張一凡,杜 敏,王佳柔,李斯錦,馮驍騰,韓向暉,劉 萍

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 1.附屬龍華醫(yī)院、2.中醫(yī)外科研究所,上海 200032)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種由脂質(zhì)積聚引起的慢性炎癥性血管病。大量研究表明,AS是脂代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、血管周圍脂肪組織功能等多種因素相互作用而成[1]。因此,改善脂質(zhì)代謝仍然是防治AS的有效措施。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport,RCT)維持脂代謝平衡,可減少脂質(zhì)在血管壁的沉積。

丹參是一味用于治療心血管疾病的常用中藥,具有活血化瘀功效。丹參酮 ⅡA(tanshinone ⅡA,Tan ⅡA)是丹參的主要脂溶性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),Tan-ⅡA具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等活性,用于治療心血管疾病、腫瘤等[2]。已有研究發(fā)現(xiàn),Tan-ⅡA通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞LXRα/SREBP1通路抑制脂肪生成和減少脂質(zhì)積累,具有脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用[3]。但是,Tan-ⅡA對(duì)AS模型小鼠及巨噬細(xì)胞中的RCT調(diào)控作用研究較少。因此,本研究選用LDLR-/-小鼠作為AS模型及ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7作為細(xì)胞模型模擬部分AS病理變化,觀察Tan-ⅡA對(duì)AS模型小鼠血脂水平、主動(dòng)脈根部斑塊面積、RAW264.7細(xì)胞脂滴累積的影響,及對(duì)RCT相關(guān)蛋白的調(diào)控,明確Tan-ⅡA對(duì)RCT的調(diào)控作用,為篩選、研發(fā)抗AS藥物提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 LDLR-/-小鼠,6～8周齡,♂,購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):202000150,許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0008。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào):2019-N002)。

1.1.2細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 Tan ⅡA購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號(hào)19032104。阿托伐他汀鈣片(atorvastatin calcium tablets,ATO,批號(hào)CK2270),購于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院西藥房。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL,批號(hào):20605ES05)購于上海翊圣生物科技有限公司;ABCA1(批號(hào):96292)、GAPDH(批號(hào):5174)抗體購于美國CST公司,ABCG1(批號(hào):ab52617)購于英國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠干預(yù)與分組 LDLR-/-小鼠隨機(jī)分為4組,分別為對(duì)照組(CON)、模型組(MOD)、丹參酮ⅡA組(Tan ⅡA)、阿托伐他汀組(ATO),每組8只。CON組給予普通飼料,其余組給予高脂飼料喂養(yǎng)12周后,分別給予生理鹽水、Tan ⅡA溶液腹腔注射,或阿托伐他汀溶液1.3 mg·kg-1灌胃12周。參照文獻(xiàn)[4],選取Tan ⅡA溶液濃度為15 mg·kg-1。

1.2.2細(xì)胞干預(yù)與分組 RAW264.7細(xì)胞分為對(duì)照組(CON)、ox-LDL誘導(dǎo)組(ox-LDL)、Tan ⅡA-低、中、高劑量組(Tan ⅡA-L、Tan ⅡA-M、Tan ⅡA-H)。除CON組外,其余組用ox-LDL 100 mg·L-1誘導(dǎo)24 h,Tan ⅡA組分別給予含有Tan ⅡA(10、20、40 μmol·L-1)的培養(yǎng)基。

1.2.3血清生化檢測(cè) 檢測(cè)總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。

1.2.4小鼠主動(dòng)脈根部油紅O染色 ① 固定:小鼠上1/3心臟及主動(dòng)脈,4%中性甲醛溶液,48 h;② 脫水:組織置于梯度蔗糖溶液,各24 h;③ 包埋:OCT膠包埋;④ 切片;⑤ 油紅O染色;⑥ 封片;⑦ 拍照;⑧ 分析、測(cè)量斑塊及管腔面積,比例(%)= 斑塊面積 / 管腔面積 × 100%。

1.2.5細(xì)胞油紅O染色 ①固定:細(xì)胞誘導(dǎo)24 h后,棄原培養(yǎng)基,4%多聚甲醛,15 min,PBS清洗;②染色:油紅O染色2 h,蘇木清染色2 min;③拍照。

1.2.6Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) ①裂解:取小鼠主動(dòng)脈組織、肝組織研磨,加入裂解液,冰上靜置;細(xì)胞誘導(dǎo)24 h后,棄原培養(yǎng)基,PBS清洗,加入裂解液,放置冰上,用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,冰上靜置。②提取細(xì)胞蛋白:離心,收集上清;③蛋白定量:BCA 法;④蛋白變性:蛋白樣品與上樣緩沖液混合,95 ℃孵育 5 min;⑤電泳、轉(zhuǎn)膜;⑥封閉:0.2%BSA TBST,1 h;⑦孵育抗體:一抗(ABCA1、ABCG1、GAPDH,1 ∶1 000),4 ℃過夜;二抗(1 ∶4 000),室溫1 h;⑧顯影;⑨統(tǒng)計(jì)分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 TanⅡA對(duì)小鼠血清血脂水平的影響與CON比較,高脂飲食誘導(dǎo)后小鼠TC、TG、LDL-C明顯升高,HDL-C明顯降低(P<0.05)。Tan ⅡA、ATO干預(yù)后, TC、TG、LDL-C水平明顯降低,HDL-C明顯升高(P<0.05)(Tab 1)。

