劉 鶴，單宇航，邱 睿，李淑君，張 崇，吳元華，安夢楠*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110866；2.煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，許昌 461000）

目前由于化學(xué)肥料與農(nóng)藥的濫用，導(dǎo)致土壤健康逐漸惡化，病原物抗藥性增強(qiáng)，給煙草土傳病害的防控帶來很大困難[1]，因此生物防治逐漸受到人們的重視與選擇。其中微生物源代謝產(chǎn)物的開發(fā)及利用，不僅對煙草土傳病害防控技術(shù)的研究開發(fā)具有重要意義，也符合我國發(fā)展綠色植保的要求。目前開發(fā)的針對煙草土傳病害的生防微生物只有少數(shù)芽孢桿菌和木霉菌等[2]，鮮見防治煙草土傳病害生防鏈霉菌的相關(guān)報(bào)道。

微生物代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定多以發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，通過系列繁瑣的純化步驟，分離提純得到單體化合物后才可明確結(jié)構(gòu)，全過程表現(xiàn)出高度的隨機(jī)性、時(shí)變性、非線性和時(shí)滯性[3]，因此色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）的非靶向代謝組學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展就有效縮短了代謝產(chǎn)物成分鑒定的過程[4]。非靶向代謝組學(xué)可基于高通量、高分辨率、高靈敏度的特點(diǎn)，定性和相對定量生物體系中的代謝物，最大程度反映總的代謝物信息，實(shí)現(xiàn)在單次分析中全面檢測和鑒定全部小分子量的代謝產(chǎn)物，有助于盡快確定代謝產(chǎn)物中的有效成分，或一些潛在的先導(dǎo)化合物。LC/MS 技術(shù)已成為代謝組學(xué)研究中重要工具之一[5]，且適用于分析難揮發(fā)或熱穩(wěn)定性差的代謝物[6]。

本研究以煙草鐮刀菌根腐病和煙草黑脛病為靶標(biāo)對象，將針對兩種病害均具有良好生防作用的鏈霉菌SN53 進(jìn)行了分類鑒定，通過LC/MS 非靶向代謝組鑒定出其發(fā)酵液中主要成分為茴香霉素，并且以純品為對照，通過高效液相色譜明確了茴香霉素在粗提物中的含量。然后通過病原菌生長抑制試驗(yàn)，測定了SN53活性代謝產(chǎn)物—茴香霉素對煙草鐮刀根腐病菌和煙草黑脛病菌的抑菌活性及EC50值，為后續(xù)對生防菌劑的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)室前期從河南省洛陽市伊川縣煙草種植基地中煙草土傳病害常發(fā)區(qū)域篩選得到一株生防菌，編號SN53。煙草鐮刀根腐病菌Fusariumoxysporum和煙草黑脛病菌Phytophthoranicotianae由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所分離保存，經(jīng)28 ℃活化培養(yǎng)3 d 后用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)所用培養(yǎng)基[7]為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），高氏一號培養(yǎng)基，酵母麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基（ISP2），燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP3），無機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP4），甘油天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基（ISP5），蛋白胨酵母提取物鐵瓊脂培養(yǎng)基（ISP6）及酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（ISP7）。

1.2 方法

1.2.1 生防菌SN53 抑菌活性測定 以煙草鐮刀根腐病菌和黑脛病菌作為靶標(biāo)病原菌，采用平板對峙法，將培養(yǎng)7 d 的SN53 菌餅（直徑5 mm）放置于PDA 平板中央，病原菌菌餅（直徑5 mm）對稱放于生防菌兩側(cè)。平板于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌株對靶標(biāo)菌的抑菌效果。

1.2.2 菌株SN53 的鑒定 吸取適量SN53 菌懸液涂布在高氏一號培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d 后在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌落和孢子形態(tài)并通過掃描電鏡觀察其菌絲形態(tài)特征。培養(yǎng)性狀觀察：用接菌針挑取SN53 菌種在PDA、高氏一號培養(yǎng)基、ISP-2、ISP-3、ISP-4、ISP-5、ISP-6 和ISP-7 平板上進(jìn)行劃線，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d 后觀察菌株的菌落形狀、顏色和質(zhì)地等培養(yǎng)性狀。根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》對SN53 進(jìn)行生理生化特征檢測。

