王 馳 黃 偉 龔 玲 何 淙 鄧鋼橋 鄧子牛， 龍桂友， ， 李 娜， ，

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128；2湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南 長沙 410125；3國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙 410128）

冰糖橙是湖南省黔陽縣從普通甜橙實生變異中選出的新品種。隨著人們生活水平的提高，對柑橘果實大小、口感、外觀、上市時間、高糖和低酸等關(guān)注程度逐漸上升。因此，篩選不同成熟期優(yōu)良冰糖橙品種或株系是改善其品種結(jié)構(gòu)、提高市場競爭力的有利手段之一。輻射誘變具有突變率高、突變譜寬、后代性狀穩(wěn)定快、育種周期短等優(yōu)點，目前已成為獲得新種質(zhì)資源的有效途徑之一，其中60Co-γ 射線是輻射誘變中最為常用的物理輻射源［1-2］。通過輻射誘變獲得早熟突變體是提高市場競爭力的有利手段之一［3］，如漆巨容等［4］通過60Co-γ射線輻照誘變從江津地區(qū)的實生甜橙桐子柑中選育得到了早熟甜橙新品種渝早橙；黃柳根［5］用60Co-γ 輻射錦橙接穗，獲得了早熟、無核少核的突變系。

柑橘遺傳鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)標(biāo)記法、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記法、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記等。其中形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到作物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、遺傳變異評價和品種鑒定等諸多領(lǐng)域［6］。分子標(biāo)記最常用的方法為簡單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSR）和插入缺失（insertion deletion，InDel）標(biāo)記［7-8］。

柑橘的果實成熟是一個極其復(fù)雜的生理和生化過程，其中蔗糖和檸檬酸代謝以及調(diào)控成熟相關(guān)基因的時空表達(dá)都會對柑橘果實成熟產(chǎn)生重要的作用［9］。柑橘果實中，可溶性固形物和可滴定酸含量及固酸比的變化是果實成熟的重要評價指標(biāo)［10］。續(xù)麗紅等［11］發(fā)現(xiàn)，早熟臍橙贛南早果實成熟時較同一時期的紐荷爾臍橙可溶性固形物含量高，可滴定酸含量低，固酸比值大，早熟性狀明顯。柑橘果實可溶性固形物的主要構(gòu)成是糖分，且以蔗糖為主，可滴定酸以檸檬酸為主，隨著果實發(fā)育成熟，糖含量增加，酸含量降低［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，果實中檸檬酸積累代謝相關(guān)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）和檸檬酸合成酶（citrate synthase，CS）的表達(dá)或酶活性與果實發(fā)育成熟期間果實中檸檬酸含量呈正相關(guān)［13-14］，蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphatesynt，SPS）是蔗糖合成過程中的限速酶，其活性與蔗糖積累呈正相關(guān)［15-16］。此外石彩云等［17］證實了檸檬酸轉(zhuǎn)運到液泡與質(zhì)子泵有關(guān)。Feng 等［18］人證實了檸檬酸轉(zhuǎn)運基因CsPH8的低表達(dá)是低酸柑橘品種檸檬酸含量較低的主要原因。Guo等［19］對不同品系暗柳橙和紅暗柳果實的有機酸合成、積累和代謝相關(guān)基因研究，認(rèn)為CsPH8基因低表達(dá)可能是紅暗柳品種檸檬酸積累低的重要原因。

鑒于此，本研究比較早熟突變體與對照的物候期、春梢葉片、花、果實外觀性狀，果實內(nèi)在品質(zhì)及糖酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)等的差異；應(yīng)用DNA 分子標(biāo)記鑒定遺傳變異，評價該突變體的早熟性狀。旨在分析冰糖橙早熟突變體遺傳上是否發(fā)生了改變，果實內(nèi)在品質(zhì)變化是否與果實提早著色一致并達(dá)到品種固有特性，為進(jìn)一步選育和登記成早熟冰糖橙新品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