Tab 1 Serum lipid levels in each group of n=8)

2.2 TanⅡA對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部粥樣硬化斑塊相對(duì)管腔面積比值的影響MOD小鼠主動(dòng)脈根部粥樣硬化斑塊面積與管腔面積的比值較CON明顯增大(P<0.01)。與MOD比較,Tan ⅡA、ATO干預(yù)后該比值明顯減小(P<0.01)(Fig 1)。

2.3 TanⅡA對(duì)小鼠膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示,高脂飲食誘導(dǎo)后小鼠主動(dòng)脈組織、肝組織中ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);Tan ⅡA、ATO干預(yù)后,ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)(Fig 2,3)。

2.4 TanⅡA對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成的影響100 mg·L-1的ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后,進(jìn)行油紅O染色,顯微鏡觀察泡沫細(xì)胞形成情況。結(jié)果顯示,ox-LDL誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)累積大量脂滴;Tan ⅡA干預(yù)后,脂滴顯著減少(Fig 4)。

Fig 1 Oil red O staining of aortic atherosclerosis n=6)

Fig 2 Reverse cholesterol transport related protein expression of aortic tissue in each n=3)

Fig 3 Reverse cholesterol transport related protein expression of liver tissue in each n=3)

Fig 4 Oil red O staining of RAW264.7 cells (×200)**P<0.01 vs CON;#P<0.05,##P<0.01 vs ox-LDL

Fig 5 Reverse cholesterol transport related protein expression of cells in each n=3)

2.5 TanⅡA對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示,ox-LDL誘導(dǎo)組細(xì)胞ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);Tan ⅡA干預(yù)后,ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)(Fig 5)。

3 討論

脂代謝紊亂是AS發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素及病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn),TG清除較慢與冠狀動(dòng)脈CT檢測(cè)到的AS存在和程度獨(dú)立相關(guān)[5];富含TG的脂蛋白膽固醇與AS的進(jìn)展直接相關(guān),通過增加活性氧的產(chǎn)生促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙,其水解產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子、黏附分子,促進(jìn)白細(xì)胞向炎癥部位遷移[6]。在沒有主要心血管危險(xiǎn)因素的情況下,LDL-C與早期AS的存在和程度獨(dú)立相關(guān)[7];升高的LDL-C作為危險(xiǎn)因素,成為一級(jí)和二級(jí)預(yù)防治療的主要目標(biāo)。通過運(yùn)動(dòng)、改變飲食結(jié)構(gòu)、服用藥物等降低血脂水平,可顯著降低患AS的風(fēng)險(xiǎn)。因此,降脂療法對(duì)于防治AS尤為重要。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),給予AS模型小鼠中藥單體丹酚酸B干預(yù),可降低小鼠血脂水平,改善AS[8]。本研究結(jié)果顯示:Tan-ⅡA顯著降低AS小鼠血清TC、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,減小主動(dòng)脈根部粥樣硬化斑塊面積,表明Tan-ⅡA通過調(diào)節(jié)血脂水平改善小鼠AS。

當(dāng)大量脂蛋白積聚在冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜,會(huì)發(fā)生氧化等修飾,被巨噬細(xì)胞等細(xì)胞吞噬后會(huì)形成泡沫細(xì)胞[9]。泡沫細(xì)胞作為AS發(fā)生的始動(dòng)因素,也成為抗AS的靶點(diǎn);隨著疾病進(jìn)展,大量泡沫細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡,形成充滿脂質(zhì)的壞死核心[10]。有研究發(fā)現(xiàn),花青素、黃芩苷、藏紅花素等抑制泡沫細(xì)胞形成,可顯著改善AS[11-12]。本研究結(jié)果顯示:Tan-ⅡA顯著減少ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成,表明Tan-ⅡA可能通過抑制泡沫細(xì)胞形成發(fā)揮抗AS的作用。

RCT通過維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),從而抑制泡沫細(xì)胞形成及慢性炎癥發(fā)生[13]。因此,RCT成為抗AS的主要靶點(diǎn)。三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)和ABCG1是參與RCT的主要分子,有助于清除巨噬細(xì)胞內(nèi)多余的膽固醇 。研究發(fā)現(xiàn),編碼ABCA1的基因突變導(dǎo)致患者血清HDL水平極低,增加AS風(fēng)險(xiǎn)[14]; ABCA1或ABCG1基因敲除鼠的AS病變會(huì)加重[15-16];而促進(jìn)ABCA1、ABCG1的表達(dá),增加膽固醇外排活性,可有效減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚,改善AS[17-18]。因此,促進(jìn)RCT有助于改善AS的病理改變。本研究結(jié)果顯示:Tan-ⅡA上調(diào)ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá),表明Tan-ⅡA可能通過促進(jìn)RCT發(fā)揮抗AS的作用。

綜上所述,本研究闡明Tan-ⅡA通過促進(jìn)主動(dòng)脈組織及RAW264.7巨噬細(xì)胞RCT,抑制泡沫細(xì)胞形成,調(diào)節(jié)脂代謝,從而緩解AS,為抗AS藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。