按照DNA 提物試劑盒的說明對SN53 的DNA 進(jìn)行提取；再利用細(xì)菌16S rDNA 通用引物：63F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR采用20 μL 反應(yīng)體系：2×TaqPCR Mix 10 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA 模板0.4 μL，ddH2O補(bǔ)足到20 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。最后將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序并將所獲得的序列進(jìn)行BLAST 比對，使用MEGA7軟件以鄰接法將所得到的序列與NCBI 下載的其他分離物的16S rDNA 序列進(jìn)行處理，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 SN53 發(fā)酵液LC/MS 非靶向代謝組的檢測 參考司洪陽[7]的微生物代謝產(chǎn)物粗提物制備方法，取SN53 菌株的孢子懸浮液接種于LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 搖瓶培養(yǎng)2 d 作為種子液。將SN53種子液接種于高氏一號培養(yǎng)基中，接種量為5%，發(fā)酵培養(yǎng)6 d。將發(fā)酵液先經(jīng)10000 r/min、4 ℃下離心15 min 去除菌絲體，再經(jīng)0.22 μM 濾膜收集發(fā)酵液。發(fā)酵濾液使用Amberlite XAD 16 大孔吸附樹脂，按5%（m/V）的比例對培養(yǎng)液中的活性物質(zhì)進(jìn)行吸附后烘干樹脂。用甲醇對烘干的樹脂進(jìn)行洗脫，并將洗脫液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最終得到得甲醇浸膏粗提物用于LC-MS 非靶向代謝組的檢測。樣品采用ACQUITY UPLC BEH C18 column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，USA）進(jìn)行色譜分離，以進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為40 ℃，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）的條件對代謝物按以下梯度進(jìn)行洗脫：0～1.0 min，5% B；1.0～9.0 min，5%～100% B；9.0～12.0 min，100% B；12.0～15.0 min，5% B。

高效液相色譜分離后的樣品，經(jīng)Q-Exactive 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，采用電噴霧電離（ESI）正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。ESI 源條件如下：離子源氣1 和2 分別為60，氣簾氣為30，源溫度320 ℃，離子源噴霧電壓為±3.5 kV；MS 掃描范圍為80～1200 Da。二級質(zhì)譜經(jīng)高敏感模式下數(shù)據(jù)依賴型掃描獲得，其中去簇電位為±60 V，碰撞能為35±15 eV。

采用Compound Discoverer 3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，包括峰提取、峰對齊、峰校正、標(biāo)準(zhǔn)化等。檢索HFMDB、Biocyc、Lipidmaps、HMDB、metlin 等數(shù)據(jù)庫對代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，所用方法為精確質(zhì)量數(shù)匹配（＜25 μg/mL）和二級譜圖匹配的方式。

1.2.4 非靶向代謝組學(xué)的驗(yàn)證及產(chǎn)物含量測定 利用高效液相色譜法對LC/MS 非靶向代謝組學(xué)中測定出的含量最高的化合物進(jìn)行驗(yàn)證。準(zhǔn)確稱量0.2 g 1.2.3 中得到的粗提物用于產(chǎn)物驗(yàn)證試驗(yàn)，同時(shí)稱取茴香霉素標(biāo)準(zhǔn)品（市購）為對照組，并用流動(dòng)相溶解后，配置成100、200、400、600 和800 μg/mL 的茴香霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，超聲30 min 后經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾。參考郭霞凌和李輝[8]的色譜條件，設(shè)置流動(dòng)相為0.05 M，pH 6.0 的磷酸鹽緩沖液與乙腈體積比（磷酸鹽緩沖液:乙腈=80:20），樣品進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為225 nm，流速為1.0 mL/min，色譜柱為Venusil MP C18（4.6×250mm，5 μm），柱溫為30 ℃。

