鄧加聰，林丹茹，陳 林， 鄭 虹

（1.福建技術(shù)師范學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，福建福清 350300；2.福建世紀(jì)東潤(rùn)食品科技有限公司，福建福州 350200）

海帶是一種海洋巨藻，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含碘、海藻酸、海帶多糖、甘露醇、蛋白質(zhì)、粗纖維、各種微生素及微量元素等對(duì)人體身體有益的功能性成分[1-3]。目前，常見的海帶加工食品有鹽漬海帶、即食海帶涼菜、海帶干和海帶結(jié)等[4-7]。

甘露醇在醫(yī)療上可作為利尿劑和脫水劑，用于治療腦積水、動(dòng)脈硬化、高血壓等疾病，還可作為治療冠心病的特效藥[8-11]；海藻酸鈉鹽在醫(yī)療上，可用于預(yù)防白血病和骨痛病，除此之外還作為穩(wěn)定劑、增稠劑和乳化劑廣泛應(yīng)用于牙膏、冰激凌等行業(yè)中[12-14]；海帶多糖是目前研究較多的一種成分，從海帶中分離出的海帶多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗癌和防癌等功效，同時(shí)在抗凝血、抗病毒、減肥、降血糖和降血脂等方面具有顯著功效[15-17]。海帶不僅味美，而且其提取產(chǎn)物在醫(yī)藥、化工和食品行業(yè)中都有很大用處，海帶都有廣闊的應(yīng)用前景[18-19]。

目前，海帶中有效產(chǎn)物提取方法主要有水提法、微波提取法、超聲波提取法、酸提取法、酶提取法等[20-23]。與常規(guī)提取法相比，酶解法具有提取率高、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但是成本較高，因此研究一種高效、低成本的酶解法是目前研究熱點(diǎn)[24-25]。

采用復(fù)合酶法制備海帶浸提液，探究其最佳制備工藝條件，旨在為海帶浸提液的制備研究提供新方法、新思路，為海帶浸提液的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶（酶活力105U/g）、果膠酶（酶活力105U/g）、蛋白酶（酶活力105U/g），河南正邦實(shí)業(yè)有限公司提供；干海帶，霞浦溢源海洋食品開發(fā)有限公司提供；水楊酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、葡萄糖、硫酸、苯酚、甘露醇等試劑均為分析純，國藥試劑有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C 型臺(tái)式恒溫振蕩器，江蘇太倉科技有限公司產(chǎn)品；XL-06A 型多功能粉碎機(jī)，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；BSA224S 型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2100 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C 型酸度計(jì)，上海赫爾普國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同酶類及酶添加量對(duì)海帶浸提液制備的影響

分別選用纖維素酶（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）、果膠酶（0，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%）、木瓜蛋白酶（0，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%）3 種酶對(duì)海帶粉進(jìn)行酶解，酶解反應(yīng)初始條件為料液比1∶30（g∶mL），海帶粉用量2 g，酶解液pH 值5.5，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間60 min 后，于100 ℃水浴中滅酶10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，測(cè)定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.2 復(fù)合酶添加量對(duì)海帶浸提液制備的影響

將纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶按8∶2∶3比例進(jìn)行混勻，配成復(fù)合酶。酶解反應(yīng)初始條件為取海帶粉用量2 g，按料液比1∶30（g∶mL），加入一定量的復(fù)合酶（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%），酶解液pH 值5.5，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間60 min 后，于100 ℃水浴中滅酶10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，測(cè)定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.3 酶解時(shí)間對(duì)海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉加入蒸餾水60 mL，將酶解液pH值調(diào)至5.5，加入1.5%復(fù)合酶，于55 ℃下酶解一定時(shí)間（30，60，120，180，240 min），測(cè)定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.4 酶解溫度對(duì)海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉加入蒸餾水60 mL，將酶解液pH值調(diào)至5.5，加入1.5%復(fù)合酶，于不同溫度（35，40，45，50，55，60 ℃）下酶解90 min，測(cè)定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.5 料液比對(duì)海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉分別加入不同量的蒸餾水（使料液比控制在1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45），酶解液pH 值調(diào)至5.5，加入1.5%復(fù)合酶，于55 ℃下酶解90 min，測(cè)定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)海帶浸提液制備的影響

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、料液比、酶解時(shí)間和復(fù)合酶添加量4 個(gè)因素，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)海帶浸提液制備的影響進(jìn)行探討。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.7 海帶浸提液中甘露醇的測(cè)定采用分光光度計(jì)法測(cè)定海帶浸提液中甘露醇提取量[26]。

