王蒙蒙，崔敬愛(ài)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

蹄葉橐吾[Ligularia fischeri（Ledeb.）Turcz.]為橐吾屬多年生草本植物，又名腎葉橐吾、馬蹄葉[1]，廣泛生長(zhǎng)于吉林省延邊朝鮮族自治州，根部肥厚呈肉質(zhì)，具有止咳祛痰、理氣活血之效[2]，葉片呈腎形，可做野菜或包飯食用，深受人們喜愛(ài)。研究表明，蹄葉橐吾中含有豐富的揮發(fā)油、微量元素、多酚類物質(zhì)以及蹄葉橐吾特有的蹄橐內(nèi)酯、橐吾烯酮等物質(zhì)[3-4]，兼具食用與藥用價(jià)值。

黃酮是植物中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗氧化[5]、降糖、降脂[6]、抗炎、消瘤[7-8]等多種生理活性作用，一直備受人們關(guān)注。據(jù)報(bào)道，黃酮的提取方法有浸提法、酶解法、超聲波或微波輔助制備、超臨界流體萃取法等[9-11]，然而目前關(guān)于蹄葉橐吾黃酮的提取工藝少有報(bào)道。超聲波輔助提取的原理是利用超聲波輻射壓力產(chǎn)生多種作用力共同作用于待提取物，從而使目標(biāo)成分快速且充分地進(jìn)入溶劑，提高提取效率。酶解法具有高效、安全和專一的優(yōu)點(diǎn)，且操作條件溫和，對(duì)目標(biāo)成分無(wú)破壞性影響。近年來(lái)，研究人員常將兩種方法相結(jié)合，以進(jìn)一步提高目標(biāo)物得率[12-13]。

本試驗(yàn)以蹄葉橐吾葉片為原材料，采用超聲波輔助纖維素酶提取黃酮，以單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳提取工藝，并測(cè)定其體外抗氧化活性，為蹄葉橐吾的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蹄葉橐吾：市售；纖維素酶（200 U/mg）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、二氫槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇、三水醋酸鈉（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；三氯化鋁（分析純）：美國(guó)Sigma-aldrich 公司；冰醋酸（分析純）：美國(guó)Aladdin 公司；活性炭（優(yōu)級(jí)純）：興華炭業(yè)科技南京有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

萬(wàn)能粉碎機(jī)（FDV）：佑崎有限公司；紫外分光光度計(jì)（T6 新世紀(jì)）：北京普析儀器有限公司；恒溫水浴鍋（DK-98-ⅡA）：天津市泰斯特儀器有限公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY88-Ⅱ）：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

1.3.1.1 0.1 mol/L AlCl3溶液制備

稱取1.33 g AlCl3溶于100 mL 70%乙醇溶液中。

1.3.1.2 醋酸鹽緩沖溶液制備

甲液：2.72 g CH3COONa·3H2O 溶于100 mL 蒸餾水；乙液：1.15 mL CH3COOH 溶于100 mL 蒸餾水；將39.5 mL 甲液與10.5 mL 乙液混合，加入50 mL 蒸餾水，制成pH5.2 的緩沖溶液。

1.3.1.3 磷酸鹽緩沖溶液制備

A 液：7.16 g Na2HPO4溶于100 mL 蒸餾水；B 液：3.12 g NaH2PO4溶于100 mL 蒸餾水；取38 mL A 液與62 mL B 液混合，得到pH6.6 的緩沖溶液。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考楊雅欣等[14]的試驗(yàn)方法并進(jìn)行改進(jìn)，配制0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 于錐形瓶中，采用AlCl3法[15]進(jìn)行顯色，418 nm 處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 蹄葉橐吾黃酮得率的測(cè)定

蹄葉橐吾葉片置于50 ℃烘箱中，干燥后使用萬(wàn)能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)80 目篩，收集后密封干燥保存，備用。

精確稱取2 g 橐吾粉末于50 mL 錐形瓶中，加入纖維素酶，混勻，按照一定的料液比添加70%乙醇溶液，進(jìn)行酶解與超聲處理。收集提取液，3 000 r/min 離心10 min，留取上清液。取1 mL 上清液，顯色后在波長(zhǎng)418 nm 處檢測(cè)吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算黃酮的濃度，根據(jù)下列公式計(jì)算黃酮得率。