記錄并比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間確認(rèn)產(chǎn)物成分，同時(shí)參考外標(biāo)法[9]利用不同質(zhì)量濃度的茴香霉素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間以及相應(yīng)的峰面積來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及回歸系數(shù)。最后帶入粗提物樣品的出峰面積計(jì)算出茴香霉素的含量。

1.2.5 茴香霉素對煙草鐮刀根腐病菌及黑脛病菌菌絲生長影響的測定 將茴香霉素純品（市購，純度99.8%）按照不同比例加入冷卻至50 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為200、400、800、1600 和3200 μg/mL。而后將直徑為5 mm 的病原菌菌餅倒置接入含藥平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。利用十字交叉法測量菌落直徑。以不加茴香霉素培養(yǎng)的病原菌為對照，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算不同濃度的茴香霉素對煙草鐮刀根腐病菌菌絲的生長抑制率。茴香霉素對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制試驗(yàn)方法同上，其中茴香霉素終濃度為25、50、100、200 和400 μg/mL。菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑—處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。將菌絲生長抑制率換算成概率值（y），茴香霉素的濃度換算成固定對數(shù)（x），建立線性毒力回歸方程y=a+bx，計(jì)算EC50。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用 SPSS 26.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SN53 抑菌活性及菌種鑒定

以煙草鐮刀根腐病菌（圖1A）和黑脛病菌（圖1B）為靶標(biāo)菌，通過平板對峙試驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌SN53 對兩種病原菌均有較好的抑制效果。通過對SN53 在培養(yǎng)基上的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌落呈灰白色圓形，邊緣較中間稀疏，界限不分明，表面干燥（圖2A）。顯微鏡下觀察SN53 的菌絲分支較多，呈直線形（圖2B）。孢子呈橢圓形，成熟后孢子鏈成串珠狀（圖2C）。掃描電子顯微鏡下觀察菌絲多呈銳角分支（圖2D）。

圖1 SN53 對病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of SN53 on pathogenic fungi

圖2 菌株SN53 的形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Morphological observation of strain SN53

將菌株SN53 接種在8 種培養(yǎng)基上，7 d 后進(jìn)行培養(yǎng)特征的觀察結(jié)果表明，SN53 在高氏一號培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基、ISP2、ISP7 培養(yǎng)基上生長狀況良好，在ISP4、ISP5、ISP6 培養(yǎng)基上生長狀況一般，而在ISP3培養(yǎng)基上生長狀況最差；氣生菌絲在不同培養(yǎng)基上顏色存在差異，呈黃白色、白色、橄欖色、黃色；基內(nèi)菌絲多為黃色，在高氏一號培養(yǎng)基上呈橄欖色（表1）。

表1 菌株SN53 在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Table 1 Cultural characteristics of strain SN53 on different medium

菌株SN53 的生理生化檢測結(jié)果表明該菌株V-P 試驗(yàn)陽性，可利用檸檬酸鹽為碳源，不能利用丙酸鹽，可以使明膠液化、淀粉水解、在pH 5.7 中生長，不能在7% NaCl 中生長，具備還原硝酸鹽的能力，可以利用D-甘露醇作為碳源，不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖作為碳源（表2）。對SN53 進(jìn)行16S rDNA 序列擴(kuò)增測序比對結(jié)果顯示，SN53 序列與鏈霉菌屬序列相似性達(dá)到99%；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，SN53 與淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌Streptomycesdiastatochromogenes（登錄號為EU814698.1）位于同一分支上（圖3）。綜上，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)分析結(jié)果，鑒定菌株SN53 為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌。

表2 菌株SN53 的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of SN53

圖3 菌株SN53 的16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence of strain SN53

