邢運(yùn)高 劉 艷 李 健 遲 銘 楊 波 李景芳 王寶祥 徐大勇

（江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222006）

糯稻（OryzasativaL.var.Glutinosa Matsum）是栽培稻的粘性變種，黃淮海地區(qū)以種植粳糯為主。隨著雜交水稻的推廣，糯稻的種植面積大幅減少，由水稻種植總面積9%逐漸減少至1%～2%［1］。近年來糯稻的種植面積逐步回升，如安徽省懷遠(yuǎn)縣97%的水稻為粳糯［2］。當(dāng)前生產(chǎn)上推廣的糯稻品種對稻瘟病的抗性較差，給水稻安全生產(chǎn)帶來隱患［1，3］。稻瘟病是威脅我國水稻安全生產(chǎn)的主要病害之一，研究表明抗性基因在抗病育種中發(fā)揮著重要的作用［4-5］，因此明確抗性基因的效應(yīng)具有重要意義。黃淮稻區(qū)抗稻瘟病基因效應(yīng)研究主要集中在Pita、Pib、Pi54、Pikm等4個基因上，不同的學(xué)者研究的結(jié)果不盡相同。Pib、Pi54基因組合在黃淮稻區(qū)粳稻中占比最高，但是兩個基因在本稻區(qū)的抗性效果一般［4-7］。邢運(yùn)高等［8］發(fā)現(xiàn)Pita對黃淮稻區(qū)早熟品種（品系）的稻瘟病的抗性發(fā)揮著重要的作用。陳鋒等［9］發(fā)現(xiàn)黃淮區(qū)粳稻中Pikm與稻瘟病抗性相關(guān)性顯著，而Pita、Pib、Pi54基因與抗性相關(guān)性不顯著。

近年來，基于競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）原理開發(fā)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）檢測技術(shù)已在農(nóng)作物遺傳改良方面得到廣泛應(yīng)用［10-11］。KASP 技術(shù)具有高通量、低成本、易操作等特點(diǎn)，適用于大規(guī)?；驒z測要求［12］，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于小麥［13-15］、西瓜［16］、水稻［17］等作物的基因型鑒定。但現(xiàn)有的抗稻瘟病基因研究集中于常規(guī)粳稻中，粳糯稻中的抗病基因分布還鮮有報道。鑒于此，本研究利用來源于江蘇、安徽、山東、河南等地區(qū)65份粳糯品種（品系），通過檢測Piz基因座復(fù)等位基因（Pi2、Pi9、Pigm）、Pik基因座復(fù)等位基因（Pi1、Pikh、Pik）、位于第9 號染色體上的Pi5以及第12號染色體上的Pita這2個廣譜抗病基因，通過分子標(biāo)記檢測，明確上述抗稻瘟病病基因在粳糯稻中的分布，并進(jìn)行連續(xù)2 年的抗性鑒定，旨在明確抗性基因與稻瘟病抗病能力之間的關(guān)系，評估當(dāng)前推廣的糯稻品種的推廣風(fēng)險，為糯稻抗病育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與種植方法

本研究共征集了65 份粳糯稻品種（品系），按照審定區(qū)域（包含參加試驗(yàn)的品系，下同）劃分，含有國審品種5 個、江蘇審定品種20 個、安徽審定品種18 個、山東審定品種5個、河南審定品種1個以及連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院糯稻品系16個（電子附表1）。2021—2022年所有品種（品系）分為同等的2 份，分別種植于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛基地（東經(jīng)119°16′，北緯34°59′）、贛榆塔山稻瘟病鑒定基地（東經(jīng)119°6′，北緯34°80′），其中東辛基地用于人工接種鑒定，2 年均為5 月20 日播種、6 月25 日移栽，每個品種（品系）種植4 行，每行10 株。塔山基地用于自然誘發(fā)鑒定，兩年均為5月25日播種、6 月30 日移栽，每個品種（品系）種植4 行，每行10 株，3 次重復(fù)，稻瘟病鑒定圃四周種上稻瘟病誘發(fā)品種（蘇御糯），田間管理同一般大田管理。