早熟突變體（mutant）和冰糖橙對照（wild-type）均來自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘改良中心甜橙誘變育種基地。早熟突變體為冰糖橙枝條經(jīng)60Co-γ射線輻射處理獲得，劑量為30 Gy；2012 年春輻射誘變枝條和對照枝條均高接在6 年生枳砧太田椪柑成年樹上，2015 年開始結(jié)果，一般田間肥水管理和病蟲害防治。

1.2 DNA提取及分子標(biāo)記

使用CTAB 法提取柑橘葉片DNA［20］，SSR 分子標(biāo)記引物信息參考文獻(xiàn)［21］；Indel 分子標(biāo)記引物信息參考文獻(xiàn)［22］。PCR 擴增體系為20 μL：1 μL DNA 模板、2×Rapid Taq Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL，補充ddH20 至總體積為20 μL。程序為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，擴增產(chǎn)物4 ℃條件下保存。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物，銀染色后觀察記錄擴增結(jié)果。

1.3 物候期觀測、葉片和花器官性狀測定

參考張春苗等［23］的方法觀察記載物候期，依據(jù)《柑橘種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［24］測定春梢葉片的性狀和花器官的形態(tài)特征。

1.4 果實性狀測定

謝花后70 d 開始每隔30 d 測量1 次，果實成熟期開始每15 d 測量1 次。電子天平稱量果實單果質(zhì)量；游標(biāo)卡尺測量果實橫經(jīng)和縱經(jīng)，CR-400 色差儀（柯尼卡美能達(dá)投資有限公司，武漢）測定每個果實赤道面3個方向的色差值［L*值、a*值、b*值和色差指數(shù)（color index，CI）］，PAL-BX/ACID1 糖酸一體機（愛宕科學(xué)儀器有限公司，廣州）測定可溶性固形物（total soluble solids，TSS）和可滴定酸（titratable acids，TA）含量，參考Lu等［25］的方法測定蔗糖和檸檬酸含量。

1.5 RNA 提取和實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, qRT-PCR）分析

花后160、175、190 和205 d 采集早熟突變體和冰糖橙對照果實樣品，取果肉于-80 ℃條件下保存。采用SteadyPureRNA 提取試劑盒（艾科瑞生物，長沙）提取果肉汁胞總RNA，紫外分光光度計（梅特勒托利多科技有限公司，上海）測定RNA 濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA 質(zhì)量檢測，用Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾科瑞生物，長沙）合成cDNA。qRT-PCR 使用的特異引物見表1，由北京擎科生物公司合成，使用CFX 96 熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，美國）進(jìn)行qRT-PCR 擴增，Actin作為內(nèi)參基因，3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 20 分析數(shù)據(jù)（P＜0.05），GraphPad Prism 8.0.2作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片和花器官性狀比較

與對照相比，早熟突變體春梢葉片長和寬顯著增加，葉柄長、翼葉長和寬沒有顯著變化，而春梢長度顯著變短（表2）。早熟突變體與冰糖橙（對照）均為完全花，由花瓣、雌蕊、雄蕊、萼片和花托組成（圖1）。與對照相比，早熟突變體的花瓣長和寬顯著變小，雄蕊數(shù)顯著增多，雌蕊長度和雄蕊長度顯著變短，花瓣數(shù)量沒有顯著差異（表3）。

圖1 早熟突變體與對照的花形態(tài)特征Fig.1 Flower morphological characteristics of mutant and wild-type Bingtang sweet orange

表2 早熟突變體與對照春梢長度及葉片性狀比較Table 2 Comparison of spring shoot length and leaves of mutant with wild-type Bingtang sweet orange

表3 早熟突變體與對照的花器官性狀比較Table 3 Comparison of flower morphology traits of mutant with wild-type Bingtang sweet orange

