崔英靜 孫莉瓊 師建玲 李曉帆 鮑婷婷 王峰峰唐曉清， 王康才

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥研究所，江蘇 南京 210095；2蘇州啟帆農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 蘇州 212000）

菘藍(lán)（IsatisindigoticaFort.）為十字花科菘藍(lán)屬兩年生草本植物，葉、根均可入藥，分別為大青葉與板藍(lán)根，大青葉具有清熱解毒、涼血消斑的功效，板藍(lán)根具有清熱解毒、涼血利咽的功效［1］，其藥典指標(biāo)成分分別為靛玉紅、（R，S） -告依春。菘藍(lán)葉內(nèi)的靛藍(lán)是重要的天然染料，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和印染工業(yè)。靛藍(lán)、靛玉紅為吲哚類生物堿，（R，S） -告依春是含有氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)的生物堿，這三種成分均是含氮化合物，其含量受外源氮素的影響。氮是植物生長所必需的大量元素之一，對植物體內(nèi)的碳氮代謝起著至關(guān)重要的作用。已有研究表明，施加氮素的用量、形態(tài)及相應(yīng)的配比顯著影響菘藍(lán)葉、根指標(biāo)成分的累積及產(chǎn)量［2-4］，靛藍(lán)、靛玉紅［5］和（R，S） -告依春［6］含量隨著氮素濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢。但前人研究多注重施氮后單一時間點的變化，缺少施氮后菘藍(lán)碳氮代謝關(guān)鍵酶、基因表達量及有關(guān)化合物的動態(tài)變化過程研究。

土壤有機質(zhì)對改良土壤耕性、調(diào)節(jié)土壤結(jié)構(gòu)具有重要作用。土壤全氮是指土壤中所有形式的有機氮與無機氮的綜合，是為植物生長提供有效氮的庫。土壤C/N 是衡量土壤營養(yǎng)平衡的重要指標(biāo)，其值大小影響土壤的氮循環(huán)［7］。植物吸收氮素后，其自身各部位C/N同時變化，不同器官的C/N 反映了其對生存環(huán)境的適應(yīng)，一般植物向低C/N 變化［8］。植物碳氮代謝受多個基因的影響［9-11］，因碳氮代謝的復(fù)雜性，影響碳氮代謝的基因具有多種生理生化功能［12-13］，其中，BIG基因的突變體會導(dǎo)致擬南芥C/N 增大，進而調(diào)節(jié)植物碳氮平衡［14］。鑒于此，本試驗通過外源施加氮素改變基質(zhì)C/N，影響菘藍(lán)吸收氮素的性能，在此過程中，測定基質(zhì)與菘藍(lán)葉、根的碳素與氮素含量，計算基質(zhì)與菘藍(lán)葉、根C/N；測定碳代謝關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）與氮代謝關(guān)鍵酶硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（glutamate synthetase，GOGAT）的活性及其基因表達量，揭示基質(zhì)C/N 變化后菘藍(lán)碳、氮代謝的動態(tài)變化過程；最后測定菘藍(lán)葉、根指標(biāo)成分在施氮后的含量變化，分析施氮后菘藍(lán)葉、根的適宜采收時間，以期為菘藍(lán)氮營養(yǎng)的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以河北居群的菘藍(lán)種子（角果）為試驗材料，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)唐曉清教授鑒定為十字花科植物菘藍(lán)（IsatisindigoticaFort.）。

1.2 試驗設(shè)計

于2022 年4 月播種，避雨盆栽，每盆定植4 株。栽培基質(zhì)為蛭石∶珍珠巖（2∶1），基本營養(yǎng)液采用霍格蘭營養(yǎng)液配方，pH 值為6.0；KH2PO4提供菘藍(lán)生長所需的磷、鉀。出苗30 d后，設(shè)置4組處理，每組20盆，處理液分別為0、5、15、20 g·L-1的CO（NH2）2，記為CK、N1、N2、N3，隔4 d處理一次，每盆施加處理液100 mL，共處理4次。在4次處理結(jié)束后12、28、44、64 d取樣。每次取樣，取3盆12株菘藍(lán)葉、根的相同部位，約10 g鮮樣，混合后剪碎并于-80 ℃冰箱保存，用于測定碳氮代謝關(guān)鍵酶的活性及其基因表達量。收取整株菘藍(lán)，葉、根分開，108 ℃殺青，60 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，干燥保存，用于測定靛藍(lán)、靛玉紅和碳氮元素含量。將已收取菘藍(lán)的3 盆基質(zhì)充分混勻，取適量基質(zhì)（干燥前約10 g），用于測定其碳氮元素含量。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 基質(zhì)、菘藍(lán)碳和氮元素含量的測定 采用重鉻酸鉀外加熱法［15］測定基質(zhì)和植物碳元素含量，采用F30800090 CN 802碳氮分析儀（意大利VELP Scientifica Srl公司）對全氮含量進行分析，計算基質(zhì)及菘藍(lán)葉、根的C/N。每個處理重復(fù)3次。