表1 不同審定來源中糯稻稻瘟病抗性基因組合模式及比例Table 1 Combination mode and proportion of blast resistance genes of glutinous rice in different approval channels

1.2 抗性基因分型

利用16 個KASP 功能標(biāo)記（每個基因檢測2 個標(biāo)記）檢測8個抗稻瘟病基因。本研究所用的KASP標(biāo)記以及65 個糯稻品種（品系）抗病基因檢測全部委托華智生物技術(shù)有限公司（長沙）完成。

1.3 稻瘟病抗性鑒定

1.3.1 稻瘟病抗性鑒定方法 2021—2022 連續(xù)兩年通過人工接種鑒定和自然誘發(fā)鑒定兩種方式鑒定水稻品種（品系）的稻瘟病抗性。稻瘟病人工接種鑒定菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，為江蘇省稻瘟病菌優(yōu)勢小種及其各群小種的代表菌株。2021年代表菌株是2021-3、2021-43、2021-71、2021-150、2021-497 共5 個菌株；2022 年代表菌株是2022-113、2022-313、2022-406、2022-417、2022-556、2022-586 共6 個菌株。水稻孕穗至破口期采用混合菌株進(jìn)行接種，每品種（品系）任選接5 株，每株接種1 個穗子，每穗注射1 mL孢子懸浮液，并用訂書機(jī)打上顏色標(biāo)記。在水稻成熟后進(jìn)行水稻穗頸瘟的抗性調(diào)查。自然誘發(fā)鑒定種植于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院塔山稻瘟病鑒定基地。

1.3.2 稻瘟病調(diào)查標(biāo)準(zhǔn) 接種鑒定方法以及水稻穗瘟單穗損失率、穗瘟發(fā)病率群體抗性分級標(biāo)準(zhǔn)參照《NY/T 2646—2014 水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評價技術(shù)規(guī)程》［18］執(zhí)行，定義0 級為高抗（HR）、1 級為抗（R）、3 級為中抗（MR）、5 級為中感（MS）、7 級為感（S）、9 級為高感（HS），本研究中定義0～3 級為抗病，5～9級為感病。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，利用SPSS 19 經(jīng)行系統(tǒng)聚類分析。聚類方法采用ward 法，采用歐式距離作為聚類分析的距離測量方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病抗性基因分子檢測與基因分布

利用16 個KASP 功能標(biāo)記（每個基因檢測2 個標(biāo)記，相互驗(yàn)證）檢測65 份糯稻品種（品系）中Pi2、Pi9、Pigm、Pi1、Pikh、Pik、Pi5和Pita等8個抗稻瘟病基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了Pigm外，其他7個抗病基因在糯稻品種（品系）中都有不同程度的分布，但是占比相差較大（圖1）。Pita基因在供試材料中占比最高，達(dá)到了67.7%，其次是Pikh、Pi9、Pi2、Pi5，占比為47.7%、38.5%、27.7%和13.8%。僅有蘇秀889、香血糯515 以及連227-20 等3個品種（品系）攜帶Pik基因，占供試品種的4.6%。僅有EB06 攜帶Pi1，占比1.5%。分析供試的糯稻品種（品系）中攜帶的基因數(shù)量，結(jié)果表明供試的糯稻品種（品系）攜帶0～4 個抗病基因不等，多數(shù)品種（品系）攜帶2～3 個基因，其中攜帶3 個抗性基因的品種（品系）最多，占比40%（圖2）。僅有連糯19105攜帶4個抗性基因。皖糯6 號、圣糯1 號、華糯669、連糯1 號等4 個品種（品系）沒有檢測到抗性基因。

圖1 8個稻瘟病抗性基因在糯稻中分布Fig.1 Distribution of eight blast resistance genes in glutinous rice

