張 璇，畢亞鑾，方 琦，汪 芳，葉恭銀

（浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院/水稻生物學國家重點實驗室，杭州 310058）

黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和斑翅果蠅D.suzuki皆屬雙翅目Diptera、果蠅科Drosophilidae、果蠅屬Drosophila，是世界范圍內(nèi)重要的水果害蟲[1,2]。它們能為害薔薇科Rosaceae 的櫻桃Prumuscerasus[3]、樹莓Rubusidaeus[4]、栽培草莓Fragaria×ananassa[5]，杜鵑花科Ericaceae 的藍莓Vacciniumcorymbosum[6]等多種漿果類水果。果蠅為害主要發(fā)生在山東[3]、云南[7]、貴州[8]、福建[6]和浙江[9]等地。斑翅果蠅能利用其尖銳的產(chǎn)卵器在健康的果實中產(chǎn)卵[10]，產(chǎn)卵造成的傷口會使果實更容易遭受其他果蠅的為害或微生物的侵染[11]。黑腹果蠅則偏好在破損和腐爛的果實中產(chǎn)卵[12]，果蠅幼蟲孵化后會在果實內(nèi)部鉆蛀取食，繼而導致果實產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[11,12]。在浙江臨海，黑腹果蠅幼蟲的蛀食導致楊梅果實凹凸不平、果汁外溢、落果，對楊梅的貯藏和商品價值都造成較大影響[13]。此外，果蠅能夠傳播葡萄酸腐病等植物病害[14]，在沒有斑翅果蠅存在的情況下，黑腹果蠅通過產(chǎn)卵和幼蟲取食導致葡萄酸腐病的發(fā)生；在兩種果蠅共存的情況下，斑翅果蠅造成的傷口則能加劇黑腹果蠅在葡萄園中的繁殖與侵害，造成巨大的經(jīng)濟損失[15]。

目前，果蠅的防治主要依賴化學藥劑。氯蟲苯甲酰胺、啶蟲脒、氯氟氰菊酯、氟啶脲和聯(lián)苯菊酯等殺蟲劑對果蠅都有較強的毒殺作用[16,17]。但大量化學農(nóng)藥的長期使用不僅會導致農(nóng)藥殘留問題，也會增強果蠅的抗藥性[18]，并給人畜環(huán)境和天敵昆蟲帶來不良影響[19]。綠色高效的監(jiān)測和誘捕技術的研發(fā)是果蠅生物防治亟需解決的重要問題。常用的誘捕劑主要有蘋果醋、糖醋液等[17,20]，然而在果實成熟期，寄主果實往往比蘋果醋等引誘劑對果蠅具有更強的引誘力[21]。因此，從昆蟲的寄主植物中尋找具有引誘效應的揮發(fā)物組分成為引誘劑研發(fā)的新方向。植物揮發(fā)物是植食性昆蟲搜尋、定位寄主的重要線索[22]。例如，小菜蛾Plutellaxylostella成蟲依靠十字花科Brassicaceae 揮發(fā)的異硫氰酸酯類化合物定位寄主植物[23]。類似地，果蠅也通過感知寄主的揮發(fā)物來覓食、尋找配偶和選擇產(chǎn)卵地[24]。成熟楊梅果實揮發(fā)物對已交配和未交配的斑翅果蠅雌蟲有顯著的引誘效果，而半熟楊梅和生楊梅果實揮發(fā)物僅對未交配雌蟲有引誘效果[25]；Urbaneji-Bernat 等[26]發(fā)現(xiàn)，相比栽培藍莓，斑翅果蠅更傾向于選擇野生藍莓為寄主，這可能與野生藍莓中的9 種揮發(fā)物有關。這些研究表明，寄主植物的揮發(fā)物對果蠅的行為有重要的影響。

栽培草莓是果蠅的主要寄主植物之一，相比樹莓、黑莓、櫻桃、藍莓，草莓對斑翅果蠅具有更強的吸引效果[5]。揮發(fā)性酯類化合物是草莓果香的重要組成部分，栽培草莓釋放的揮發(fā)性酯類化合物多于野生草莓F.vesca，不同品種栽培草莓間揮發(fā)物種類和含量也具有差異[27]。研究表明，斑翅果蠅對草莓揮發(fā)物組分乙酸異戊酯有顯著的觸角電位反應[5]；草莓、藍莓和櫻桃共有揮發(fā)物中的己醛、2-庚酮能增強乙酸和乙醇混合液對斑翅果蠅的引誘力[28]。但目前有關不同成熟階段的草莓揮發(fā)物組成，以及草莓揮發(fā)物對果蠅的影響尚不清楚。為此，本研究在比較不同成熟期草莓對黑腹果蠅和斑翅果蠅的引誘力的基礎上，利用頂空固相微萃取HS-SPME（Headspace solid-phase microextraction）結(jié)合氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS（Gas chromatograph-mass spectrometer）收集分析了其揮發(fā)物組分的異同，篩選了一些揮發(fā)物組分并分析了兩種果蠅對這些揮發(fā)物組分的行為反應，旨在為研發(fā)果蠅的高效誘捕劑篩選出具有應用潛力的化合物。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

