杜詠怡，譚才鄧，卓雨菡，姜紅營，劉永英，董雪瑜，王玉珠，陳曉嘉，陳姍姍，黃 強(qiáng)

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510300）

乳酸菌是一類公認(rèn)安全的益生菌，常見的有乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜熱鏈球菌屬等，在腸道中共同維護(hù)著菌群生態(tài)平衡，起到抑制有害微生物群落、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等作用[1-4]，對(duì)人體健康有重大意義，目前在乳制品、飲料、微生態(tài)制劑等領(lǐng)域展開應(yīng)用[1-3]。低 聚 木 糖（Xylooligosaccharides，XOS）是一種寡聚糖，其甜度是蔗糖的30%～40%，具有性能穩(wěn)定、耐酸耐高溫等特點(diǎn)。低聚木糖不能被人體直接代謝利用，但對(duì)機(jī)體可以起到降血糖、降血壓、改善脂質(zhì)代謝、防便秘、護(hù)肝等作用[1，5-7]。此外，能被腸道中的益生菌利用，特別是對(duì)雙歧桿菌、乳桿菌等的增殖有積極影響[4-6]，是一種功能性寡糖類益生元。低聚木糖主要是當(dāng)作益生元應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品行業(yè)，也作為添加劑應(yīng)用于養(yǎng)殖飼料行業(yè)[6-7]，但在食品行業(yè)中的應(yīng)用并不廣泛，目前多見應(yīng)用于烘焙食品及乳制品中。由于低聚木糖具有發(fā)酵困難的特性，擬篩選出能高效代謝低聚木糖的乳酸菌，以期為低聚木糖應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 篩選原料

自然發(fā)酵牛乳、自然發(fā)酵羊乳、泡菜。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）平板篩選培養(yǎng)基。低聚木糖質(zhì)量濃度20 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度5 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度5 g/L，吐溫-80 含量1 mL/L，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度2 g/L，乙酸鈉質(zhì)量濃度5 g/L，檸檬酸三銨質(zhì)量濃度2 g/L，七水硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L，四水硫酸錳質(zhì)量濃度0.05 g/L，碳酸鈣質(zhì)量濃度10 g/L，瓊脂粉質(zhì)量濃度18 g/L，pH 值6.2。

（2）液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。低聚木糖質(zhì)量濃度20 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度5 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度5 g/L，磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度2 g/L，乙酸鈉質(zhì)量濃度5 g/L，檸檬酸三銨質(zhì)量濃度2 g/L，七水硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L，四水硫酸錳質(zhì)量濃度0.05 g/L，pH 值6.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離篩選

將篩選材料置于適量無菌水中，并進(jìn)行梯度稀釋，選擇適宜梯度的稀釋樣液涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)3 d，分別測(cè)量菌落周圍透明圈直徑（H）與菌落直徑（C）的大小，挑取H/C 值大的菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 菌株代謝木糖產(chǎn)乳酸性能試驗(yàn)

將待測(cè)菌株分別接種于50 mL 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃的搖床中以轉(zhuǎn)速180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h制備成種子液。以10%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接于新鮮的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（低聚木糖質(zhì)量濃度80 g/L）中，于37 ℃的搖床中以轉(zhuǎn)速150 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d。每1 d 取適量發(fā)酵液，離心后取上清液，采用EDTA 定鈣法[8-9]進(jìn)行乳酸含量的測(cè)定。

1.2.3 菌種分子鑒定

待測(cè)菌株用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取基因組DNA，用作模板用于PCR 反應(yīng)擴(kuò)增16S rDNA 基因片段。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)采用Takara 高保真PCR 聚合酶（PrimeSTAR HS DNA Polymerase）按說明書進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃預(yù)變性4 min；96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將序列在NCBI 網(wǎng)站中進(jìn)行同源性檢索，利用MEGA 6.0 軟件以Neighbor-Joining 法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株耐酸試驗(yàn)

將菌株種子液以10%的接種量分別接種于空白對(duì)照、pH 值1.0～4.0 的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置4 h，間隔1 h 取樣測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.2.5 菌株耐膽鹽試驗(yàn)

將菌株種子液按照10%的接種量分別接種于空白對(duì)照和牛膽鹽質(zhì)量濃度3 g/L 的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置8 h，間隔1 h 取樣測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.2.6 模擬人工胃液試驗(yàn)

配制pH 值2.0 和pH 值3.0 的胃蛋白酶液（膜過濾除菌）以模擬空腹和飽腹2 種狀態(tài)下的人工胃液。取5 mL 菌懸液，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，用無菌生理鹽水清洗2 次后重懸于5 mL人工胃液中，于37 ℃條件下以轉(zhuǎn)速150 r/min 振蕩處理2 h，取樣測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.2.7 活菌數(shù)測(cè)定及存活率計(jì)算

乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定按國家標(biāo)準(zhǔn)“GB 4789.35—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)”進(jìn)行。

乳酸菌存活率按以下公式計(jì)算：

式中：X——存活率，%；

N1——試驗(yàn)各條件培養(yǎng)反應(yīng)后測(cè)得的活菌數(shù)，CFU/mL；

N0——空白對(duì)照試驗(yàn)測(cè)得的活菌數(shù)，CFU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選

經(jīng)過碳酸鈣平板分離篩選，以溶解圈直徑大?。℉）與菌落直徑（C）之比為指標(biāo)，篩選出H/C 值大的前12 株菌（見圖1）。其中，有5 株菌的H/C 值大于3.5，由高到低分別為6#（4.26）、5#（4.02）、1#（3.93）、11#（3.91）和2#（3.82），其他菌株的H/C 值均小于3.5。以這5 株菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行代謝木糖產(chǎn)乳酸性能試驗(yàn)，以獲得最優(yōu)菌株。

圖1 菌株分離篩選

菌株分離篩選見圖1。

2.2 菌株代謝木糖產(chǎn)乳酸性能試驗(yàn)

菌株發(fā)酵液乳酸質(zhì)量濃度測(cè)定見圖2。

圖2 菌株發(fā)酵液乳酸質(zhì)量濃度測(cè)定

以獲得的5 株菌為研究對(duì)象，考查其發(fā)酵木糖產(chǎn)乳酸的性能。5#菌株和6#菌株均在2 d 的時(shí)候達(dá)到產(chǎn)酸峰值，之后呈微下降趨勢(shì)；1#、2#和11#菌株均在3 d 的時(shí)候達(dá)到產(chǎn)酸峰值，之后呈微下降趨勢(shì)，可見，5#和6#菌株代謝利用木糖的速率快于其他3 株菌。從發(fā)酵液中乳酸質(zhì)量濃度峰值來看，其大小順序?yàn)?# ＞5# ＞1# ＞11# ＞2#，與初篩時(shí)菌株H/C 值的大小順序相符。綜上，6#菌株代謝木糖的速率快，產(chǎn)乳酸的量最高（達(dá)25.92 g/L）。因此，以6# 菌株為出發(fā)菌進(jìn)一步進(jìn)行研究，并將其命名為T-XOS-6。

2.3 菌株T-XOS-6 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株菌株T-XOS-6 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，通過PCR 反應(yīng)獲得其16S rDNA 基因片段，經(jīng)測(cè)序，其大小為1 528 bp。在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)分析，選取同源性98%以上的菌株的16S rDNA 序列利用Mega 6.0 軟件以Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株T-XOS-6 與Lacticaseibacillus paracasei CD-M-1（OP 491976.1）位于同一分支中，屬于副干酪乳桿菌。

菌株T-XOS-6 基于16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 菌株T-XOS-6 基于16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株T-XOS-6 耐酸能力試驗(yàn)

益生菌需要定植于動(dòng)物腸道中才能發(fā)揮其益生作用，在攝入過程中需要抵御胃酸的作用，因此具有強(qiáng)耐酸能力是益生菌的一個(gè)重要指標(biāo)。人體胃部的pH 值一般為2.0～4.0，試驗(yàn)設(shè)置了pH 值1.0，2.0，3.0，4.0 這4 個(gè)梯度來探究菌株T-XOS-6 的耐酸能力。

菌株T-XOS-6 耐酸能力見圖4。

圖4 菌株T-XOS-6 耐酸能力

菌株T-XOS-6 在pH 值4.0 和pH 值3.0 的條件下維持非常高的存活率，第4 h 的存活率分別為98.62%和94.85%。菌株T-XOS-6 在pH 值2.0 的條件下維持較高存活率，第2 h 和第4 h 的存活率分別為88.76%和80.66%。pH 值1.0 的強(qiáng)酸性條件下，雖然菌株的耐受能力整體表現(xiàn)明顯下降（第2 小時(shí)和第4 小時(shí)的存活率分別為65.43%和48.29%），但第1 小時(shí)的存活率仍然有72.39%，說明其有明顯的抵抗強(qiáng)酸性的能力。綜上所述，菌株T-XOS-6 在pH 值2.0～4.0 范圍耐受能力強(qiáng)，具備抵抗人體大多數(shù)情況下胃部酸性環(huán)境能力。

2.5 菌株T-XOS-6 耐膽鹽能力試驗(yàn)