圖2 65份檢測材料中攜帶的基因的數(shù)量分布Fig.2 Quantitative distribution of genes carried in 65 test materials

從糯稻品種審定地域來看，國家審定的品種攜帶的抗性基因最多，平均攜帶2.4 個，其次是江蘇審定的品種，平均達(dá)到2.1 個，安徽審定的次之，山東的最少（圖3）。從具體攜帶的抗性基因來看，國審以及江蘇審定的糯稻品種中攜帶Pita的品種明顯高于安徽以及山東審定的品種。安徽審定的糯稻品種攜帶Pi9的比例明顯高于其他3 個審定區(qū)域，而山東審定的糯稻品種攜帶Pi5的比例明顯高于其他3 個審定區(qū)域。山東糯稻品種中不攜帶Pi2基因，Pik基因僅存在于國審以及江蘇審定的品種中（圖4）。從基因組合方式來看（表1），國審品種有5 種不同基因組合方式，且供試品種均攜帶Pita基因。來源于江蘇的糯稻品種有13 種基因組合方式，基因組合類型最豐富，Pi9+Pikh+Pita和Pi2+Pikh+Pita基因組合的品種（品系）最多，分別占江蘇審定品種數(shù)的22.2%、19.4%。安徽審定品種基因組合較為豐富，有10 種基因組合方式，其中Pi9+Pikh+Pita基因組合占比最多，占比22.2%，其次是攜帶單獨(dú)Pi9基因的品種，占比16.7%。山東審定品種（品系）有4 種基因組合模式，攜帶單個抗性基因的品種最多，達(dá)到80%。

圖3 不同審定來源中糯稻稻瘟病抗性基因的個數(shù)Fig.3 Number of blast resistance genes of glutinous rice in different approval channels

圖4 不同審定來源中糯稻稻瘟病抗性基因的分布Fig.4 Distribution of blast resistance genes of glutinous rice in different approval channels

2.2 糯稻品種（品系）稻瘟病抗性鑒定

為了明確糯稻種的抗性情況，本研究對65 個糯稻品種（品系）進(jìn)行了連續(xù)兩年稻瘟病接種鑒定。2021年自然誘發(fā)鑒定以及人工接種鑒定蘇御糯都達(dá)到了7 級以上，2022年東辛人工接種鑒定蘇御糯達(dá)到了9級，而贛榆基地自然誘發(fā)品種蘇御糯發(fā)病未達(dá)7 級且田間整體發(fā)病較輕，故2022 年田間自然誘發(fā)鑒定結(jié)果不作統(tǒng)計。由圖5 可知，2021—2022 年稻瘟病鑒定的發(fā)病比例差異較大。

圖5 不同年際間抗病品種比例Fig.5 Proportion of disease resistant varieties in different years

按照中抗（3 級）及以下定義為抗病標(biāo)準(zhǔn)，2021 年田間自然誘發(fā)鑒定結(jié)果表明抗病品種（品系）比例為41.5%，糯稻品種（品系）在各個發(fā)病級別中分布的較為均勻，其中0 級的材料有10 個，占比15.4%；1、7級的材料各有10 個，各占比13.8%；3、5 級的材料各有8 個，各占比12.3%；9 級的材料有20 個，占比30.8%。

2021 年人工接種鑒定結(jié)果表明抗病品種（品系）比例為24.6%，品種（品系）的發(fā)病級別集中在3～9 級，其中1 級的材料有1 個，占比1.5%，3、7 級的材料各有15個，各占比23.1%；5級的材料最多，共有23個，占比35.4%；9 級的材料有11 個，占比16.9%。2022 年人工接種鑒定結(jié)果表明抗病品種（品系）比例僅為6.2%，品種（品系）的發(fā)病級別集中在7～9 級，占比73.8%，沒有0、1 級的抗病品種（品系）。連續(xù)兩年的接種鑒定結(jié)果表明，糯稻品種（品系）的抗病水平較差，糯稻的安全生產(chǎn)存在較大隱患（圖6）。