本試驗所用的野生型黑腹果蠅w1118系本實驗室保存的品系；野生型斑翅果蠅由山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所于毅研究員惠贈。兩種果蠅在實驗室以人工飼料繼代飼養(yǎng)，飼料配方參照倪旭陽[29]。培養(yǎng)條件為25 ℃，70%相對濕度和光周期12L:12D。

1.2 供試水果材料及成熟度分級

試驗所用的草莓品種為紅玉，采自浙江省建德市紅群草莓采摘基地。草莓采摘帶回后用去離子水洗凈，儲存在4 ℃冰箱中備用。本試驗根據(jù)草莓顏色將其成熟度分為三類：一類為白熟期，特征為果實外觀白色部分占比多于紅色部分；二類為紅熟期，特征是整個草莓果實外觀全為紅色；三類為腐壞期，特征是果實表面有病斑，果實質(zhì)地軟爛（圖1）。

圖1 草莓成熟度分級Fig.1 Strawberry maturity classification

1.3 供試化學品及配制方法

試驗所用的化學品均購自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，包括乙酸乙酯（CAS No.141-78-6，純度99.9%）、己酸甲酯（CAS No.106-70-7，純度99.7%）、芳樟醇（CAS No.78-70-6，純度98.0%）、癸酸乙酯（CAS No.110-38-3，純度99.0%）、肉桂酸乙酯（CAS No.103-36-6，純度98.0%）、石蠟油（CAS No.8012-95-1）。試驗時將待測化合物按照0.1%的體積比添加于石蠟油中，渦旋振蕩混勻備用。0.1%的乙酸乙酯對兩種果蠅有顯著的吸引作用，將其按體積比稀釋為0.05%、0.025%、0.01%、0.005%、0.0025%后分別進行試驗。

1.4 果蠅對不同成熟期草莓果肉的趨性

使用自制的雙選擇陷阱裝置測試果蠅對不同成熟期草莓的趨性。黑腹果蠅試驗裝置，由一個帶蓋的聚丙烯塑料保鮮罐（罐身直徑115 mm×高170 mm，1600 mL）和兩個聚丙烯塑料果蠅管（直徑24 mm×高95 mm）組成[30]。在保鮮罐的兩側(cè)用電烙鐵掏出兩個孔徑分別為60 mm 和20 mm 的洞口，孔徑為60 mm的洞口覆蓋上40 目的黃銅網(wǎng)用于空氣流通，孔徑為20 mm 的洞口用于釋放果蠅。將1000 μL 移液管剪去尖端8 mm 后穿過海綿塞（24 mm×24 mm），塞在果蠅管上制成陷阱。將兩個陷阱管置于保鮮罐中與兩孔垂直的中心線上，距離中心點20 mm 處。斑翅果蠅的試驗裝置與黑腹果蠅試驗裝置基本相同。由于斑翅果蠅的活動力較黑腹果蠅弱，特將果蠅管用電烙鐵截短至40 mm 高，將1000 μL 移液管替換為截去尖端10 mm 的200 μL 移液管。

將草莓去蒂放入破壁機勻漿，稱取5 g 勻漿后的果肉用于試驗。試驗Ⅰ：測試陷阱管中放入5 g 草莓果肉勻漿，對照陷阱管中放入5 g 的1%瓊脂凝膠，共設三組試驗，即白熟草莓vs瓊脂凝膠、紅熟草莓vs瓊脂凝膠、腐壞草莓vs瓊脂凝膠。試驗Ⅱ：兩陷阱管內(nèi)放入5 g 不同成熟期的草莓果肉勻漿，共設兩組試驗，即白熟草莓vs紅熟草莓、紅熟草莓vs腐壞草莓。選取羽化3～5 d 生長一致的果蠅雌成蟲進行試驗，試驗前將果蠅保濕饑餓處理4 h。每組試驗設置20 次重復，每重復30 頭果蠅雌成蟲，24 h 后統(tǒng)計兩個果蠅管陷阱中果蠅數(shù)量。試驗在25 ℃，70%相對濕度，光照均勻且無異味的封閉木箱中進行。

1.5 不同成熟度草莓的揮發(fā)物收集

揮發(fā)物的收集采用頂空固相微萃取（HS-SPME）技術。勻漿后的果肉放入50 mL 棕色頂空樣品瓶（美國安捷倫公司）中，用封口膜和錫紙將瓶口密封后置于鐵架臺底座。將50/30 μm 二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）涂層的萃取頭（美國色譜科公司）安裝于萃取手柄，在氣相色譜儀上270 ℃老化40 min 以除去萃取頭上吸附的雜質(zhì)，而后固定在鐵架臺上，高度以萃取頭的最低處距樣品最高處1 cm 為宜，萃取在25 ℃且無異味環(huán)境下進行，萃取時長為40 min。每組試驗設置3 次重復。

