)分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)并與mzCloud、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，用blank樣本去除背景離子，并對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化，最后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結(jié)果。通過(guò)人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（human metabolome database，HMDB）和脂質(zhì)代謝途徑研究計(jì)劃（Lipid metabolites and pathways strategy，LIPID MAPS）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分類注釋分析。差異代謝產(chǎn)物篩選基于給藥組與空白組比較，以P＜0.05，且log2FC＞0（log2FC＞0為上調(diào)、log2FC＜0為下調(diào)）為篩選條件納入差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝產(chǎn)物。相關(guān)差異代謝通路圖通過(guò)京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進(jìn)行搜索和分析。代謝途徑分析使用MetaboAnalyst 5.0。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制 為了對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，取所有大鼠個(gè)體的血清樣品少量，等體積混合均勻后制得質(zhì)控（quality control，QC）樣本，用于平衡LC-MS系統(tǒng)和監(jiān)測(cè)儀器狀態(tài)。通過(guò)QC樣品的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性評(píng)估儀器狀態(tài)，方法及數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)果正、負(fù)離子模式下的R2均大于0.98接近于1，說(shuō)明數(shù)據(jù)具有良好的可靠性。（見(jiàn)圖1）

圖1 QC 樣本相關(guān)性分析

3.2 小分子化合物的非靶向分析 對(duì)空白組與給藥組血液成分分別在Compound Discoverer 3.1進(jìn)行分子式預(yù)測(cè)并對(duì)mzCloud、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫(kù)同時(shí)進(jìn)行搜庫(kù)，鑒定到777個(gè)小分子化合物。在正離子模式下，給藥組與空白組大鼠血清中共檢測(cè)到491小分子化合物；在負(fù)離子模式下，給藥組與空白組血清中共檢測(cè)到286個(gè)小分子化合物。將上述777個(gè)小分子化合物在HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，共發(fā)現(xiàn)297個(gè)小分子化合物，其中正離子模式下178個(gè)、負(fù)離子模式下119個(gè)。可見(jiàn)正負(fù)離子模式下，脂類及非脂類化合物最多。（見(jiàn)圖2）

圖2 HMDB 分類注釋統(tǒng)計(jì)圖

基于LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫(kù)共鑒定出186個(gè)小分子化合物，其中正離子模式下鑒定出78個(gè)小分子化合物，負(fù)離子模式下鑒定出108個(gè)小分子化合物。在HMDB和LIPID MAPS兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中同時(shí)鑒定到的有73個(gè)小分子化合物，其中正離子模式下有37個(gè)，負(fù)離子模式下有36個(gè)，可見(jiàn)甘油磷酰膽堿化合物最多。（見(jiàn)圖3）

圖3 LIPID MAPS 分類注釋統(tǒng)計(jì)圖

3.3 差異代謝產(chǎn)物的分析 相對(duì)含量分析結(jié)果顯示，給藥組與空白組大鼠血清有67個(gè)代謝物具有明顯差異，即給藥組有55個(gè)代謝物上調(diào)，12個(gè)代謝物下調(diào)。（見(jiàn)表2）由圖4可知，上述67個(gè)差異代謝物中大部分化合物的相對(duì)含量升高，少數(shù)化合物的相對(duì)含量降低，差異明顯。（見(jiàn)圖4）

圖4 給藥組與空白組大鼠差異代謝物熱圖

表2 給藥組與空白組大鼠血清差異代謝物（排名前10）

3.4 差異代謝物通路分析 對(duì)額爾敦-烏日勒給藥組和空白組篩選的67個(gè)差異代謝物進(jìn)行進(jìn)一步的KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物共參與11條通路，分別是核黃素代謝（Riboflavin metabolism）、甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）、甾類激素生物合成代謝（Steroid hormone biosynthesis）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、視黃醇的代謝（Retinol metabolism）、檸檬酸循環(huán)代謝（Citrate cycle，TCA cycle）、藥物代謝-細(xì)胞色素P450（Drug metabolismcytochrome P450）、乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝（Glycine, serine and threonine metabolism）、不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism），其中富集最多的是核黃素代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素生物合成代謝、檸檬酸循環(huán)代謝、乙醛酸和二羧酸代謝。（見(jiàn)圖5）