圖6 3種鑒定方式下不同發(fā)病級別糯稻品種所占比例Fig.6 Proportion of glutinous rice varieties with different disease levels under three identification methods

從攜帶抗性基因來看，因只有來自安徽的品種EB06攜帶Pi1基因，沒有統(tǒng)計意義，故不作說明。攜帶Pik基因的糯稻品種（品系）連續(xù)兩年的抗病品種（品系）都達(dá)到了66.7%以上，抗病效果較好，可以加強(qiáng)利用。Pita在年際間的抗性表現(xiàn)要好于Pi2、Pi9、Pi5、Pikh，在2022 年接種發(fā)病很重的年份，仍有25%的糯稻品種（品系）達(dá)到了中抗以上。Pi2、Pi9、Pi5、Pikh雖然在2021 年自然誘發(fā)鑒定中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病性，但年際間穩(wěn)定性較差，育種利用時應(yīng)注意與其他抗病基因聚合（圖7）。

圖7 攜帶不同抗稻瘟病基因糯稻品種在3種鑒定方式下抗病品種占比Fig.7 Proportion of resistant varieties of waxy rice carrying different blast resistance genes under three identification methods in different approval channels

從審定來源來看，國審、江蘇審定、安徽審定的糯稻品種在2021 年田間自然誘發(fā)鑒定中抗病的品種數(shù)差異不大，而在2021—2022 兩年接種鑒定結(jié)果中國審糯稻品種的抗性優(yōu)于省審品種，山東審定的糯稻品種抗性較差，沒有中抗及以上的糯稻品種（圖8）。

圖8 不同審定來源中糯稻抗稻瘟病品種比例Fig.8 Proportion of glutinous rice varieties resistant to rice blast in different approval channels in different approval channels

2.3 抗性基因與抗病能力間相關(guān)性分析

供試品種（品系）共20 種基因組合方式（表2），33.3%的供試品種只含1 個或不攜帶任何抗性基因。連續(xù)兩年抗性鑒定結(jié)果表明，不攜帶任何抗性基因的品種（品系），感病比例為100%且病級均為7～9 級，抗性差。只攜帶1 個抗性基因的供試品種（品系），在連續(xù)兩年的人工接種鑒定中，除了攜帶Pita基因品種（品系）在2021年有28.6%的抗病比例，其他均為感病，說明攜帶單個抗性基因的品種（品系）抗性效果較差。攜帶2 個抗性基因Pi2+Pi5、Pi2+Pi1、Pi2+Pik、Pi9+Pita的供試品種（品系）在2021 年自然誘發(fā)鑒定表現(xiàn)較好，抗病品種（品系）比例達(dá)到100%，但是兩年的接種表現(xiàn)較差。攜帶3 個抗性基因的供試品種（品系）抗性表現(xiàn)明顯好于攜帶0～2 個抗性基因的品種（品系），其中Pi2+Pita+Pik、Pi9+Pita+Pik連續(xù)兩年的自然誘發(fā)鑒定和人工接種鑒定抗病品種（品系）的比例均達(dá)到100%，年際間抗病穩(wěn)定。同時，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶Pi2+Pik基因組合的供試品種（品系），連續(xù)兩年人工接種結(jié)果都是感病，當(dāng)加入Pita基因時，抗病效果明顯提升。以上結(jié)果說明Piz基因座（Pi2、Pi9）+Pita+Pik基因組合在糯稻抗稻瘟病育種中具有重要的利用價值。本研究中只有1 個品種（品系）連粳19105 攜帶4 個抗性基因，基因型是Pi2+Pi5+Pikh+Pita，該品種（品系）在年際間表現(xiàn)不穩(wěn)定，說明抗病性不隨攜帶的抗性基因增多而變強(qiáng)。

表2 不同基因組合方式抗病品種（品系）比例Table 2 Ratio of resistant varieties with different gene combinations/%

