蔡小凡,黃潔波,邢 玥,符欣漪,鄧躍毅,鐘逸斐,吳慧娟

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院,上海 200032; 2.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀區(qū)中心醫(yī)院,上海 200062;3.復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理系,上海 200032)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最為常見的微血管并發(fā)癥,發(fā)病率約為20%～40%,并已成為全球范圍內(nèi)導致慢性腎臟病及終末期腎病的首要病因[1-2]。DN在病程中可涉及腎小球及腎小管間質(zhì)的諸多病理變化,如細胞外基質(zhì)增多、足細胞表型改變及腎纖維化等,推動著DN向終末期腎病的進展。Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein,YAP)是Hippo信號通路下游的重要效應分子[3],可直接調(diào)控包括結(jié)締組織生長因子(CTGF)在內(nèi)的多種細胞因子的轉(zhuǎn)錄[4]。其在慢性腎臟病中的作用近年來開始受到諸多學者的關(guān)注。DN的眾多病理進程,如足細胞損傷、系膜細胞增生及腎間質(zhì)纖維化等[4-6]均有YAP的參與。

益腎化濕顆粒(Yishen Huashi Granule,YSHS)(國藥準字Z20090250)源于李東垣《脾胃論》中的經(jīng)典方劑“升陽益胃湯”,具有升陽補脾、益腎化濕、利水消腫的功效,主治以脾腎虧虛為主的DN,臨床療效及安全性較好[7]。國內(nèi)學者采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對YSHS主要成分進行了準確定性,共鑒定出包括香豆素類、三萜類、黃酮類化合物在內(nèi)的主要成分68個。其中,柴胡皂苷A、黃芪甲苷III/IV、澤瀉醇A等與腎病的預測靶點有良好的結(jié)合活性,并能參與晚期糖基化產(chǎn)物-中膜產(chǎn)物受體信號通路在內(nèi)的多條通路。說明該藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點[8]。另有研究表明,YSHS可上調(diào)DN小鼠nephrin、podocin等足細胞功能蛋白[9],而下調(diào)CTGF的過表達則能改善足細胞功能蛋白的表達減少[10]。本研究從YAP/CTGF信號通路入手,觀察YSHS對DN小鼠YAP的調(diào)控作用及由此對CTGF與足細胞功能蛋白nephrin、wilm′s tumor 1(WT1)及podocalyxin mRNA表達的影響, 探討該藥改善DN腎小球病理損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 8周齡雄性C57BL6小鼠,SPF級,體質(zhì)量(22～25) g,購買自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號:SCXK(滬)2018-004,合格證號:20180004025908。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房中,環(huán)境溫度(23～25)℃,濕度40%～70%,分籠飼養(yǎng),自由進水,保持良好通風環(huán)境,標準動物干飼料,12 h交替照明。

1.1.2藥物 益腎化濕顆粒(YSHS),由廣州康臣藥業(yè)有限公司提供。組分:人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、澤瀉、半夏、羌活、獨活、防風、柴胡、黃連、白芍、陳皮、炙甘草、生姜、大棗,10 g/袋。維替泊芬(vertepofin,VP)(編號SML0534),購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)(S0130)購自美國Sigma-Aldrich公司。小鼠血肌酐(serum creatinine,Scr)試劑盒(C011-2-1)、尿素氮(blood urea nitrogen,Bun)試劑盒(編號C013-2-1)及尿蛋白(urine protein,Upro)試劑盒(C035-2-1),均購自南京建成生物工程研究所。YAP抗體(14074T)及磷酸化-YAP絲氨酸127抗體(p-YAP S127)(13008T)均購自美國CST公司,CTGF抗體(ab6992)購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1模型建立及分組給藥 從28只C57BL/6小鼠中隨機抽取7只作為對照組,其余21只通過STZ誘導建立DN小鼠模型。采取連續(xù)5 d腹腔注射2%的STZ (50 mg·kg-1、0.1 mol·L-1、pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液),其中首次注射前禁食24 h,d 2～5注射前禁食6 h,對照組給予等體積溶媒。末次注射72 h后尾靜脈取血檢測血糖,以血糖≥16.7 mmol·L-1,尿蛋白定量超過正常對照組,且大于原24 h尿蛋白量150%(連續(xù)出現(xiàn)2次以上)[11]為DN模型制備成功。隨機分為模型組、YSHS組和VP組,每組7只,第8周結(jié)束后開始干預。其中YSHS組給予YSHS每日一次性灌胃5 g·kg-1,VP組為隔日腹腔一次性注射25 mg·kg-1,對照組與模型組給予等體積生理鹽水一次性灌胃。

1.2.2尿蛋白、血肌酐及尿素測定 留取給藥前后小鼠尿液標本雙縮脲法測定Upro。干預結(jié)束后處死小鼠,腹主動脈取血,3 000 r·min-1離心15 min取上層血清,分別用肌氨酸氧化酶及脲酶法檢測Scr及Bun水平。

