夏寧，謝春陽，黃威，呂呈蔚，孫暢，李倬林，胡濟美，李鐵柱*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長春 130033；3.中國國際工程咨詢有限公司 石化輕紡業(yè)務(wù)部，北京 100048）

花生是我國重要的經(jīng)濟和油料作物，能提供必不可少的蛋白質(zhì)和優(yōu)質(zhì)植物油脂，在國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[1]?；ㄉt衣又稱花生種皮、紅薄皮、落花生衣、紅衣，是豆科落花生屬植物落花生種皮，常見為紅色或粉紅色，具有抑制纖維蛋白溶解、增加血小板含量[2]、改善血小板質(zhì)量、增加毛細血管收縮[3]、糾正凝血因子缺陷、促進骨髓造血功能等功效?；ㄉt衣是花生油及花生制品生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物之一，價格低廉且具有多種活性，但是大部分被當作廢棄物，只有少數(shù)得到利用[4]?；ㄉt衣中含有豐富的多酚類化合物，其含量達到90～125 mg/g[5]，包含原花青素、白藜蘆醇、酚酸等[6]。原花青素是其主要功能成分之一，其含量高達81.90%。

原花青素（procyanidins，PC）是一種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮混合物[7]，由于它們遇到酸性介質(zhì)加熱可產(chǎn)生花青素，因此被稱為原花青素，其主要包括原花青素二聚體、兒茶素、表兒茶素，此外還包括三聚體、四聚體直至十聚體等，廣泛存在于植物的皮、核、花、殼、籽、葉中，是植物中一種色素成分。原花青素具有優(yōu)良的生物活性和功能，可以快速清除自由基，減少自由基產(chǎn)生，自由基是導(dǎo)致機體衰老的根本原因，消除體內(nèi)多余自由基，具有延長壽命的功效，原花青素清除自由基的能力比維生素C 和維生素E 更強，并且低聚原花青素是目前國際上公認的有效天然抗氧化劑，在體內(nèi)多種器官和組織中有抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，原花青素還有預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤[8]、皮膚保健及美容等作用。榨取花生油及花生制品會產(chǎn)生大量花生紅衣，目前其主要用于動物飼料，造成了資源的浪費。利用花生紅衣可用于多酚類活性物質(zhì)的提取[9]或研發(fā)以原花青素為主要成分的食品[10]和藥品[11]，用低成本原料創(chuàng)造高經(jīng)濟效益，是近年來研究的熱點。但由于國內(nèi)對于花生紅衣原花青素的相關(guān)內(nèi)容較少、技術(shù)不成熟、制備成本較高而難以實現(xiàn)[12]，需待進一步研究。

本文對花生紅衣原花青素的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，通過比較不同花生紅衣樣品原花青素含量和DPPH 自由基、羥自由基及ABTS+自由基清除能力對其抗氧化活性進行評價，并利用液相質(zhì)譜聯(lián)用法，分析花生紅衣中原花青素的組成成分，初步探究花生紅衣原花青素的活性特點，為花生紅衣中原花青素的研究提供理論和技術(shù)支持，也為其作為天然抗氧化劑的應(yīng)用提供參考，并且在食品開發(fā)應(yīng)用中提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試驗材料

山東“四粒紅”花生：市售；原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素（均為色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（25 U/mg）：上海生工生物工程公司；無水乙醇、甲醇、鹽酸（37%）、香草醛（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平（HX1002T）：慈溪市天東衡器廠；熒光分光光度計（RF-6000）：日本島津制作所；電熱鼓風干燥箱（101-2A 型）：天津天泰儀器有限公司；高速萬能粉碎機（FW100）：天津泰斯特儀器有限公司；超聲細胞破碎儀（JY92-Ⅱ）：寧波新芝生物科技股份有限公司；恒溫水浴鍋（HH-2）：常州朗越儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（XD-2000A）：上海賢德實驗儀器有限公司；循環(huán)水真空泵（SHZ-D）：鞏義市予華儀器有限責任公司；高速離心機（LXJ-IIB）：上海安亭科學儀器有限公司；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent1290-6470B）、色譜柱（ZORBAX Eclipse PlusC18）：美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原花青素提取

1.2.1.1 標準曲線繪制

稱取10 mg 原花青素標準品，在10 mL 容量瓶中用乙醇定容，稀釋至0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的濃度梯度，繪制標準曲線[13]。