2.4 抗性基因的聚類分析

根據(jù)聚類分析結(jié)果，將65 個品種（品系）分為4 個大類（圖9）。第Ⅰ類包含連糯19105、連209-3、圣香糯1 號、鹽糯13138、揚(yáng)粳糯6 號、D12、連209-5、武香糯2323、小扇糯、Z1、連209-10、連209-13、連209-16、連209-21、華浙糯1 號共15 個品種（品系），該類品種（品系）包含國家審定、江蘇審定、安徽審定、山東審定等4個地域的品種（品系），分布較廣；第Ⅱ類包括連227-20、連209-17、連209-18、連209-8、連209-12、連209-1、連209-4、連209-9、連209-15、連209-20、中種香糯、兆糯168、連糯18516、皖墾糯5 號、撫晚糯、EB06、蘇秀糯889 等共17 個品種（品系），該類品種（品系）均攜帶Pi2基因，且大部分為連云港市農(nóng)科院育成的糯稻品種（品系），占該類品種（品系）的比例為70.6%，說明對Pi2基因的利用明顯多于其他地區(qū)；第Ⅲ類包括春糯22、LH1948、金粳糯6288、寧香糯1 號、揚(yáng)農(nóng)糯481、武香糯7368、武香糯109、武香糯18196、武香糯9106、豪粳糯、信粳糯631、粳糯2402、富糯628等13個品種（品系），該類全為江蘇、安徽兩省的審定的品種或有關(guān)聯(lián)的品種（品系），其中信粳糯631的母本為皖稻68，說明這兩省的粳糯品種（品系）有部分相似性；第Ⅳ類包括揚(yáng)產(chǎn)糯2號、豐糯99、中粳糯588、豐糯1246、圣武糯0146、皖墾糯1號、金豐糯2號、合肥糯、中研糯135、香血糯515、紫香糯2315、圣稻139、皖墾糯3號、凱糯398、蘇御糯、大華香糯、華糯669、連糯1號、皖糯6號、圣糯1號等20個品種（品系），該類品種（品系）數(shù)最多，以抗性較差的品種（品系）為主。

3 討論

稻瘟病是世界所有水稻產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，抗病基因的挖掘以及抗性效應(yīng)的鑒定是水稻抗病育種利用的基礎(chǔ)［19］。本研究對65 份粳糯稻品種（品系）進(jìn)行連續(xù)兩年進(jìn)行穂頸瘟抗性自然誘發(fā)鑒定以及人工接種鑒定，同時利用KASP標(biāo)記對8個抗稻瘟病基因分子檢測。結(jié)果顯示，2021 年自然誘發(fā)鑒定、2021 年人工接種鑒定以及2022 年人工接種鑒定中抗以上品種（品系）的比例分別是41.6%、24.6%和6.2%，說明粳糯稻品種（品系）的稻瘟病抗性年際間波動大、整體抗病性一般，生產(chǎn)上有較大風(fēng)險。兩年自然誘發(fā)鑒定都比人工接種鑒定的發(fā)病輕，特別是2022 年自然誘發(fā)的對照品種蘇御糯的穗頸瘟抗性未達(dá)7級，整個鑒定圃的發(fā)病較輕，而當(dāng)年人工接種鑒定近94%的品種（品系）為感病品種（品系），推測是由于自然誘發(fā)鑒定受到溫度、濕度、生理小種變異、稻田帶菌量等因素的影響，而人工接種鑒定給每個稻苞中注入相同體積的菌液（1 mL），發(fā)病環(huán)境相對穩(wěn)定，更利于稻瘟病的發(fā)生。