2.2 果實大小比較

早熟突變體果實的橫徑、縱徑和單果重在發(fā)育與成熟各時期均大于冰糖橙對照，在花后175～205 d 時更為明顯，而果實形狀與對照果實沒有明顯不同，均呈圓球形（表4）。

表4 果實成熟過程中早熟突變體與對照的果實大小變化Table 4 Changes in fruit size of mutant and wild-type Bingtang sweet orange

2.3 果實發(fā)育過程中果皮色澤變化比較

早熟突變體果實在花后160 d 褪綠，175 d 轉(zhuǎn)為黃色，190 d（11 月上旬）完全著色轉(zhuǎn)為橙黃色，果肉顏色轉(zhuǎn)為橙色；對照冰糖橙果實在花后175 d褪綠，190 d轉(zhuǎn)為黃色，205 d（11 月下旬）完全著色轉(zhuǎn)為橙黃色，果肉顏色轉(zhuǎn)為橙色（圖2-E）。果皮色差的明亮度（L*值）、紅綠度（a*值）和黃藍(lán)度（b*值）從花后130 d開始與對照冰糖橙均有顯著性差異（圖2-A～C）。尤其是代表紅綠顏色轉(zhuǎn)變的a*值（圖2-B）和色差指數(shù)（圖2-D）表明早熟突變體果實在花后175 d由負(fù)值轉(zhuǎn)為正值，對照冰糖橙在花后205 d由負(fù)值轉(zhuǎn)為正值。

圖2 早熟突變體和冰糖橙對照果實發(fā)育成熟過程中果皮果肉顏色變化Fig.2 Changes in color of pericarp and pulp during fruit ripening in mutant and wild-type Bingtang sweet orange

2.4 物候期比較

冰糖橙早熟突變體物候期表現(xiàn)為3 月11 日萌芽，4 月17 日初花期，4 月20 日盛花期，4 月25 日終花期，5 月6 日第一次生理落果，6 月10 日第二次生理落果，11 月6 日果實成熟，較冰糖橙（對照）分別提早4、2、2、3、4、5和15 d（表5）。

表5 早熟突變體和冰糖橙對照果實物候期比較Table 5 Phenological comparison of mutant and wild-type Bingtang sweet orange

2.5 早熟突變體遺傳性鑒定

對早熟突變體和冰糖橙對照的DNA 用InDel 引物（圖3-A）和SSR 引物（圖3-B）分別擴增并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，均擴增出差異條帶。其中InDel引物1擴增的差異條帶位于750～1 000 bp，InDel引物2擴增的差異條帶位于200～500 bp，InDel 引物3 擴增的差異條帶位于100～200 bp（圖3-A）。SSR 引物P68 擴增的差異條帶位于100～300 bp，SSR 引物P179 擴增的差異條帶位于300～400 bp（圖3-B）。

圖3 SSR和InDel引物聚丙烯酰胺擴增結(jié)果Fig.3 SSR and InDel primers amplification results on polyacrylamide gel

2.6 果實發(fā)育過程中糖酸含量變化比較

隨著冰糖橙（對照）果實生長發(fā)育與成熟，果實中的可溶性固形物含量呈現(xiàn)增加的趨勢，花后205 d 成熟時增加幅度增大并達(dá)到較高含量14.50 °Brix；早熟突變體果實的可溶性固形物含量在花后160 d 時與對照果實基本一致，175 d 時顯著高于對照，相差1.00 °Brix，至190 d 時更是大幅增加到對照果實成熟期的含量14.53 °Brix，較同期對照高3.30 °Brix，205 d時達(dá)到15.97 °Brix（表6）。另一方面，兩者果實可滴定酸含量隨著果實生長發(fā)育與成熟而逐漸降低，對照冰糖橙果實成熟時（花后205 d）含酸量0.61%，早熟突變體果實含酸量從花后160 d起均顯著低于對照果實，190 d 時降至0.46%，并在190～205 d 穩(wěn)定在該水平。固酸比隨著果實生長發(fā)育而增大，對照冰糖橙果實固酸比從花后190 d 時的13.98 到花后205 d 成熟時快速增大到23.77，早熟突變體果實固酸比從花后175 d 的18.37 到190 d 時快速增大到31.59，到205 d 時略有增加，為35.48。