1.2.3HE染色觀察 取小鼠腎皮質(zhì)組織,10%中性甲醛溶液內(nèi)固定24 h后,常規(guī)脫水、二甲苯透明及石蠟包埋,制成4 μm切片。行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,二甲苯透明,烤干后中性樹膠封片,光鏡觀察腎小球系膜區(qū)改變情況。根據(jù)腎小球系膜區(qū)增寬程度分為輕度(系膜區(qū)寬度<毛細血管襻直徑)、中度(系膜區(qū)寬度>毛細血管襻直徑) 及重度(系膜基質(zhì)擠壓襻呈結(jié)節(jié)、團塊或分葉狀)進行評估。

1.2.4Western blot檢測 采用Western blot法對YAP、p-YAP S127及CTGF的蛋白表達進行測定。取部分腎皮質(zhì)組織提取總蛋白。100 ℃ 10 min蛋白變性后加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)入PVDF膜。用5%脫脂奶粉TBST浸泡PVDF膜,室溫搖床封閉1 h后,加入一抗兔抗YAP抗體(1 ∶1 000),抗p-YAP S127抗體(1 ∶1 000),抗CTGF抗體(1 ∶1 000),并以GAPDH(1 ∶1 000)為內(nèi)參在4 ℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜3次,每次5 min,加入羊抗兔IgG-HRP(1 ∶5 000),37 ℃孵育1 h,再次洗滌3次。顯影曝光后ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.2.5RT-PCR檢測 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計合成(Tab 1)。采用TRIzol Reagent一步法提取總RNA后,稀釋并逆轉(zhuǎn)錄,將制備好的cDNA用于PCR擴增,各指標均擴增40個循環(huán),以β-actin為內(nèi)參,YAP、CTGF、nephrin、WT1和podocalyxin的mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。引物序列,見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

Tab 2 Comparison of kidney function and urine protein level in different groups of

Fig 1 Effect of Yishen huashi Granule on pathological changes in glomerulus of mice(HE ×400)

2 結(jié)果

2.1 YSHS對DN小鼠腎功能、尿蛋白的影響如Tab 2所示,與對照組相比,第12周時,模型組小鼠Scr及Bun水平均明顯升高(P<0.01)。YSHS組、VP組相較于模型組,Scr、Bun水平均有較明顯改善(P<0.01,P<0.05)。與同期對照組相比,DN小鼠在第8周和第12周時的Upro均明顯升高(P<0.01),經(jīng)YSHS、VP治療4周后,兩組各自的Upro較同期模型組均明顯下降(P<0.01)。

2.2 YSHS對DN小鼠腎小球病理形態(tài)學的影響如Fig 1所示,對照組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常。與對照組相比,模型組腎小球系膜區(qū)基質(zhì)明顯增多,系膜區(qū)寬度>毛細血管襻直徑(中度增寬);而經(jīng)YSHS與VP治療后,上述病理表現(xiàn)較模型組有所減輕。

2.3 YSHS對DN小鼠腎皮質(zhì)YAP、p-YAP S127及CTGF蛋白表達的影響Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組小鼠YAP、p-YAP S127及CTGF蛋白表達明顯增加(P<0.01)。經(jīng)VP治療后YAP、p-YAP S127和CTGF的蛋白表達較模型組明顯下降(P<0.01)。而經(jīng)YSHS治療后,三者的表達較模型組亦有明顯下降 (P<0.01),見Fig 2。

2.4 YSHS對DN小鼠腎皮質(zhì)YAP與CTGF mRNA表達的影響如 Fig 3所示,與對照組比較,模型組YAP與CTGF的mRNA表達量均有所上升(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,YSHS組兩者的mRNA均有所下降(P<0.01),其中CTGF的mRNA表達量亦低于對照組水平(P<0.01)。與對照組、模型組比較,VP組兩者的mRNA表達量明顯下降(P<0.01),其中YAP的mRNA表達量亦明顯低于YSHS組(P<0.01)。

Fig 2 The protein expression of YAP, p-YAP S127 and CTGFin renal cortex among each group n=7)

2.5 YSHS對DN小鼠腎皮質(zhì)nephrin、WT1、podocalyxin mRNA表達的影響如Fig 4所示,與對照組比較,模型組nephrin、WT1和podocalyxin的mRNA表達量明顯下降(P<0.01)。與模型組比較,YSHS組三者的mRNA表達量均明顯上升(P<0.01),而VP組nephrin、podocalyxin的mRNA表達量有所上升(P<0.01,P<0.05),但WT1的mRNA表達量與模型組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

Fig 3 Relative mRNA expression of YAP and CTGF in renal cortexamong each group n=7)