式中：A 為黃酮得率，%；C 為橐吾提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；M 為蹄葉橐吾的質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 纖維素酶添加量

纖維素酶酶活經(jīng)前期試驗(yàn)驗(yàn)證與試劑廠家所標(biāo)規(guī)格一致，因此可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取2 g 蹄葉橐吾粉末于50 mL 錐形瓶中，以張麗靜等[16]的方法為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)，30 ℃水浴酶解30 min，按料液比1∶25（g/mL）加入70%乙醇，在功率130 W 下超聲30 min，設(shè)置纖維素酶添加量為40、80、120、160、200 mg，考察不同纖維素酶添加量對(duì)蹄葉橐吾黃酮得率的影響。

1.3.4.2 酶解溫度

基于1.3.4.1 試驗(yàn)結(jié)果，選取纖維素酶添加量的最佳水平，設(shè)定酶解時(shí)間30 min，料液比為1∶25（g/mL），超聲功率130 W 下超聲30 min，設(shè)置酶解溫度為30、40、50、60、70 ℃，考察酶解溫度對(duì)蹄葉橐吾黃酮得率的影響。

1.3.4.3 酶解時(shí)間

基于上述試驗(yàn)結(jié)果，選取纖維素酶添加量和酶解溫度的最佳水平，設(shè)定料液比為1∶25（g/mL），超聲功率130 W 下超聲30 min，設(shè)置酶解時(shí)間為30、40、50、60、70 min，考察酶解時(shí)間對(duì)FLF 得率的影響。

1.3.4.4 料液比

選取纖維素酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間的最佳水平，設(shè)定提取時(shí)間30 min，超聲功率130 W，設(shè)置料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），考察不同料液比對(duì)FLF 得率的影響。

1.3.4.5 提取時(shí)間

選取纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間和料液比的最佳水平，超聲功率固定為130 W，設(shè)置提取時(shí)間為30、45、60、75、90 min，考察不同提取時(shí)間對(duì)FLF得率的影響。

1.3.4.6 超聲功率

選取纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比和提取時(shí)間的最佳水平，設(shè)置超聲功率為130、160、190、220、250 W，考察超聲功率對(duì)FLF 得率的影響。

1.3.5 Plackett-Burman 試驗(yàn)

影響FLF 得率的因素較多，但各因素對(duì)其影響程度不同。因此，為最大效率優(yōu)化提取工藝，通過(guò)Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出對(duì)黃酮得率影響顯著的重要因子，作為后續(xù)提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)的影響因子，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

基于1.3.4 與1.3.5 的試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)FLF 得率影響較大的顯著因子的較優(yōu)水平，設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)方案，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of Box-Behnken

1.3.7 蹄葉橐吾黃酮成分鑒定

根據(jù)1.3.6 的優(yōu)化結(jié)果提取FLF，收集提取液，以D101 大孔樹(shù)脂純化，冷凍干燥后得到FLF 純提物，保存?zhèn)溆?。使用蘆丁、槲皮素、二氫槲皮素、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚、兒茶素、表兒茶素、木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品制作混合標(biāo)準(zhǔn)液，并以此為對(duì)照，使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 分析FLF 純提物中主要的黃酮成分。

參考張?jiān)返萚17]的方法，HPLC 條件為色譜柱：Waters C18 柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相為甲醇（A）、0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸溶液（B）。洗脫程序：0～10 min，10%～20%A；10～20 min，20%～50%A；20～30 min，50%～100%A；30～40 min，100%A；40～45 min，100%～10%A；45～55 min，10%A。

1.3.8 蹄葉橐吾黃酮抗氧化活性測(cè)定

1.3.8.1 還原能力測(cè)定

參考李東香等[18]的方法，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，分別配制不同濃度（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL）的VC溶液與FLF 溶液。分別取1 mL 待測(cè)溶液于試管中，加入2.5 mL 磷酸鹽緩沖液，混勻，加入2.5 mL 1%K3[Fe（CN）6]，50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min 離心10 min。取1 mL 上清液，加入0.5 mL FeCl3后，加5 mL 蒸餾水，搖勻，700 nm處測(cè)吸光度。