1.3.2 碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的測定 使用BC2195磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性檢測試劑盒、BC0605 蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性檢測試劑盒（北京Solarbio 公司）測定碳代謝關(guān)鍵酶PEPC、SPS 的活性。氮代謝關(guān)鍵酶NR、GS、GOGAT 的活性使用A096-1-2硝酸還原酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）、BC0915谷氨酰胺合成酶（GS）活性檢測試劑盒、BC0075谷氨酸合成酶（GOGAT）活性檢測試劑盒（北京Solarbio公司）測定。每個處理重復(fù)3次。

1.3.3 碳氮代謝關(guān)鍵酶基因表達量的測定 將-80 ℃冰箱中菘藍(lán)葉、根的凍存樣品碾碎充分混勻后取適量于液氮中研磨，而后取約0.3 g 平均分成3 份，按RR047A RNAsimple Total RNA Kit 試劑盒（北京TIANGEN 公司）方法提取菘藍(lán)葉、根的RNA，反轉(zhuǎn)錄使用Primer ScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser（Derfect Real Time）（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）體系，以TIP41作為內(nèi)參基因［16］，碳代謝關(guān)鍵酶PEPC、SPS和氮代謝關(guān)鍵酶NR、GS、GOGAT基因表達量采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）方法測定，使用2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green l）體系（北京擎科生物科技有限公司），具體所用引物見表1，體系混合后由QuantStudio 6 Flex 熒光定量PCR儀（美國賽默飛公司）測定后，分析程序運行結(jié)果時，假定目的片段和內(nèi)參基因的擴增效率一致，均為100%，用2-ΔΔCT法定量分析，每個處理重復(fù)3次。

表1 碳氮代謝關(guān)鍵酶基因的引物Table 1 Primers for key enzyme genes of carbon and nitrogen metabolism

1.3.4 葉中靛藍(lán)、靛玉紅含量的測定 參照《中華人民共和國藥典》（2020版一部）［1］高效液相色譜法（通則0512），采用超高效液相色譜（ultra-high-performance liquid chromatography，UPLC）法測定靛藍(lán)和靛玉紅含量，條件略作修改，分析柱為Aglient ZORBA×Eclidise Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇-水（v∶v=72∶28）；流速0.30 mL·min-1；柱溫30 °C；檢測波長289 nm；進樣體積2 μL。以靛藍(lán)、靛玉紅的色譜峰面積（Y）與其對應(yīng)的含量（X，μg·mL-1）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。靛藍(lán)：Y1=892.05X1+1 406.3，R12=0.988 9（n=3），線性范圍為0～10 μg·mL-1，靛玉紅：Y2=51 134X2-2 441.5，R22=0.997 7（n=3），線性范圍為0～10 μg·mL-1。供試品溶液的制備：精密稱定0.25 g菘藍(lán)葉細(xì)粉，置于索氏提取器中，加三氯甲烷浸泡15 h，加熱回流提取至提取液無色?；厥杖軇┲粮桑瑲堅蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液備用。精密吸取對照品溶液2 μL，注入超高效液相色譜儀測定相應(yīng)峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算即得靛藍(lán)、靛玉紅含量。每個處理重復(fù)3次。