2.2 SN53 代謝產(chǎn)物粗提物的LC/MS 非靶向代謝組檢測

通過非靶向代謝組學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，SN53 粗提物中共含有2429 種代謝產(chǎn)物，正離子模式（POS）下檢測到1567 種，負(fù)離子模式（NEG）下檢測到862 個(gè)代謝物（圖4）。其中鑒定出多種具有生物活性的物質(zhì)，包括氨基糖苷類抗生素，如茴香霉素；2,5-哌嗪二酮類物質(zhì)，如環(huán)苯丙氨酸-脯氨酸；多酚類物質(zhì)，如霉酚酸等，代謝產(chǎn)物中茴香霉素含量最高（表3）。

2.3 SN53 代謝產(chǎn)物粗提物的LC/MS 非靶向代謝組驗(yàn)證及產(chǎn)物含量測定

利用市購的茴香霉素標(biāo)準(zhǔn)品和SN53 粗提物在相同條件下進(jìn)行HPLC 檢測，從標(biāo)準(zhǔn)品液相圖譜可知，茴香霉素的出峰時(shí)間在27 min 左右，SN53 粗提物的液相圖譜顯示在27.762 min 有單峰出現(xiàn)，出峰時(shí)間基本一致，證明SN53 粗提物中含有物質(zhì)茴香霉素（圖5，6）。

圖5 茴香霉素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatogram of anisomycin standard

對茴香霉素系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品得到的液相色譜峰面積進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到茴香霉素的線性方程為y=11.1x+78.42，回歸系數(shù)R2為0.9885，且標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（橫軸）與峰面積（縱軸）之間的線性關(guān)系均比較好，趨勢線的回歸系數(shù)R2均趨近于1，趨勢線可靠（圖7）。將粗提物中的峰面積代入所得的線性方程中，得到粗提物中茴香霉素濃度為42.398 μg/mL，結(jié)合茴香霉素進(jìn)樣體積為20 μL，計(jì)算得出1 g 粗提物中茴香霉素含量為423.98 μg。

圖7 茴香霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of anisomycin

2.4 茴香霉素對煙草鐮刀根腐病菌及黑脛病菌菌絲生長的影響

為了確定茴香霉素對煙草鐮刀根腐病菌和黑脛病菌菌絲生長的抑制作用，測定了不同濃度茴香霉素處理下煙草鐮刀根腐病菌（圖8）和黑脛病菌（圖9）的菌絲生長直徑，并計(jì)算出藥劑對病原菌的EC50值。結(jié)果顯示，茴香霉素對煙草鐮刀根腐病菌的毒力回歸方程為y=1.1035x+1.4775，相關(guān)系數(shù)R2=0.9843，EC50值為1556.36 μg/mL（圖10）；茴香霉素對煙草黑脛病菌毒力回歸方程為y=1.7831x+2.1205，相關(guān)系數(shù)R2=0.9328，EC50值為40.74 μg/mL（圖10），茴香霉素對煙草黑脛病菌的菌絲生長抑制效果優(yōu)于根腐病菌。

圖8 不同濃度茴香霉素對煙草鐮刀根腐病菌菌絲生長的抑制效果Fig.8 Inhibition effect of anisomycin at different concentrations on mycelial growth of F.oxysporum

圖9 不同濃度茴香霉素對煙草黑脛病菌菌絲抑制效果Fig.9 Inhibition effect of anisomycin at different concentrations on mycelia of P.parasitica

圖10 茴香霉素對煙草鐮刀根腐病菌及黑脛病菌菌絲生長抑制率及毒力回歸方程Fig.10 Inhibition rate of different concentrations of anisomycin on the mycelial growth and toxicity regression equation of F.oxysporum and P.parasitica