1.2.1.2 花生紅衣原花青素提取

稱取山東“四粒紅”花生紅衣1 g，加入纖維素酶、10 mL 蒸餾水混合，50 ℃水浴加熱酶解，然后加入10 mL乙醇進行超聲，超聲后3 000 r/min 離心10 min，取上清液定容，為花生紅衣原花青素粗提液。取粗體液5 mL，再次定容作為樣品溶液。取0.5 mL 樣品溶液依次與4%香草醛甲醇溶液3 mL、濃鹽酸1.5 mL 混勻，避光靜置20 min，于500 nm 波長下測定吸光值[14]，代入標準曲線y=0.854x+0.069 1（R2=0.994 9）并計算原花青素提取率（Y，%）。

式中：V 為原花青素提取液定容后的體積，mL；C為原花青素的含量，mg/mL；N 為稀釋倍數(shù)；m 為花生紅衣全粉樣品的質(zhì)量，mg。

1.2.2 單因素試驗

固定酶解溫度50 ℃、酶解時間90 min、超聲溫度40 ℃，超聲時間30 min，考察酶添加量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%）對原花青素提取率的影響；固定酶添加量7.5%、酶解溫度50 ℃、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min，考察酶解時間（30、60、90、120、150 min）對原花青素提取率的影響；固定酶添加量7.5%、酶解時間90 min、酶解溫度50 ℃、超聲時間30 min，考察超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）對原花青素提取率的影響；固定酶添加量7.5%、酶解時間90 min、酶解溫度50 ℃、超聲溫度40 ℃，考察超聲時間（10、20、30、40、50 min）對原花青素提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取響應(yīng)面試驗參數(shù)范圍。選取酶添加量A、酶解時間B 及超聲時間C 作為變量，-1、0、1 代表試驗變量的水平，以山東“四粒紅”花生紅衣原花青素提取率作為響應(yīng)值進行響應(yīng)面分析，得到原花青素提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 原花青素提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計Table 1 Response surface design for optimization of procyanidin extraction

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH 自由基清除率的測定

取不同品種的花生紅衣原花青素粗提液0.5 mL，加入2 mL 0.04 mg/mL DPPH 溶液，混合搖勻，30 ℃反應(yīng)30 min。在517 nm 處測定吸光值計算DPPH 自由基清除率（D，%）[15]。

式中：Da為DPPH 與樣品反應(yīng)后的吸光值；Dc為DPPH 與溶劑混合液的吸光值；Db為樣品與溶劑混合液的吸光值。

1.2.4.2 羥自由基清除率的測定

取不同品種的花生紅衣原花青素粗提液0.5 mL加入0.5 mL 硫酸亞鐵溶液和0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸，用50%乙醇配制溶液7 mL，混合均勻，加8.8 mmo/L過氧化氫0.5 mL，室溫下避光反應(yīng)30 min 后，在510 nm處測定吸光值。用50%的乙醇分別替代過氧化氫、樣品，測吸光值計算羥自由基清除率（O，%）[16]。

式中：Do為樣品與FeSO4、H2O2混合液吸光值；Di為樣品與FeSO4、乙醇混合液吸光值；Dj為乙醇與Fe－SO4、H2O2混合液吸光值。

1.2.4.3 ABTS+自由基清除率的測定

稱取0.192 0 g ABTS 試劑、0.0331 g K2S2O8，用去離子水定容至50 mL，將該溶液于室溫下暗處靜置過夜。將生成的ABTS 溶液用無水乙醇稀釋至734 nm 處吸光值為0.70。反應(yīng)體系中，取不同品種的花生紅衣原花青素粗提液20 μL，加入2 mL ABTS 反應(yīng)液，振蕩搖勻，室溫下靜置10 min，測定反應(yīng)液在734 nm 處的吸光值[17]，計算ABTS+自由基清除率（A，%）。

式中：D1為樣品管的吸光值；D2為對照管的吸光值。

1.2.5 花生紅衣原花青素組分分析

色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相A 為0.1%甲酸，B 為甲醇；洗脫條件：0～1 min，12%B；1.0～2.5 min，12%～95%B；2.5～7.0 min，95%B；7.0～7.5 min，95%～12%B；7～10 min，12%B。進樣量1 μL、流速0.15 mL/min、柱溫30 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（負離子掃描模式）、電噴霧離子源的溫度最高至100℃、錐體氣體量為0.83L/min。離子質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 200。解吸氣體的溫度為400 ℃，解吸氣體的流量為11.67 L/min[18]。毛細管電壓設(shè)定為3 kV，錐體電壓最高為40 V。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每個樣品測定3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示。使用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并使用Origin 9.0 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

單因素試驗結(jié)果如圖1 所示。

圖1 酶添加量、酶解時間、超聲溫度、超聲時間對原花青素提取率的影響Fig.1 Effects of enzyme addition amount，digestion time，ultrasound treatment temperature and time on the yield of procyanidins

