趙慧芳,李琳琳,關(guān)振霆,譚俊珍,張 帥

(天津中藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,天津 301617)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是當(dāng)今最常見的惡性腫瘤之一,在我國其發(fā)病率僅次于肺癌及胃癌,位列惡性腫瘤第3位。目前CRC的治療強(qiáng)調(diào)以手術(shù)為主,輔以放療、化療、靶向治療、免疫治療等手段。“藥食同源”中藥既是食品又是藥品,具有飽腹之功、療病之效[1],對降低CRC的發(fā)病率和死亡率具有重要的意義。研究表明,覆盆子[2]、馬齒莧[3-4]、砂仁[5]等藥食同源中藥對腸炎及 CRC有治療作用。蘋果酸(Malic acid )是其活性成分之一,抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,還可以降低化療藥物的毒副作用,提高化療藥物的使用劑量[6]。但目前關(guān)于蘋果酸對腸道疾病的治療效果具體分子機(jī)制研究尚少。因此,我們將對蘋果酸對CRC的抑制作用及其分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、試劑與儀器人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo、HCT8和HCT116,均保存于本實(shí)驗(yàn)室。蘋果酸二甲酯(Dimethyl malate, DMM)購自美國Sigma-Aldrich公司,ERK1/2和p-ERK1/2抗體購自Proteintech Group公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo、HCT8和HCT116均為貼壁細(xì)胞,含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于含有5%的CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2細(xì)胞計(jì)數(shù) 為了檢測蘋果酸處理后細(xì)胞的增殖情況,將LoVo和HCT8細(xì)胞接種于24孔板(1×104個(gè)/孔),經(jīng)不同濃度蘋果酸處理后,每24 h使用臺盼藍(lán)排除法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),持續(xù)4 d,繪制生長曲線。

1.2.3細(xì)胞克隆形成 為了檢測蘋果酸處理后細(xì)胞的克隆形成率,將LoVo和HCT8細(xì)胞接種于6孔板(1×104個(gè)/孔),經(jīng)不同濃度蘋果酸處理后,在5% CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)7 d,加入甲醇固定15 min,結(jié)晶紫染色15 min,洗去浮色,晾干,拍照并計(jì)算克隆形成率。

1.2.4蛋白免疫印跡分析 不同濃度蘋果酸與HCT116細(xì)胞分別共同孵育48 h后,收集細(xì)胞,RIPA裂解并提取總蛋白,進(jìn)行濃度測定、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育,最后使用ECL發(fā)光試劑在暗室曝光。

2 結(jié)果

2.1 蘋果酸對LoVo和HCT8細(xì)胞增殖的影響LoVo細(xì)胞分別用0、2.5、5及10 mmol·L-1的蘋果酸處理,HCT8細(xì)胞分別用 0、2、4及8 mmol·L-1的蘋果酸處理。細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,蘋果酸明顯抑制LoVo和HCT8細(xì)胞的生長速度,且具有劑量相關(guān)性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),見Tab 1 和 Tab 2。說明蘋果酸可能抑制結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖能力。

2.2 蘋果酸對LoVo和HCT8細(xì)胞克隆形成的影響根據(jù)Tab 3、4結(jié)果,蘋果酸組細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯低于對照組(P<0.01),且呈現(xiàn)劑量依賴性。說明蘋果酸對結(jié)直腸癌的克隆形成能力具有抑制作用。

2.3 蘋果酸對HCT116細(xì)胞中ERK1/2磷酸化的影響為了進(jìn)一步探討蘋果酸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制,通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度蘋果酸處理前后的HCT116細(xì)胞中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平。結(jié)果顯示,2、4和8 mmol·L-1的蘋果酸明顯減小 p-ERK1 /2與 ERK1 /2的比值,見Tab 5。提示蘋果酸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖有可能與 ERK1 /2 通路有關(guān)。

Tab 1 Effect of malic acid on cell proliferation of LoVo cells n=3)

Tab 2 Effect of malic acid on cell proliferation of HCT8 cells n=3)

Tab 3 Effect of malic acid on colony formation level protein level of LoVo cells n=3)

Tab 4 Effect of malic acid on colony formation level protein level of HCT8 cells n=3)

Tab 5 Effect of malic acid on protein level of

3 討論

CRC是當(dāng)今世界第四大常見的腫瘤類型[7],我國CRC發(fā)病率及死亡率也均呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。CRC的常規(guī)臨床治療手段為手術(shù)及放化療等,然而,由于手術(shù)應(yīng)激、放化療的毒副作用及藥物耐藥等情況的出現(xiàn),尋找毒性更低、效果更好的治療方法仍十分重要。隨著研究的深入,藥食同源中藥在抗腫瘤治療中的優(yōu)勢逐漸顯露出來。蘋果酸作為一種藥食同源中藥單體,本研究發(fā)現(xiàn),蘋果酸對CRC細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用,有望成為前景可觀的抗癌藥物。

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶( extracellular signal regulated kinase, ERK)是介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)的重要細(xì)胞信號分子,其參與從質(zhì)膜到胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),是細(xì)胞增殖、分化、凋亡等的重要調(diào)節(jié)因素,在CRC發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn),蘋果酸明顯降低ERK1/2的磷酸化水平,推測蘋果酸抑制CRC細(xì)胞增殖與ERK1/2通路有關(guān)。后續(xù)我們將對此分子機(jī)制開展進(jìn)一步研究。