1.3.8.2 DPPH·清除能力的測(cè)定

待測(cè)溶液與1.3.8.1 相同，參照J(rèn)o 等[19]和金偉嘉等[20]的方法，以無(wú)水乙醇溶解1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）配制0.2 mmol/L DPPH溶液。取3 mL 待測(cè)溶液與同體積DPPH 溶液混合，搖勻，避光孵育30 min，于517 nm 處測(cè)定吸光度，DPPH·清除率（X1，%）計(jì)算公式如下。

式中：A0為DPPH 溶液的吸光度；A1為加入待測(cè)液后的吸光度。

1.3.8.3 ABTS+·清除能力的測(cè)定

待測(cè)溶液與1.3.8.1 相同，依照Wang 等[21]和何蘭香等[22]的方法，稱取192 mg 溶于50 mL 蒸餾水中，66.2 mg K2S2O8溶于100 mL 蒸餾水，兩者取相同體積，混勻，避光孵育12 h，得到母液。以無(wú)水乙醇按1∶50（體積比）稀釋母液，得到工作液。取200 μL 待測(cè)液與4 mL 工作液混合，室溫靜置6 min，于734 nm 處測(cè)定吸光度，ABTS+·清除率（X2，%）計(jì)算公式如下。

式中：A0為ABTS 溶液的吸光度；A1為加入待測(cè)液后的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 2018 軟件作圖，Minitab 17 軟件設(shè)計(jì)及分析Plackett-Burman 試驗(yàn)，Design Expert 12 軟件設(shè)計(jì)及分析響應(yīng)面試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在418 nm 處測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，建立蘆丁濃度和相應(yīng)吸光度的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1。線性方程為y=22.842x+0.010 2，R2=0.999 4。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 纖維素酶添加量對(duì)黃酮得率的影響

纖維素酶添加量對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 纖維素酶添加量對(duì)FLF 得率的影響Fig.2 Effect of cellulase enzyme quantity on FLF yield

由圖2 可知，隨著纖維素酶添加量的增加，黃酮得率呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。原因可能是酶量較少時(shí)，底物未被結(jié)合完全。酶量增多后，底物與酶充分作用，胞內(nèi)物質(zhì)溶出充分，黃酮得率也達(dá)到峰值。酶與底物結(jié)合完全，反應(yīng)速率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加酶量不利于質(zhì)量傳遞且造成物質(zhì)的浪費(fèi)，影響黃酮溶出，導(dǎo)致黃酮得率下降[23]。因此選擇纖維素酶添加量為120、200 mg 進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)。

2.2.2 酶解溫度對(duì)黃酮得率的影響

酶解溫度對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)FLF 得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on FLF

由圖3 可知，酶解溫度在30～50 ℃之間，黃酮得率與酶解溫度呈正相關(guān)關(guān)系。在此范圍內(nèi)，溫度升高增加了活化分子百分比，酶與底物的有效碰撞次數(shù)增多使得反應(yīng)速率增高。若繼續(xù)升高溫度，酶的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化，活性酶的濃度降低導(dǎo)致反應(yīng)速率下降[24]。因此選擇酶解溫度為40、60 ℃進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

酶解時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)FLF 得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on FLF yield

由圖4 可知，酶解時(shí)間為50 min 時(shí)黃酮得率達(dá)到最大值，而后逐漸下降。酶解時(shí)間較短導(dǎo)致酶解不充分，黃酮浸出率低；酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分目標(biāo)成分的結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，導(dǎo)致得率下降[25]。因此選擇酶解時(shí)間40、60 min 進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)。

2.2.4 料液比對(duì)黃酮得率的影響

料液比對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)FLF 得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on FLF yield

由圖5 可知，當(dāng)料液比為1∶25（g/mL）時(shí)，黃酮得率最大，為1.78%，表明溶劑體積增大，溶劑與目標(biāo)成分載體接觸更加充分，利于黃酮溶出；持續(xù)增加溶劑體積，底物與酶的濃度降低，導(dǎo)致酶解效率降低[26]。因此選擇料液比1∶20、1∶30（g/mL）進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)。

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)FLF 得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on FLF yield