1.3.5 根中(R,S) -告依春含量的測定 參照《中華人民共和國藥典》（2020版一部）［1］高效液相色譜法（通則0512），UPLC 條件同1.3.4，流動相為甲醇-0.02%磷酸（v∶v=7∶93）。以（R，S）-告依春色譜峰面積（Y）與其對應(yīng)的含量（X，μg·mL-1）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程：Y=183.49X+227.32，R2=0.994 9（n=3），線性范圍為0～100 μg·mL-1。供試品溶液的制備：精密稱定1 g 菘藍(lán)根細(xì)粉，置于圓底瓶中，精密加入水50 mL，稱定重量，煎煮2 h，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，過濾，取濾液，得供試品溶液。其余操作同1.5，每個處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 及SPSS 20.0 軟件中的單因素方差分析法（P＜0.05）進行數(shù)據(jù)分析，處理間顯著性比較采用Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮后菘藍(lán)葉與根碳代謝的動態(tài)變化

菘藍(lán)葉中，隨著施氮后天數(shù)的增加，CK、N1 的PEPC 活性呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，N2 則先降低后升高，N3 逐漸降低（表2）；菘藍(lán)葉中N1、N2、N3的PEPC基因表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖1）；SPS 的活性均隨著時間延長呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢；N1 的SPS基因表達量呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，N2 則呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，N3 的變化趨勢與N1 相反。不同處理組的碳代謝產(chǎn)物可溶性糖含量的變化不同（圖2）。隨著施氮后天數(shù)的增加，CK 葉中可溶性糖含量逐漸增加，N1、N2、N3 的可溶性糖含量先減少后增加。不同天數(shù)，處理組生物量整體高于對照組，各組生物量隨施氮后天數(shù)的增加逐漸增加（表3）?？傮w分析，N1、N2、N3可溶性糖含量與PEPC基因表達量的變化趨勢相反，與SPS 活性的變化趨勢相似。施氮12、28、64 d 后，N2 中PEPC 的活性高于其他組，PEPC基因表達量在施氮后12～64 d較高。N2、N3的SPS活性在施氮12、64 d 較高，CK、N1 的SPS 活性在施氮后12、64 d較高。施氮后12、64 d，N2的SPS基因表達量高于其他組。

圖1 施氮后菘藍(lán)葉與根中碳代謝關(guān)鍵酶酶基因的表達（n=3）Fig.1 Expression of key enzyme genes of carbon metabolism in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

圖2 施氮后菘藍(lán)葉與根中可溶性糖含量的變化（n=3）Fig.2 Changes of soluble sugar content in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

表2 施氮后菘藍(lán)葉與根中碳代謝關(guān)鍵酶活性的變化（n=3）Table 2 Changes of key enzyme activities of carbon metabolism in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

表3 施氮后菘藍(lán)生物量的變化（n=10）Table 3 Changes of biomass of I.indigotica after nitrogen application （n=10）/g

菘藍(lán)根中，隨著施氮后時間延長，CK、N1、N2、N3的PEPC、SPS活性均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢；N1、N2的PEPC基因表達量先升高后降低，N3 先降低后升高再降低；N1、N3 的SPS基因表達量先降低后升高，N2先降低后升高再降低；同時，CK、N1、N2、N3 根中可溶性糖含量先降低后升高?？傮w分析，N1、N2、N3可溶性糖含量與PEPC基因表達量的變化趨勢相反，與SPS活性的變化趨勢相似，該結(jié)果與葉相同。施氮后28～64 d，N2 的PEPC 活性及基因表達量高于其他組。施氮后12、28、64 d，SPS 的活性較高，SPS基因表達量在施氮后12、44、64 d 較高。N3 施用氮素多于N2，但其對碳代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達量的促進作用略低于N2。