從具體攜帶的抗性基因來看，Pita基因在供試材料中分布頻率最高，達(dá)到了67.7%，且年際間的抗性較為穩(wěn)定。國審以及江蘇審定的糯稻品種中攜帶該基因的品種明顯高于安徽以及山東審定的品種，Pita攜帶比例為100%、77.8%，明顯高于前期研究中對黃淮稻區(qū)常規(guī)粳稻攜帶該基因的結(jié)果［7-8，20］，可能是由于本研究征集的糯稻品種（品系）多數(shù)是近5 年審定或參試的品種（品系），而近年來育種家注重了對Pita基因的利用。攜帶Pi9的品種（品系）占比38.5%，而安徽審定的糯稻品種（品系）攜帶Pi9的比例明顯高于其他3 個審定區(qū)域，占該省供試品種（品系）的60%以上，可能與該省是秈稻主產(chǎn)區(qū)之一，而Pi9在秈稻中分布較廣有關(guān)。陳晴晴等［21］分析2018—2010 年長江中下游秈稻區(qū)試水稻品種（品系）攜帶抗稻瘟病基因分布情況，發(fā)現(xiàn)攜帶Pi9的品種（品系）在三年區(qū)試中占比分別為65%、54.3%以及76.1%。山東審定的糯稻品種（品系）攜帶Pi5的比例明顯高于其他3 個審定區(qū)域，占該省供試品種（品系）60%以上。張善磊等［22］、閆影等［23］研究表明Pi5對穗頸瘟的抗性效果較好，該基因可能為山東地區(qū)的優(yōu)勢抗性基因。以上結(jié)果表明，不同地區(qū)糯稻品種（品系）攜帶抗性基因差異較大，互相引種備案時要注重對稻瘟病抗性的評測。

前人研究表明，攜帶單一抗性的品種（品系）在種植若干年后抗性會逐步喪失［24-25］。本研究中，糯稻品種（品系）攜帶0～4 個抗病基因不等，其中不攜帶任何抗病基因的品種（品系）抗性最差，連續(xù)兩年的人工接種皆為7～9 級。從品種的審定時間來看，同一審定區(qū)域早期審定的品種攜帶抗性基因的數(shù)量較少，如2014 年江蘇審定的連糯1 號、2018 年山東審定的圣糯1 號均不攜帶任何抗稻瘟病基因，而本研究收集的連糯系列糯稻新品系以及國審（近3 年審定）品種均攜帶抗稻瘟病基因，平均達(dá)到2個以上，即新育成品種（品系）攜帶的稻瘟病基因較多。攜帶3 個抗性基因的供試品種（品系）抗性表現(xiàn)明顯好于攜帶0～2個抗性基因的品種（品系）。如攜帶Pi2+Pik基因組合的供試品種（品系），連續(xù)兩年人工接種結(jié)果都是感?。划?dāng)加入Pita基因時，即Pi2+Pita+Pik基因組合連續(xù)兩年的自然誘發(fā)鑒定和人工接種鑒定抗病品種（品系）的比例均達(dá)到100%，年際間抗病穩(wěn)定。此外，香血糯515 攜帶的抗性基因組合是Pi9+Pita+Pik，該品種連續(xù)兩年抗性鑒定皆為中抗及以上。以上結(jié)果說明，Pita+Pik基因組合加上Piz基因座上兩個復(fù)等位基因（Pi2、Pi9），抗稻瘟病水平能夠得到明顯提升。本研究只有1 個品種（品系）攜帶4 個抗病基因，基因型為Pi2+Pi5+Pikh+Pita，該品種只有2021 年人工接種表現(xiàn)為中抗（3 級），2021 自然誘發(fā)鑒定以及2022 人工接種鑒定均為中感（5 級），說明攜帶基因的數(shù)目與抗病性之間沒有密切關(guān)聯(lián)性，這與周坤能等［26］、鄧釗等［27］和王軍等［28］的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究通過分析65 個糯稻品種（品系）的稻瘟病抗性，以及抗性基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)糯稻品種（品系）的稻瘟病抗性較差，不同審定來源的品種（品系）攜帶的抗性基因差異較大。“Pi2+Pita+Pik”、“Pi9+Pita+Pik”年際間抗病穩(wěn)定，可作為改良粳糯稻瘟病抗性主要的基因組合。