如圖6 所示，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)LF 得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。提取時(shí)間較短無(wú)法完全破壞植物的細(xì)胞壁，黃酮溶出較困難。提取時(shí)間為75 min 時(shí)，黃酮得率達(dá)到峰值1.80%。提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波產(chǎn)生的各種作用力可能會(huì)對(duì)部分黃酮造成破壞[27]。因此選擇提取時(shí)間60、90 min 進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)。

2.2.6 超聲功率對(duì)黃酮得率的影響

超聲功率對(duì)黃酮得率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 超聲功率對(duì)FLF 得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on FLF yield

由圖7 可知，超聲功率逐漸增強(qiáng)，黃酮得率逐漸升高至峰值而后漸漸降低，表明過(guò)低的功率所產(chǎn)生超聲作用力較小，細(xì)胞壁破壞不完全，黃酮溶出率較低；超聲功率過(guò)高，過(guò)強(qiáng)的空化作用產(chǎn)生大量空泡，使得超聲波散射衰減增加，黃酮得率下降[28]。因此選擇超聲功率160、220 W 進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)。

2.3 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)各因素水平及響應(yīng)值Table 3 Levels of various factors and response results of Plackett-Burman

使用Minitab 17 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗(yàn)。根據(jù)多元回歸擬合結(jié)果，得到蹄葉橐吾黃酮得率（Y）與酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、纖維素酶添加量（C）、料液比（D）、提取時(shí)間（E）、超聲功率（F）的回歸方程為Y=0.964+0.000 75A+0.005 42B+1.854C-0.001 83D+0.004 72E+0.000 028F。

各因素的顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表4。

表4 各因素的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test of each factor

由表4 可知，模型回歸方程顯著（P<0.05），認(rèn)為此模型適于該試驗(yàn)進(jìn)行分析。B（酶解時(shí)間）、C（纖維素酶添加量）、E （提取時(shí)間） 對(duì)FLF 得率影響顯著（P<0.05），顯著程度依次為C>E>B，以這3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)。而A（酶解溫度）、D（料液比）、F（超聲功率）對(duì)FLF 得率影響不顯著，因此在后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)中將這3 個(gè)因素水平設(shè)定為單因素試驗(yàn)確定的最佳水平，即酶解溫度50 ℃、料液比1∶25（g/mL）、超聲功率190 W。

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，建立FLF 得率對(duì)自變量纖維素酶添加量（A'）、酶解時(shí)間（B'）和提取時(shí)間（C'）的二次多項(xiàng)回歸模型。

表5 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken response surface analysis

利用Design Expert 12 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，結(jié)果如表6 所示。FLF 得率（R）與纖維素酶添加量（A'）、酶解時(shí)間（B'）、提取時(shí)間（C'）的回歸方程為R=2.07+0.052 5A'-0.041 3B'+0.016 3C'+0.060 0A'B'+0.0200A'C'+0.0075B'C'-0.1357A'2-0.2232B'2-0.0733C'2。

表6 回歸方程方差分析結(jié)果Table 6 Variance analysis of regression equation

如表6 所示，模型回歸方程極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），因此認(rèn)為此模型適于該試驗(yàn)進(jìn)行分析。該模型確定系數(shù)R2=0.958 5，表明模型與實(shí)際擬合良好，可據(jù)此設(shè)計(jì)對(duì)FLF 的提取進(jìn)行優(yōu)化。由表6可知，A'（纖維素酶添加量）、B'（提取時(shí)間）、交互項(xiàng)A'B'和二次項(xiàng)C'2對(duì)蹄葉橐吾黃酮得率影響顯著（P＜0.05），C'（酶解時(shí)間）、交互項(xiàng)A'C'、B'C'對(duì)其影響不顯著；而A'2、B'2對(duì)其影響極顯著（P＜0.01）。各因素影響顯著程度為A'＞B'＞C'。

由回歸方程可知，纖維素酶添加量168.01 mg、酶解時(shí)間51.32 min、提取時(shí)間74.02 min 時(shí)，提取工藝得到最優(yōu)解，此時(shí)蹄葉橐吾黃酮得率為2.08%。將工藝參數(shù)修改為纖維素酶添加量168 mg、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間51 min、料液比1∶25（g/mL）、超聲功率190 W、提取時(shí)間74 min 后進(jìn)行試驗(yàn)，F(xiàn)LF 得率為2.05%，與理論值相對(duì)誤差為1.44%，所以認(rèn)為該優(yōu)化方案合理。僅以超聲波輔助法[料液比1∶25（g/mL）、超聲功率190 W、提取時(shí)間74 min]對(duì)FLF 進(jìn)行提取，F(xiàn)LF 得率為1.62%，為工藝優(yōu)化后FLF 得率的79.02%，因此，認(rèn)為該優(yōu)化方案有效提高了FLF 得率。