2.2 施氮后菘藍(lán)葉與根氮代謝的動態(tài)變化

菘藍(lán)葉中，隨著施氮后天數(shù)的增加，CK的NR活性先升高后降低，N1 先降低后升高，N2、N3 則先降低后升高再降低（表4）；N1 的NR基因表達量逐漸降低，N2、N3則先升高后降低（圖3）；CK的GS活性先升高后降低，N1 先升高后降低再升高，N2 先降低后升高，N3逐漸降低；N1 的GS基因表達量先降低后升高再降低，N2、N3 先升高后降低；CK 的GOGAT 活性先升高后降低再升高，N1 先降低后升高再降低，N2、N3 則先升高后降低；N1、N2、N3 的GOGAT基因表達量均先升高后降低再升高。GS 與GOGAT 活性、基因表達量的變化趨勢相反。隨著施氮后天數(shù)的增加，CK、N3 的靛藍(lán)含量先增加后減少，N1 逐漸減少，N2 先增加后減少再增加，僅N1 組靛藍(lán)含量的最大值出現(xiàn)在施氮后12 d，其余處理組靛藍(lán)含量的最大值均出現(xiàn)在施氮后28 d，施氮后28 d，N2 組靛藍(lán)含量顯著高于CK，為0.37 mg·g-1（圖4）；CK、N1 的靛玉紅含量先減少后增加再減少，N2、N3 則先增加后減少，各處理靛玉紅含量的最大值均出現(xiàn)在施氮后44 d，其中N2 最高，為0.74 mg·g-1。總體分析，CK 靛藍(lán)含量與NR、GS 活性的變化趨勢相似，靛玉紅含量與GOGAT 活性的變化趨勢相反。N1的靛藍(lán)含量與NR基因表達量變化趨勢相似；靛玉紅含量與GS基因表達量、GOGAT 活性變化趨勢相似，與GOGAT基因表達量、GS 活性變化趨勢相反。N2 靛藍(lán)含量與NR活性的變化趨勢相反，與GOGAT基因表達量的變化趨勢相似；靛玉紅含量與NR、GS基因表達量、GOGAT 活性的變化趨勢相似。N3 靛藍(lán)、靛玉紅含量與NR、GS基因表達量、GOGAT 活性的變化趨勢相似。施氮后12～64 d，N2的NR 活性始終處于較高水平。施氮后12、28、44、64 d，GS 和GOGAT 活性升高的時間點相互交錯，如N1 菘藍(lán)葉中GS 活性先升高后降低再升高，GOGAT 活性則先降低后升高再降低。施氮后12、28、64 d，NR基因表達量表現(xiàn)為N3＞N2＞N1，施氮后44 d則表現(xiàn)為N2＞N3＞N1。施氮后12、44、64 d，GS基因表達量表現(xiàn)為N2＞N1＞N3，施氮后28 d 則表現(xiàn)為N3＞N2＞N1。試驗過程中，GOGAT基因表達量均表現(xiàn)為N2＞N1＞N3?？傮w上，N2氮代謝關(guān)鍵酶的活性較高。

圖4 施氮后菘藍(lán)葉與根中指標(biāo)成分的變化（n=3）Fig.4 Changes of index components in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

表4 施氮后菘藍(lán)葉和根中氮代謝關(guān)鍵酶活性的變化（n=3）Table 4 Changes of key enzyme activities of nitrogen metabolism in I.indigotica leaves and roots after nitrogen application （n=3）

菘藍(lán)根中，隨著施氮后天數(shù)的增加，CK、N1、N2 的NR 活性先升高后降低，N3 先降低后升高；N1、N3 的NR基因表達量逐漸降低，N2 先降低后升高；CK 的GS活性逐漸升高，N1、N2、N3先升高后降低再升高；N1的GS基因表達量先降低后升高再降低，N2 先降低后升高，N3 逐漸降低；CK 的GOGAT 活性逐漸降低，N1、N2先升高后降低再升高，N3 先升高后降低；N1 的GOGAT基因表達量先降低后升高再降低，N2 先升高后降低，N3 逐漸降低；根中（R，S）-告依春的含量逐漸增加，各處理最大值均出現(xiàn)在施氮后64 d，（R，S）-告依春含量表現(xiàn)為N2＞N1＞N3＞CK，最大值為7.50 mg·g-1。N1 的NR基因表達量變化趨勢與葉相似，N2、N3 與葉相反。在菘藍(lán)葉、根中，GS 與GOGAT 活性均存在相反的變化趨勢。碳代謝關(guān)鍵酶SPS的活性和基因表達量與氮代謝第1 個關(guān)鍵酶NR 的活性和基因表達量變化趨勢相反。PEPC 的活性和基因表達量與NR 變化趨勢相似。分析施氮后菘藍(lán)葉、根中指標(biāo)成分含量的變化與處理濃度的相關(guān)性（表5），除施氮后44 d 葉中靛藍(lán)含量、施氮后28 d 根中（R，S）-告依春含量與處理濃度的相關(guān)性較小外，其余時間點菘藍(lán)指標(biāo)成分含量均與氮素濃度顯著相關(guān)。

表5 施氮后菘藍(lán)葉和根中指標(biāo)成分含量與氮素濃度的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between changes in index component content and nitrogen concentration in leaves and roots of I.indigotica after nitrogen application