3 討論

放線菌Actinomyces 是應(yīng)用最廣泛的一類生防菌，也是許多農(nóng)用抗生素的重要來源之一。其中，鏈霉菌作為放線菌中的重要成員，在生物防治方面具有巨大潛能，如始旋鏈霉菌產(chǎn)生的普那霉素對革蘭氏陽性菌具有很強(qiáng)的殺菌作用；密旋鏈霉菌產(chǎn)生的寡霉素具有很強(qiáng)的抑制真菌生長的作用；灰色鏈霉菌產(chǎn)生的阿波霉素對大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌都有顯著的抗菌活性[10-12]。本研究通過抑菌試驗(yàn)篩選得到了一株對煙草鐮刀根腐病和黑脛病的防效較好的菌株SN53，經(jīng)系列鑒定確定為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌Streptomycesdiastatochromogenes。目前，關(guān)于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌防治植物病害的研究較少，徐亦雯等[13]利用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 的代謝產(chǎn)物防治了浙麥冬黑斑??；同時(shí)生防菌1628 還可有效防治杭白菊枯萎病[14]；本實(shí)驗(yàn)室前期針對淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌抗煙草靶斑病的作用機(jī)制也展開了研究[15]。因此本研究為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌在防治植物靶標(biāo)病害的應(yīng)用上提供了新的見解。

探索鏈霉菌代謝產(chǎn)物中活性成分的種類，對生防菌的生產(chǎn)應(yīng)用及后續(xù)作用機(jī)制的研究有著至關(guān)重要的作用。鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)如春雷霉素、農(nóng)抗120、嘧肽霉素、井岡霉素、多抗霉素、申嗪霉素等，已作為高效低毒生物農(nóng)藥而投入到商品化生產(chǎn)中；其他黃酮類、酚類、四環(huán)素類、氨基糖苷類等生物活性物質(zhì)也已在醫(yī)學(xué)、制藥、農(nóng)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[16]。非靶向代謝組學(xué)具有可鑒定代謝物種類多、極性跨度大和樣品濃度動(dòng)態(tài)范圍廣等特點(diǎn)，可以無偏向地檢測樣本中所有能檢測到的代謝物分子，對產(chǎn)物進(jìn)行定性定量分析。目前，該技術(shù)在微生物代謝產(chǎn)物的研究、食品造假鑒定、有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品未知污染物檢測和有機(jī)乳制品含量確認(rèn)等方面都有所應(yīng)用[17,18]。本研究利用非靶向代謝組學(xué)從SN53 發(fā)酵液中共檢測到2429 種代謝產(chǎn)物，其中茴香霉素、環(huán)苯丙氨酸-脯氨酸、兒茶素沒食子酸和大觀霉素等含量較高，參考已有分離純化操作，本文得到了SN53 發(fā)酵液中含量最高的活性代謝產(chǎn)物—茴香霉素，該化合物也為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌代謝產(chǎn)物組分的新報(bào)道。

茴香霉素于1954 年首次被發(fā)現(xiàn)，是一種含氮雜環(huán)類芳香族衍生物抗生素，作為一種蛋白合成抑制劑，在多個(gè)領(lǐng)域均有應(yīng)用[19]。例如，在醫(yī)學(xué)方面，茴香霉素與健忘癥產(chǎn)生、機(jī)體系統(tǒng)免疫和抗腫瘤活性方面有所聯(lián)系，還具有殺滅阿米巴原蟲的作用；在農(nóng)業(yè)方面，茴香霉素作為生物農(nóng)藥農(nóng)抗120 的主要活性成分之一，可防治多種植物真菌性病害，比如枯萎病、炭疽病、立枯病、白絹病、白粉病等[20-22]。但關(guān)于茴香霉素能夠抑制煙草鐮刀根腐病菌和黑脛病菌的研究則鮮有報(bào)道。本文通過非靶向代謝組學(xué)明確了鏈霉菌SN53 活性代謝物—茴香霉素具有抑制煙草鐮刀根腐病菌和黑脛病菌活性，并進(jìn)一步通過菌絲生長抑制試驗(yàn)明確了茴香霉素對兩種病原菌的EC50。本研究為煙草鐮刀菌根腐病和黑脛病的生物防治提供了新的有價(jià)值的來源，并為生防菌代謝產(chǎn)物—茴香霉素在農(nóng)業(yè)防治土傳病害上的應(yīng)用和機(jī)制研究提供了重要參考依據(jù)。