圖8～圖10 為兩因素交互作用的三維響應(yīng)圖，圖中曲面坡度越大說(shuō)明兩因素交互作用對(duì)FLF 的影響越顯著。

圖8 纖維素酶添加量和提取時(shí)間的交互作用效果圖Fig.8 Interaction effect of cellulase amount and extraction time

圖9 纖維素酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用效果圖Fig.9 Interaction effect of cellulase amount and enzymatic hydrolysis time

圖10 提取時(shí)間和酶解時(shí)間的交互作用效果圖Fig.10 Interaction effect of extraction time and enzymatic hydrolysis time

由圖8～圖10 可知，纖維素酶添加量與提取時(shí)間的交互作用對(duì)FLF 得率的影響最為顯著，而其他兩因素的交互作用對(duì)FLF 得率影響不顯著，與表6 中結(jié)果一致。

2.5 蹄葉橐吾黃酮成分鑒定

使用HPLC 對(duì)FLF 中黃酮成分進(jìn)行定性分析，結(jié)果見(jiàn)圖11 和圖12。

圖11 黃酮標(biāo)品的HPLC 圖譜Fig.11 HPLC chromatogram of flavonoid standard

圖12 FLF 的HPLC 圖譜Fig.12 HPLC chromatogram of FLF

由圖12 可知，F(xiàn)LF 中主要黃酮成分為金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、山奈酚，含量分別為33.86%、12.41%、8.03%、3.22%。

2.6 蹄葉橐吾黃酮體外抗氧化活性的測(cè)定

物質(zhì)對(duì)DPPH·和ABTS+·的清除率以及還原能力可以很好地反映其體外抗氧化能力[18]。蹄葉橐吾黃酮體外抗氧化活性如圖13～圖15 所示。

圖13 FLF 與VC 還原能力的比較Fig.13 Comparison of reducing power between FLF and VC

由圖13 可知，待測(cè)液濃度在0.25～1.25 mg/mL 內(nèi)，溶液濃度與吸光度呈正相關(guān)，二者表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系；且VC溶液的吸光度始終高于FLF 溶液，說(shuō)明FLF 的還原能力相對(duì)VC較弱。由圖14 可知，F(xiàn)LF 濃度與對(duì)DPPH·的清除率呈正相關(guān)，存在明顯的劑量效應(yīng)，但在測(cè)定范圍內(nèi)，其對(duì)DPPH·的清除效果弱于VC；由圖15 可知，F(xiàn)LF 濃度與ABTS+自由基清除率呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，但在測(cè)試范圍內(nèi)，整體弱于VC溶液。

圖14 FLF 與VC 清除DPPH·能力的比較Fig.14 Comparison of DPPH·scavenging ability of FLF and VC

圖15 FLF 與VC 清除ABTS+·能力的比較Fig.15 Comparison of FLF and VC scavenging ability of ABTS+·

綜上所述，F(xiàn)LF 具有一定的體外抗氧化能力，但整體弱于VC。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助纖維素酶酶解法提取蹄葉橐吾中黃酮，考察6 個(gè)因素對(duì)黃酮得率的影響，利用Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出影響較大因子為纖維素酶添加量、酶解時(shí)間、提取時(shí)間，以此設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到黃酮提取最佳工藝為纖維素酶添加量168 mg，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間51 min，料液比為1∶25（g/mL），超聲功率190 W，提取時(shí)間74 min，以此工藝提取FLF 的得率為2.05%。經(jīng)HPLC 分析知FLF 中主要的黃酮成分為金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、山奈酚，含量分別為33.86%、12.41%、8.03%、3.22%。體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明FLF 具有一定的還原力，對(duì)DPPH·和ABTS+·有較好的清除能力，但體外抗氧化活性相對(duì)弱于VC。本研究為蹄葉橐吾黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供了試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。