2.7 果實發(fā)育過程中蔗糖和檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析

早熟突變體果實中磷酸蔗糖合酶基因CsSPS1表達(dá)水平在花后160～190 d顯著高于冰糖橙對照（圖4-A），另一個合酶基因CsSPS4表達(dá)水平在花后160～205 d均顯著高于對照，并在190 d 時表達(dá)量最高（圖4-B），早熟突變體和冰糖橙對照果實的酸性轉(zhuǎn)化酶基因CsAI在花后190 d的表達(dá)趨勢基本一致（圖4-C），蔗糖轉(zhuǎn)運基因CsSUT1表達(dá)高峰在冰糖橙對照果實中出現(xiàn)在花后205 d即成熟時，早熟突變體則出現(xiàn)在花后160 d，提前了45 d（圖4-D）。

圖4 早熟突變體和對照冰糖橙果實成熟過程中糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)Fig.4 Expression of sugar metabolism related genes during fruit ripening of mutant and wild-type Bingtang sweet orange

突變體果實發(fā)育成熟過程中檸檬酸合成基因CsPEPC表達(dá)趨勢和對照冰糖橙基本一致（圖5-A），另一個檸檬酸合成基因CsCS1的表達(dá)水平顯著低于對照，尤其是花后160 和175 d 時的表達(dá)水平只有對照的50.255%和19.24%（圖5-B），而果實檸檬酸降解基因CsACO3在175 和190 d 時的表達(dá)水平顯著高于對照果實（圖5-C），檸檬酸液泡貯藏基因CsPH8在花后160 d時表達(dá)水平僅為對照的21.76%，在花后175 d 低于對照，在花后190 d時高于對照，而花后205 d時兩者變幅不大（圖5-D）。

圖5 早熟突變體和對照冰糖橙果實成熟過程中檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)Fig.5 Expression of citrate metabolism related genes during fruit ripening of mutant and wild-type Bingtang sweet orange

3 討論

3.1 性狀遺傳變異分析

柑橘常用的遺傳鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)標(biāo)記法和分子標(biāo)記法［26］，利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定物種性狀遺傳多樣性是簡單、直觀和快捷的方法［27］。Fang 等［8］對柑橘中種內(nèi)種間的特異性開發(fā)InDel 標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)InDel 標(biāo)記物對種間和種內(nèi)變異和鑒定分析均有效，有望應(yīng)用于柑橘的種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析、遺傳多樣性評估和標(biāo)記輔助育種。胡冬梅等［28］開發(fā)了用于柑橘芽變材料區(qū)分的高效SSR 位點實現(xiàn)了柑橘芽變材料的高效區(qū)分。此外，前人發(fā)現(xiàn)InDel 和SSR 標(biāo)記可以共同用于遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究。García-Lor 等［7］利用InDel 和SSR 標(biāo)記在柑橘遺傳多樣性種間結(jié)構(gòu)中進(jìn)行比較應(yīng)用。另有研究表明，利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記結(jié)合DNA 分子標(biāo)記鑒定新品種或株系的遺傳變異更準(zhǔn)確。如李娜等［26］發(fā)現(xiàn)冰糖橙新品種橘湘瓏的植物學(xué)特征和物候期與對照不同，并且SSR 標(biāo)記結(jié)果顯示橘湘瓏與對照在DNA 遺傳水平上有差異。本研究結(jié)果與前人研究相似，篩選的輻射誘變突變體物候期和植物學(xué)特征與對照不同，果實著色提早15～20 d，SSR 和InDel 分子標(biāo)記結(jié)果中存在特異性差異條帶，說明該突變體為在形態(tài)學(xué)特征與DNA 分子水平均發(fā)生了遺傳改變的早熟突變體，對進(jìn)一步選育和登記早熟冰糖橙新品種奠定了分子遺傳的基礎(chǔ)。