如圖1a 所示，在山東“四粒紅”花生紅衣樣品中，加入5.0%的纖維素酶明顯提高PC 的提取率，最高達到10.68%。這是因為細胞壁中纖維素被纖維素酶催化水解，細胞壁裂解，膜的滲透性增加，細胞內(nèi)PC 浸出，而且細胞壁破損也為后續(xù)超聲提取創(chuàng)造有利條件，協(xié)同超聲介導(dǎo)的提取起到良好的協(xié)同作用。但繼續(xù)添加纖維素酶，PC 提取率下降，這可能是由于纖維素酶催化作用受到抑制，因為纖維素酶添加量增加，底物沒有通過纖維素酶的結(jié)合達到飽和[19]。

如圖1b 所示，當酶解時間至90 min 時PC 提取率達到最高，為8.31%?？赡苁怯捎诶w維素酶與花生紅衣充分接觸，膜的滲透性增加[20]，促進細胞內(nèi)PC 的溶出，而當酶解時間過長，超過一定的閾值，大部分花生紅衣已與纖維素酶充分反應(yīng)完全，反而會破壞已經(jīng)提取出的原花青素穩(wěn)定性，活性物質(zhì)被分解，導(dǎo)致提取率降低，同時也造成了資源的浪費。

如圖1c 所示，參考黃武等[21]的方法并結(jié)合纖維素酶最適溫度確定超聲溫度范圍，當超聲溫度在30 ℃時PC 提取率最高，達到9.03%。這可能是由于分子運動、滲透、擴散和溶解的加速，且高溫會引起細胞膜結(jié)構(gòu)的變化，PC 從花生紅衣轉(zhuǎn)移到溶劑中，但在超過一定的閾值溫度時可能會破壞PC 結(jié)構(gòu)，同時更高的溫度會破壞纖維素酶的活性，最終導(dǎo)致提取率下降。

如圖1d 所示，超聲時間20 min 時提取率達到最高，為12.02%。超聲波使分子的運動加劇，與花生紅衣粉更充分接觸，細胞壁被破壞，花生紅衣內(nèi)的PC 被快速分離浸提出來，再增加超聲處理時間，反而會因為大部分原花青素已被浸出而降低提取率，如果還繼續(xù)超聲處理來幫助提取，會破壞已經(jīng)提取的原花青素的穩(wěn)定性。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

原花青素提取率的大小可以體現(xiàn)出其提取的工藝是否為最優(yōu)參數(shù)條件，在提取過程中能夠減少能源的損耗，以最大的效率提取更多物質(zhì)中的原花青素。選定酶添加量A、酶解時間B 及超聲時間C 這3 個因素作為試驗變量，以山東“四粒紅”花生紅衣原花青素提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6 設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗來獲得最佳試驗條件。響應(yīng)面優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

表2 原花青素提取響應(yīng)面結(jié)果分析Table 2 Response surface-optimized extraction results of procyanidins

2.2.2 響應(yīng)面試驗方差分析

響應(yīng)面方差分析結(jié)果如表3 所示。

表3 原花青素提取響應(yīng)面方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface-optimized extraction results of procyanidins

從表3 可知，對于此模型的純誤差來說，失擬誤差的F 值為2.99，P＞0.05（該模型中的失擬誤差為0.158 5）這說明失擬誤差小，試驗數(shù)據(jù)與此模型的擬合程度較好。R2為0.993 5，而校正后的R2Adj為0.985 2，這表明該試驗?zāi)Ｐ偷恼`差較小，結(jié)果均在合理范圍內(nèi)。因此原花青素提取率的試驗結(jié)果可以采用此模型進一步分析試驗數(shù)據(jù)。

從該表可以得出，3 個因素對原花青素提取率的影響由大到小排列為B>C>A；根據(jù)該試驗?zāi)Ｐ偷贸龅淖顑?yōu)條件組合進行試驗，其條件為酶添加量5.34%、酶解時間96.30 min 及超聲時間22.31 min，原花青素提取率的理論值10.14%。考慮到實際的可操作性，選擇酶添加量5.00%、酶解時間90.00 min、超聲時間20.00 min驗證該工藝參數(shù)組合得到的原花青素提取率為10.07%，與此模型得出的預(yù)測值接近，證明此提取工藝條件可靠。相比于傳統(tǒng)的超聲提取方法，纖維素酶法可以使細胞壁及細胞質(zhì)中的纖維素降解，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，提高有效成分的提取率[22]。