式中：C——海帶浸提液的甘露醇質(zhì)量濃度，mg/L；

V——測(cè)定取樣體積，mL；

F——測(cè)定樣品稀釋倍數(shù)；

m——稱取海帶粉質(zhì)量，g。

1.2.8 海帶浸提液中海藻酸的測(cè)定

采用分光光度計(jì)法測(cè)定海帶浸提液中海藻酸提取量[27]。

式中：C——海帶浸提液的海藻酸質(zhì)量濃度，mg/L；

V——測(cè)定取樣體積，mL；

F——測(cè)定樣品稀釋倍數(shù)；

m——稱取海帶粉質(zhì)量，g。

1.2.9 海帶浸提液中多糖的測(cè)定

采用硫酸-苯酚法測(cè)定海帶浸提液中多糖提取量[28]。

式中：C——海帶浸提液的多糖質(zhì)量濃度，mg/L；

V——測(cè)定取樣體積，mL；

F——測(cè)定樣品稀釋倍數(shù)；

m——稱取海帶粉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)對(duì)海帶浸提效果的影響

2.1.1 不同酶種類及酶用量對(duì)海帶浸提效果的影響

不同酶類及添加量對(duì)海帶浸提效果的影響見圖1。

圖1 不同酶類及添加量對(duì)海帶浸提效果的影響

由圖1（a）可知，當(dāng)纖維素酶添加量為2%時(shí)，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達(dá)到最大值，因此纖維素酶的最佳添加量為2%；由圖1（b）可知，當(dāng)果膠酶添加量為0.5%時(shí)，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達(dá)到最大值，因此果膠酶的最佳添加量為0.5%；由圖1（c）可知，當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為0.75%時(shí)，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達(dá)到最大值，因此木瓜蛋白酶的最佳添加量為0.75%。以上酶添加量單因素試驗(yàn)可得，纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的最佳配比為8∶2∶3。

2.1.2 復(fù)合酶添加量對(duì)海帶浸提效果的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)海帶浸提效果的影響見圖2。

圖2 復(fù)合酶添加量對(duì)海帶浸提效果的影響

由圖2 可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取率也逐漸增加，當(dāng)復(fù)合酶添加量為1.5%時(shí)，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取率達(dá)到最高。因此，復(fù)合酶的添加量為1.5%。

2.1.3 料液比對(duì)海帶浸提效果的影響

料液比對(duì)海帶浸提效果的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)海帶浸提效果的影響

由圖3 可知，海帶的海藻酸、甘露醇和多糖的提取量隨著料液比的增大呈先增后降的趨勢(shì)；當(dāng)料液比為1∶35 時(shí)，海帶的海藻酸、甘露醇和有機(jī)質(zhì)的提取量均達(dá)到最大，此時(shí)提取量分別為260.00，258.80，147.72 mg/g。綜上所述，選擇1∶35 為最佳料液比。

2.1.4 酶解溫度對(duì)海帶浸提效果的影響

酶解溫度對(duì)海帶浸提效果的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)海帶浸提效果的影響

由圖4 可知，過高或過低的酶解溫度，都不利于復(fù)合酶對(duì)海帶的酶解，從而影響提取效果。當(dāng)酶解溫度為55 ℃時(shí)，海藻酸、甘露醇和多糖的提取量達(dá)到最大。因此，選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)海帶浸提效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)海帶浸提效果的影響見圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)海帶浸提效果的影響

由圖5 可知，海藻酸、甘露醇和多糖的提取量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸增加；當(dāng)酶解時(shí)間為120 min 時(shí)，三者得率均達(dá)到最大；之后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，得率不再增加。因此，酶解最佳時(shí)間為120 min。

2.2 正交設(shè)計(jì)對(duì)海帶浸提效果的影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶添加量、料液比、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)海帶浸提效果進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以浸提液中的甘露醇、海藻酸、多糖提取量為考查指標(biāo)。

海帶提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 海帶提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，各因素對(duì)海帶浸提液中甘露醇和多糖提取量的影響最顯著的是料液比（C），之后依次是酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）和復(fù)合酶添加量（D）；而對(duì)海藻酸提取量的影響最顯著的是酶解時(shí)間（A），之后依次是酶解溫度（B）、料液比（C）和復(fù)合酶添加量（D）。甘露醇、海藻酸和多糖的最佳浸提組合分別是A1B2C2D2、A1B1C2D2、A1B2C3D2。為了更好地確定海帶的最佳浸提條件，對(duì)3 種組合進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

驗(yàn)證性試驗(yàn)見表3。

表3 驗(yàn)證性試驗(yàn) /mg·g-1

由表3 可知，對(duì)甘露醇、海藻酸及多糖含量較高的組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可確定最佳組合為A1B2C2D2，即復(fù)合酶添加量為1.5%，料液比為1∶35，酶解溫度為55 ℃，酶解時(shí)間為90 min，在該酶解條件下，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖的提取量分別為240.19，326.15，126.75 mg/g。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)合酶酶解海帶獲得海帶浸提液的工藝進(jìn)行研究，得到最佳的酶解工藝為復(fù)合酶添加量1.5%，料液比1∶35，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間90 min，在該酶解條件下，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖的提取量分別為240.19，326.15，126.75 mg/g。復(fù)合酶對(duì)海帶進(jìn)行酶解，跟傳統(tǒng)的熱水浸提法、酸堿浸提法、單一酶解法等提取方法，具有時(shí)間短、提取效率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，為今后海帶資源的高值化加工提供更廣闊的前景。