2.3 施氮對基質(zhì)碳氮比的影響

外源施加氮素可以降低基質(zhì)C/N。施氮后，基質(zhì)及菘藍(lán)葉、根碳氮含量及碳氮比的變化見圖5。處理結(jié)束后（0 d），處理組N1、N2、N3 基質(zhì)中的氮含量高于CK，此時各組的C/N 最小。隨著施氮后天數(shù)的增加，基質(zhì)中的碳含量逐漸增加，氮含量則逐漸減少。施氮后64 d，N1、N2、N3基質(zhì)的碳元素含量比CK低2.86%、1.29%、23.32%；僅N1 氮元素含量較CK 低1.10%，N2、N3 氮元素含量則分別較CK 高23.78%、21.71%。隨著施氮后天數(shù)的增加，各組基質(zhì)的C/N 逐漸增大，CK、N1組基質(zhì)C/N整體顯著高于N2、N3。

菘藍(lán)碳、氮含量的變化趨勢與基質(zhì)相反。隨著施氮后天數(shù)的增加，菘藍(lán)葉、根中的碳含量呈波動變化，而氮含量整體逐漸增加，C/N 整體逐漸減小。各組葉中氮含量在施氮后12～28 d 的增加量較大，同時，吸收氮素關(guān)鍵酶NR 活性較大，根中同樣存在此規(guī)律。菘藍(lán)葉中碳元素含量整體呈現(xiàn)先減小后增加的變化趨勢；根中碳元素含量整體呈現(xiàn)逐漸減小的變化趨勢。葉中C/N 在施氮后28 d表現(xiàn)為CK＞N1＞N2＞N3；施氮后44 d 表現(xiàn)為CK＞N1＞N3＞N2；施氮后64 d 表現(xiàn)為N1＞CK＞N3＞N2。根中C/N 在施氮后12 d 表現(xiàn)為N3＞CK＞N1＞N2；施氮后28 d 后表現(xiàn)為N1＞CK＞N3＞N2；施氮后44 d 表現(xiàn)為N1＞CK＞N3＞N2；施氮后64 d 表現(xiàn)為CK＞N1＞N3＞N2。

3 討論

3.1 氮素對菘藍(lán)C/N的影響

土壤C/N 直接反映土壤肥力大小。外源施加氮素使基質(zhì)C/N 減小，土壤肥力增大。隨著菘藍(lán)生長進程的推進，基質(zhì)中碳含量逐漸增加，氮含量逐漸降低；與之相反，菘藍(lán)葉、根中的碳含量減少，氮含量增多。栽培菘藍(lán)后的基質(zhì)C/N明顯增大，肥力發(fā)生變化。施氮后64 d，基質(zhì)氮含量由高到低分別為N2、N3、CK、N1，與土壤氮素殘留量隨土壤C/N 的增大而逐漸增加的結(jié)論相符［20］，這可能是因為植物對氮元素的吸收受基質(zhì)本身含有氮素的限制。

器官代謝越活躍時，氮分布越多，該器官C/N 越?。?1］。本研究發(fā)現(xiàn)，施氮后，菘藍(lán)葉、根C/N逐漸降低，即菘藍(lán)體內(nèi)的代謝活動增強，與施氮后菘藍(lán)碳氮代謝關(guān)鍵酶活性增大的現(xiàn)象相符。N2、N3 菘藍(lán)葉、根的C/N 小于N1 及CK，這說明N2、N3 組菘藍(lán)的代謝較強。植物通過降低C/N 使其在較短的時間內(nèi)吸收較多養(yǎng)分以滿足其生長需求［22］。植物不同部位C/N 不同，體現(xiàn)了植物對自身氮素的分配［8，21］。施氮后菘藍(lán)葉的C/N小于根，說明菘藍(lán)葉的代謝活動強于根［21］?？梢?，葉是菘藍(lán)進行各種代謝的主要部位。