2.2.3 響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ椭袃蓛梢蛩亟换サ牡雀呔€圖和3D 圖

響應(yīng)面等高線圖和3D 圖如圖2 所示。

圖2 響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ椭袃蓛梢蛩亟换サ牡雀呔€圖和3D 圖Fig.2 Contour and 3D plots of effects of factor interactions on the yield of procyanidins

由圖2 可以看出，隨著酶添加量和酶解時間的增加，原花青素的提取率先增加后減少。這表明酶添加量和酶解時間存在交互作用，且作用顯著，會影響PC的提取率。酶解時間與超聲時間這兩個因素之間的交互作用極顯著，其坡面幅度較大，隨著酶解時間與超聲時間的增加，原花青素提取率先上升再下降。根據(jù)酶添加量與超聲時間的增加，PC 的提取率先平緩上升后下降，由3D 圖可以看出其坡面較為平緩，該試驗結(jié)果與方差分析結(jié)果相符。

2.3 抗氧化活性測定結(jié)果

由于不同的生長時期對花生紅衣原花青素提取率影響較大[23]，因此本試驗選擇5 種產(chǎn)量較高且為同生長時期采摘的吉林本土花生紅衣進行抗氧化試驗。不同品種花生紅衣原花青素的抗氧化活性測定結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同品種花生紅衣原花青素的抗氧化活性測定Fig.3 Antioxidant activities of procyanidins in red coat samples of different peanut cultivars

由圖3 可知，清除DPPH 自由基、羥自由基及ABTS+自由基能力最強的均是“吉花27” 花生紅衣PC 提取液，其自由基清除能力分別為91.04%、76.64%、87.11%。最弱的均是“吉花25”花生紅衣PC 提取液，其自由基清除能力分別為62.58%、49.30%、57.29%。試驗結(jié)論與宋昱等[24]對花生紅衣原花青素抗氧化活性的研究結(jié)論相似。因此，后續(xù)選擇“吉花27”花生進行HPLC-MS 試驗，分析其組成成分。

2.4 液相質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)果分析

低聚原花青素通常為二聚體到四聚體，由于其分子量小，細胞膜通過性強，生物活性突出，具有廣泛的開發(fā)價值。本文選用原花青素主要單體及二聚體對花生紅衣進行分析。

圖4 為7 種主要原花青素標準品的HPLC-MS 色譜圖，分別原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素、表沒食子酸兒茶素。

圖5 為“吉花27”花生紅衣原花青素提取液中各個峰的HPLC-MS 色譜圖。

圖5 花生紅衣中原花青素樣品的HPLC-MS 色譜圖Fig.5 HPLC-MS chromatograms of procyanidins in peanut red coat samples

由圖4、圖5 對比發(fā)現(xiàn)，其中存在原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素，未檢出表沒食子酸兒茶素[25]。根據(jù)峰面積計算得出含量分別為1.522、5.333、1.321、0.408、1.515、0.187 mg/g。表明“吉花27”中以原花青素A2為主。

圖6 為原花青素提純樣品中各個峰的最強峰離子m/z 質(zhì)譜分析圖。

圖6 原花青素樣品的離子碎片圖Fig.6 Ion fragmentation of procyanidin samples

通過與標準品出峰時間和質(zhì)譜圖對比，在3.29 min和3.54 min 峰的母離子m/z 為576，負離子模式下，最強峰離子m/z 為451，可能是原花青素A1，A2在T-unit進行了裂解[26]，失去一個間苯三酚分子（C6H6O3），產(chǎn)生m/z 451 碎片離子。在3.15 min 和3.43 min 峰的母離子m/z 為578，子離子為125、245、290、407、425 和451，最強峰離子m/z 為290。這可能是由于母離子Q M cleavage 分子間的一個單位斷裂[27]，失去C15H12O6而產(chǎn)生的，與原花青素B1和B2相吻合。在3.35、3.52 min 的兩個峰，母離子m/z 289，子離子為179、205、245，其中，最強峰離子m/z 為245，為母離子丟掉1 分子CO2后得到的離子[28]，分別與兒茶素和表兒茶素吻合。

3 結(jié)論

本文采用單因素和響應(yīng)面法對超聲波輔助酶法提取花生紅衣原花青素的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝為酶添加量5.00%、發(fā)酵時間90.00 min、超聲時間20.00 min，花生紅衣中原花青素的提取率為10.0658%。不同花生紅衣原花青素提取液清除自由基的能力比較結(jié)果表明，“吉花27”花生紅衣原花青素抗氧化活性最強，“吉花25”最弱。通過HPLC-MS 法分析“吉花27”中含有兒茶素、表兒茶素、原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2，其含量分別為1.515、0.187、1.522、5.333、1.321、0.408 mg/g。本研究為花生紅衣原花青素的研究提供參考。