3.2 早熟性狀與糖酸含量變化及相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系

柑橘果實早熟性表現(xiàn)為外觀顏色提早轉(zhuǎn)變?yōu)槠贩N固有顏色，果實中可溶性固形物與可滴定酸含量以及固酸比同步達(dá)到品種固有品質(zhì)特性［29］。如贛南早成熟時可溶性固形物、蔗糖含量及固酸比較同一時期的對照紐荷爾臍橙高，可滴定酸和檸檬酸含量則低，早熟品種糖酸含量優(yōu)于晚熟品種［11］。本試驗中，冰糖橙早熟突變體果實顏色比對照提前15 d 完全轉(zhuǎn)變成橙黃色，同時花后190 d 時果實可溶性固形物含量、可滴定酸含量以及固酸比，為14.53 °Brix、0.46%、31.59，分別達(dá)到、低于和高于對照果實正常成熟時（花后205 d）的14.50 °Brix、0.61%、23.77，果實外觀顏色與內(nèi)在品質(zhì)同步達(dá)到冰糖橙正常成熟度，說明突變體果實提早著色與果實糖酸內(nèi)在品質(zhì)變化一致，內(nèi)外同步達(dá)到成熟。

蔗糖和檸檬酸是柑橘果實可溶性固形物、可滴定酸的主要組成成分，蔗糖與檸檬酸的積累和降解與合成、降解、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)［30］。如Feng等［18］發(fā)現(xiàn)CsPH8在低酸柑橘品種紅暗柳橙果實中低表達(dá)，而石彩云等［17］研究表明CsPH8的低表達(dá)是突變柑橘果實可滴定酸與檸檬酸含量顯著降低的主要原因。本試驗中突變體果實2 個蔗糖合成相關(guān)基因CsSPS1和CsSPS4的表達(dá)水平顯著高于對照，蔗糖轉(zhuǎn)運基因CsSUT1表達(dá)高峰較對照提早了45 d，可能導(dǎo)致果實中蔗糖合成多、轉(zhuǎn)運早，與花后175～205 d 可溶性固形物含量顯著高于對照的結(jié)果相吻合。這與徐文欣［31］對巖溪晚蘆及其早熟芽變果實進(jìn)行分析結(jié)果相似，表明早熟芽變比對照的CsSUT1和CsSPS的表達(dá)量高?；ê?60 和175 d 時的突變體果實檸檬酸合成基因CsCS1表達(dá)水平只有對照的50.25%和19.24%，花后175 和190 d 時檸檬酸降解基因CsACO3的表達(dá)水平顯著高于對照，檸檬酸液泡貯藏基因CsPH8花后160 d時表達(dá)水平僅為對照的21.76%，突變體酸相關(guān)基因表達(dá)可能導(dǎo)致檸檬酸合成少、降解快、貯運少，與突變體果實含酸低、降酸早的品質(zhì)變化是一致的。該研究結(jié)果為突變體的進(jìn)一步選育和登記早熟冰糖橙新品種與后續(xù)早熟研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

相較對照而言，輻射誘變冰糖橙早熟突變體春梢顯著變短，主要物候期提早2～5 d，成熟時果實較大，果皮和果肉提前15 d轉(zhuǎn)色成橙黃色和橙色，表現(xiàn)為低酸、降酸早、固酸比值高，蔗糖合成多、轉(zhuǎn)運早，檸檬酸合成少、降解快、貯運少；SSR與Inder標(biāo)記表明DNA 發(fā)生了遺傳改變。綜上，輻射誘變獲得的突變體為植物性狀、生物特性、DNA產(chǎn)生遺傳改變、果實降酸早、含酸低、固酸比高、11月上旬完全著色成熟的早熟冰糖橙變異。