益生菌定殖于腸道，需要耐受膽鹽的脅迫。膽鹽具有降低表面張力，使細(xì)菌的細(xì)胞膜損壞或菌體裂解，從而具有抑菌功能。人體腸道內(nèi)的膽鹽質(zhì)量濃度一般為0.3～3.0 g/L，食物通過一般在4 h 內(nèi)完成，本研究將菌株T-XOS-6 的細(xì)胞置于牛膽鹽質(zhì)量濃度3 g/L 的環(huán)境中處理8 h，以探究其耐受膽鹽脅迫的能力。

菌株T-XOS-6 耐膽鹽能力見圖5。

圖5 菌株T-XOS-6 耐膽鹽能力

菌株T-XOS-6 在3.0 g/L 膽鹽質(zhì)量濃度的環(huán)境中，前4 h 的存活率均在95%以上（第4 小時(shí)為95.15%），表明其耐受膽鹽脅迫能力優(yōu)秀；第5 小時(shí)的存活率在90%以上，6～8 h 的存活率在80%以上，說明此菌株能長時(shí)間耐受高濃度膽鹽脅迫。

2.6 菌株T-XOS-6 人工胃液耐受試驗(yàn)

能否順利通過胃的消化而留存高的存活率是衡量益生菌有效性的一個(gè)重要指標(biāo)，為了考查菌株T-XOS-6 耐受胃液處理的能力，試驗(yàn)在體外進(jìn)行模擬空腹和飽腹2 種狀態(tài)的試驗(yàn)。

菌株T-XOS-6 耐受人工胃液能力見圖6。

圖6 菌株T-XOS-6 耐受人工胃液能力

由圖6 可知，隨著作用時(shí)間的延長，菌株存活率呈下降趨勢(shì)，飽腹?fàn)顟B(tài)的下降趨勢(shì)明顯低于空腹?fàn)顟B(tài)的下降趨勢(shì)，且同等的處理時(shí)間下飽腹?fàn)顟B(tài)下的活菌數(shù)均高于空腹?fàn)顟B(tài)；在飽腹?fàn)顟B(tài)下，人工胃液處理1 h 時(shí)菌株的存活率為98.95%，2 h 時(shí)的存活率為95.19%；在空腹?fàn)顟B(tài)下，處理1 h 時(shí)菌株的存活率為91.25%，2 h 時(shí)的存活率為84.02%。一般而言，食物通過胃部的時(shí)間是在2 h 內(nèi)。因此，菌株T-XOS-6 耐受胃液的能力良好，符合微生態(tài)制劑的要求。

3 結(jié)論

利用低聚木糖作為培養(yǎng)基唯一碳源進(jìn)行乳酸菌選育，獲得一株高效代謝低聚木糖的乳酸菌T-XOS-6，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定其為副干酪乳桿菌，與Lacticaseibacillus paracasei CD-M-1（OP 491976.1）位于同一分支。經(jīng)初步研究，菌株T-XOS-6 代謝低聚木糖產(chǎn)生乳酸的速率高，在溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下發(fā)酵2 d 可使乳酸產(chǎn)量達(dá)到峰值。對(duì)菌株T-XOS-6 的耐酸、耐膽鹽、耐胃液等益生特性展開研究。結(jié)果表明，①菌株T-XOS-6 的耐酸能力強(qiáng)，在pH 值2.0 的條件下第2 小時(shí)和第4 小時(shí)的存活率分別為88.76%和80.66%，在強(qiáng)酸性（pH 值1.0）條件下處理1 h 的存活率仍然有72.39%；②菌株T-XOS-6 的耐膽鹽能力強(qiáng)，在高膽鹽（3 g/L）的條件下處理4 h，菌株存活率在95%以上；③菌株T-XOS-6 的耐胃液能力良好，模擬胞腹?fàn)顟B(tài)下處理2 h 時(shí)菌株的存活率為95.19%，模擬空腹?fàn)顟B(tài)下處理2 h 時(shí)菌株的存活率為84.02%。

低聚木糖是一種功能性寡糖類益生元，已在醫(yī)藥行業(yè)、保健品行業(yè)、養(yǎng)殖飼料行業(yè)中展開應(yīng)用，目前也逐漸在食品行業(yè)中進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)呈現(xiàn)多元化，消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量、功能食品在生命健康方面的要求越來越高，把低聚木糖應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵食品，將是功能性健康食品開發(fā)的一個(gè)方向，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益與應(yīng)用價(jià)值。因此，選育出的乳酸菌T-XOS-6 可為低聚木糖在功能性健康食品開發(fā)中提供益生菌菌種資源，具有良好的開發(fā)前景。