3.2 外源施加氮素后菘藍(lán)碳、氮代謝的變化

外加氮源可直接影響菘藍(lán)的氮代謝，間接影響與氮代謝相互制約的碳代謝。碳代謝為植物的基本代謝，其代謝產(chǎn)物貫穿氮代謝等其他代謝過程，為其提供碳骨架、ATP等，而氮代謝為碳代謝提供其需要的氨基酸及酶［23］。NR 為氮代謝的第一個關(guān)鍵酶，其活性大小可以直接反映植物的氮代謝能力［24］。外加氮素可以增大菘藍(lán)NR 活性。施加不同濃度氮素，菘藍(lán)葉和根中碳、氮代謝關(guān)鍵酶的活性及其基因表達量升高的時間點不同。葉中NR 活性及基因表達量均高于根，同時葉中氮素含量高于根，這說明葉吸收氮素更多，造成該現(xiàn)象的主要原因可能是葉需要更多的氮素滿足其代謝的基本需求。N2 的NR 活性高于其他組，N2 組菘藍(lán)葉、根中氮元素的增大量高于其他組，說明N2 組菘藍(lán)所吸收的氮素較多。GS 催化含氮無機化合物合成谷氨酰胺（glutamine，Gln），是將無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮的一條主要途徑，其活性是衡量植物氮素同化的重要生理指標(biāo)，GOGAT 與GS 構(gòu)成循環(huán)，參與氮的初級吸收等［25］。施氮后，GS、GOGAT 活性及基因表達量升高的時間點晚于NR，這可能是由二者所催化的反應(yīng)以NR所催化的反應(yīng)產(chǎn)物為底物而致［25］。

PEPC 是植物固定CO2的第一個關(guān)鍵酶，可催化磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）生成草酸乙酰等［26］，而PEP 是合成吲哚等生物堿的關(guān)鍵物質(zhì)［27］，菘藍(lán)葉中的靛藍(lán)、靛玉紅均屬于吲哚類生物堿。PEPC 亦可調(diào)節(jié)C/N［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，在菘藍(lán)葉和根中，N2 的PEPC 活性及基因表達量較高。碳代謝關(guān)鍵酶PEPC 與氮代謝關(guān)鍵酶NR 的活性及基因表達量變化趨勢相似，在施氮后12～28 d 較大，結(jié)合菘藍(lán)葉、根中氮素在施氮后12～28 d 增大量較大的現(xiàn)象，綜合說明PEPC 活性與菘藍(lán)吸收的氮元素量呈正相關(guān)。SPS是調(diào)控蔗糖合成的關(guān)鍵酶，SPS 活性與植物蔗糖含量成正比［29］。蔗糖是植物的儲能物質(zhì)，具有多種生理作用。施氮64 d后菘藍(lán)根中SPS活性與基因表達量較施氮后28、44 d顯著升高，這可能是因為生長后期菘藍(lán)將一部分營養(yǎng)物質(zhì)向地下部分轉(zhuǎn)移［30］，符合菘藍(lán)葉、根中可溶性糖含量在施氮后64 d 升高的結(jié)果。PEPC 參與產(chǎn)能反應(yīng)［26］，SPS催化能量儲存物質(zhì)的合成，二者所催化反應(yīng)的屬性相反，本試驗同樣發(fā)現(xiàn)PEPC 與SPS活性及基因表達量的變化趨勢相反，這可能是因為施加氮素后，菘藍(lán)首先進行的氮代謝強度較高，消耗能量；之后菘藍(lán)的氮代謝強度減弱，累積能量。

菘藍(lán)內(nèi)的指標(biāo)成分對不同氮水平的響應(yīng)不同［31］。施氮后，N2處理的菘藍(lán)葉、根中的指標(biāo)成分含量較高，但其含量達到最高的時間點不同，造成該現(xiàn)象的原因可能是菘藍(lán)不同生長時期對其相應(yīng)指標(biāo)成分的需求量不同。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著施氮后天數(shù)的增加，菘藍(lán)葉、根中累積的氮素逐漸增多，與此相反，基質(zhì)中的氮素減少；碳代謝關(guān)鍵酶PEPC 活性呈波動變化，SPS 活性及基因表達量、可溶性糖含量先減小后增加；碳代謝產(chǎn)物可溶性糖含量與PEPC基因表達量的變化趨勢相反。氮代謝產(chǎn)物靛藍(lán)、靛玉紅、（R，S）-告依春含量與NR、GS、GOGAT 活性及基因表達量密切相關(guān)。15 g·L-1CO（NH2）2處理的各種酶活性及基因表達量較高。葉中靛藍(lán)、靛玉紅及根中（R，S）-告依春的含量分別在施氮后28、44、64 d 較高，15 g·L-1CO（NH2）2處理更有助于菘藍(lán)指標(biāo)成分的累積。