Fig 4 Relative mRNA expression of nephrin, WT1 and podocalyxin

3 討論

DN的主要臨床表現(xiàn)有蛋白尿、低蛋白血癥性水腫及腎功能不全,故中醫(yī)屬于“尿濁”、“水腫”、“虛勞”等范疇,病機上則多因脾失健運,并由脾及腎,導致脾腎兩虛而引發(fā)。益腎化濕顆粒秉承“升陽益胃湯”方義,是從脾論治的代表方劑。臨床研究表明,該藥與利格列汀聯(lián)用可有效降低DN患者腎功能相關(guān)指標[7]。本研究中,經(jīng)YSHS治療后的DN小鼠,尿蛋白濃度、血肌酐及尿素水平上均有明顯下降,再次證實了該藥在減少蛋白尿及延緩腎功能進展方面的作用。

YAP是Hippo信號通路下游的核心元件之一,具有通過進入細胞核促進轉(zhuǎn)錄增殖來調(diào)節(jié)細胞生長、分化及凋亡的作用。該作用又與YAP的磷酸化密切相關(guān)。通常,YAP以磷酸化的形式滯留在胞漿中,只有去磷酸化的YAP才能入核發(fā)揮相應的生物學功能。YAP可參與DN病程進展過程中的多個環(huán)節(jié)。在db/db小鼠中,YAP表達增多是導致腎小球系膜細胞增生及系膜區(qū)基質(zhì)增多的重要原因[5]。腎近曲小管上皮細胞中YAP的活化可促進DN腎間質(zhì)纖維化,而上述進程可通過YAP抑制劑VP的干預得到改善[4]。此外,過表達的YAP還能誘使足細胞重新進入細胞周期并發(fā)生去分化,造成足細胞表型的改變[12]。與上述文獻報道相符,本研究中DN小鼠腎皮質(zhì)組織中的YAP在蛋白與mRNA表達水平上均明顯升高,經(jīng)YSHS治療后,上述指標均出現(xiàn)不同程度的下降且腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增多情況亦得到改善,說明該藥具有下調(diào)YAP表達,以減輕腎小球系膜區(qū)病理損傷作用。我們還發(fā)現(xiàn),經(jīng)YSHS治療后p-YAPS127蛋白表達亦較模型組有明顯下降。這從一定程度上提示,YSHS對DN的治療作用并非通過將YAP滯留于胞漿以減少YAP入核的形式實現(xiàn),而主要是通過減少YAP的表達來完成。

作為一種重要的纖維化誘導因子,CTGF能促進DN中腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增多、腎小球硬化及間質(zhì)纖維化的發(fā)生。在DN大鼠腎組織及DN患者腎小球中,均可以發(fā)現(xiàn)CTGF在mRNA表達水平的升高[13-14]。足細胞損傷導致相關(guān)功能蛋白表達水平下降是DN的又一重要病理標志[15],而該過程亦與CTGF密切相關(guān)[16]。通過特異性抗體清除CTGF,可有效提高DN中nephrin等足細胞蛋白的表達[10]。而相關(guān)研究已證實,CTGF可直接受到Y(jié)AP的調(diào)控[4]。利用VP進行干預,可抑制DN小鼠腎組織中CTGF的表達[4]。因此,本研究中我們對腎皮質(zhì)組織中CTGF及分別位于足細胞裂孔膈膜、細胞核及頂端的功能蛋白nephrin、WT1、podocalyxin的mRNA表達情況進行了觀察。結(jié)果顯示,模型組小鼠CTGF的蛋白及mRNA表達水平明顯升高,而YSHS和VP組CTGF的表達量均出現(xiàn)下降,該結(jié)果與DN大鼠的研究報道一致[13]。此外,YSHS組小鼠的nephrin、WT1及podocalyxin的mRNA表達量較模型組均有所上調(diào)。說明YSHS具有通過抑制YAP過表達,下調(diào)CTGF表達水平上調(diào)nephrin、WT1及podocalyxin等足細胞功能蛋白mRNA的作用。值得注意的是,與模型組比較,VP組小鼠的nephrin和podocalyxin的mRNA表達水平亦有上升,但WT1的mRNA表達升高不明顯。造成該結(jié)果的原因可能與本研究中VP的給藥劑量(25 mg·kg-1,隔日一次)遠低于文獻報道中的劑量(100 mg·kg-1,隔日一次),從而減弱了該藥的療效有關(guān)。

綜上所述,益腎化濕顆粒在DN治療過程中具有降低尿蛋白、保護腎功能的作用。該作用可能與其下調(diào)DN小鼠腎皮質(zhì)組織中YAP的表達水平,從而減少CTGF表達,并上調(diào)足細胞nephrin、WT1及podocalyxin等功能蛋白的mRNA表達有關(guān)。