圖5 給藥組與空白組大鼠差異代謝物KEGG 通路富集圖

3.5 額爾敦-烏日勒入血成分的分析 通過(guò)對(duì)空白組與給藥組血液成分進(jìn)行單獨(dú)搜庫(kù)分析對(duì)比，結(jié)果顯示給藥組血清中鑒定出入血成分共237個(gè)小分子化合物，正離子模式下152個(gè)，負(fù)離子模式下85個(gè)。其中，51個(gè)是額爾敦-烏日勒原型成分（展示20個(gè)成分），如肉豆蔻酸、牛黃熊去氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、雄酮、沒(méi)食子酸酯、甘草次酸等，其余186個(gè)是額爾敦-烏日勒復(fù)方中沉香、牛黃、麝香、丁香、甘草等單藥所含成分產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。（見(jiàn)圖6、表3）

圖6 給藥組大鼠血清中檢測(cè)到的小分子化合物分類

表3 額爾敦-烏日勒入血原型成分

4 討論

蒙藥額爾敦-烏日勒是預(yù)防和治療心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用藥物，并具有神經(jīng)保護(hù)作用，療效顯著。目前，關(guān)于額爾敦-烏日勒的有效成分、作用機(jī)制及入血成分仍不明確。本研究基于LC-MS非靶向代謝組學(xué)方法分析了額爾敦-烏日勒入血成分及潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)額爾敦-烏日勒給藥后可對(duì)多個(gè)代謝通路進(jìn)行干預(yù)和調(diào)整，如核黃素、膽堿、乙酰膽堿、睪酮等對(duì)機(jī)體有益的差異代謝物含量升高，給藥后的差異代謝物主要富集于核黃素代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素生物合成代謝、檸檬酸循環(huán)代謝和乙醛酸和二羧酸代謝等代謝通路。

核黃素又稱維生素B2，是體內(nèi)黃酶類輔基的重要組成部分[22]。核黃素因其抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌等特性而被廣泛研究[23]。有研究表明，核黃素可以預(yù)防偏頭痛，減輕局灶性腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用[24-26]。此外，核黃素與其他化合物或藥物的組合可以具有多種作用和保護(hù)特性，并在治療中可以減少藥物的毒性作用[23]。本研究結(jié)果表明額爾敦-烏日勒對(duì)體內(nèi)核黃素代謝具有一定的調(diào)節(jié)作用。而這一作用可能與其神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)。

其次是甘油磷脂代謝，該代謝的紊亂可引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆的損傷。膽堿和乙酰膽堿是甘油磷脂代謝的2個(gè)內(nèi)源性化合物。人的腦組織有大量乙酰膽堿，這是一種重要的中樞膽堿神經(jīng)遞質(zhì)，能維持膽堿能系統(tǒng)正常運(yùn)行和長(zhǎng)期記憶的生理基礎(chǔ)，起著神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的作用[27]。但乙酰膽堿的含量會(huì)隨著人年齡的增長(zhǎng)而下降。膽堿是合成乙酰膽堿的前體之一。有研究報(bào)道，提高神經(jīng)突觸間隙的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水平，能夠增強(qiáng)神經(jīng)突觸傳遞效果，改善阿爾茨海默病患者的認(rèn)知障礙[28-29]。

此外，甾體激素，雄激素和雌激素對(duì)認(rèn)知功能具有重要的影響，可促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能，并降低淀粉樣蛋白在人腦的聚集，可調(diào)節(jié)海馬未成熟神經(jīng)元的數(shù)量及海馬棘突觸密度，對(duì)腦功能具有保護(hù)作用[29-30]。檸檬酸循環(huán)是糖類、脂肪、蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝和能量代謝的樞紐，乙醛酸和二羧酸代謝可看作檸檬酸循環(huán)的支路和中間產(chǎn)物的補(bǔ)給途徑[31-32]。這些途徑直接或間接參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)和能量代謝等調(diào)節(jié)。可見(jiàn)額爾敦-烏日勒可對(duì)多個(gè)代謝通路同時(shí)參與和調(diào)節(jié)，在多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮藥效。本研究結(jié)果表明，額爾敦-烏日勒可能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝物的平衡，發(fā)揮調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化還原平衡及能量代謝的作用。

5 結(jié)論

本研究采用LC-MS非靶向代謝組學(xué)方法在額爾敦-烏日勒給藥血清中共鑒定出777個(gè)小分子化合物，67個(gè)差異代謝物。差異代謝物主要富集在核黃素代謝、檸檬酸循環(huán)代謝、甘油磷脂代謝等11個(gè)相關(guān)代謝通路。同時(shí)，額爾敦-烏日勒的入血成分有237個(gè)，其中代謝產(chǎn)物有186個(gè)、入血原型成分有51個(gè)。結(jié)果可為蒙藥額爾敦-烏日勒的質(zhì)量控制、潛在活性成分的篩選及作用機(jī)理的研究提供重要依據(jù)。