1.6 GC-MS 分析

采用安捷倫氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析收集到的揮發(fā)物。首先將萃取頭上收集到的揮發(fā)物進行解吸附，將萃取頭插入氣相色譜儀（安捷倫7980B）進樣口250 ℃解吸3 min。解吸得到的混合揮發(fā)物氣體以氦氣為載氣，按 1 mL/min 的流速進入（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷毛細管色譜柱（HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm）對揮發(fā)物組分進行分離。揮發(fā)物進樣采用不分流模式。升溫程序如下：40 ℃保持1 min，以2 ℃/min 的速度上升至60 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min 的速度上升至180 ℃，保持5 min。利用串聯(lián)的質(zhì)譜儀（安捷倫7000C）對揮發(fā)物組分進行分析。質(zhì)譜分析條件如下：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為m/z 35～500。通過比對標準質(zhì)譜圖庫（NIST17）鑒定揮發(fā)物的種類。

1.7 有效揮發(fā)性組分鑒定

黑腹果蠅試驗裝置如1.4 所述，果蠅陷阱管內(nèi)加入5 g 1%瓊脂凝膠作為其水分來源以保障其存活。稱取0.15 g 棉花搓成棉球置于凝固后的瓊脂凝膠上方，試驗組棉球加入500 μL 的待測化合物標準品溶液，對照組加入等體積的石蠟油。將饑餓4 h 的黑腹果蠅雌成蟲放入試驗裝置中，24 h 后統(tǒng)計陷阱管中黑腹果蠅的數(shù)量。

揮發(fā)性組分對斑翅果蠅的行為效應采用圖2 所示試驗裝置進行分析。該裝置由一個500 mL 長方體聚丙烯塑料盒（長172 mm×寬118 mm×高34 mm）和兩根聚丙烯果蠅管（直徑24 mm×高95 mm）組成。塑料盒底部距離中心點65 mm 處的左右兩側(cè)分別開一個直徑25 mm 的圓孔；果蠅管用120 目紗布封口，紗布中央打有直徑3 mm 的小孔，將封口的果蠅管插入塑料盒的圓孔內(nèi)。試驗時在果蠅管中加入10 g 含10%蔗糖的1%瓊脂凝膠，用于保持斑翅果蠅的活力，防止其死亡。將500 μL 待測標準品溶液和對照石蠟油分別加入0.15 g 棉球中放入果蠅管內(nèi)，用紗布封口時盡量確保3 mm 小孔位于果蠅管的正中央，并用封口膜固定紗布。將饑餓4 h 的斑翅果蠅雌蟲放入試驗裝置中，24 h 后統(tǒng)計陷阱管中斑翅果蠅的數(shù)量。

圖2 斑翅果蠅雙陷阱選擇試驗裝置（揮發(fā)物組分測定）Fig.2 Two-choice trap for D.suzukii ( for volatile compound tests)

試驗在25 ℃，70%相對濕度的無異味環(huán)境中進行。設20 次重復，每重復30 頭蟲。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS 軟件[31]進行統(tǒng)計分析，采用配對兩處理t檢驗分析試驗組和對照組陷阱中果蠅數(shù)量的差異顯著性，P＜0.05、P＜0.01 分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 果蠅對不同成熟期草莓果肉的趨性

為了排除果實形狀與顏色對果蠅行為試驗的干擾，本試驗中草莓果肉都進行了勻漿處理。雙選擇陷阱試驗結(jié)果表明，各成熟階段的草莓果肉對黑腹果蠅雌成蟲有極顯著的吸引效果（P＜0.001）。選擇白熟期、紅熟期和腐壞期的草莓果肉的雌成蟲數(shù)量分別是選擇瓊脂凝膠的13.30，4.56，33.53 倍。雌成蟲在白熟期和紅熟期的草莓之間無明顯的偏好（P＝0.9930），而趨向于腐壞的草莓果肉的雌成蟲數(shù)量是趨向紅熟期草莓的11.80 倍，腐壞期草莓果肉對雌成蟲吸引力顯著高于紅熟期草莓（P＜0.001）（圖3A）。

圖3 果蠅雌成蟲對不同成熟期草莓的趨性行為分析Fig.3 Tropism behavior analysis of female flies to strawberries at different mature stages

同樣，各成熟階段的草莓果肉對斑翅果蠅雌成蟲也有極顯著的吸引效果（P＜0.001）。白熟期、紅熟期和腐壞期的草莓果肉陷阱中雌成蟲數(shù)量分別是瓊脂凝膠陷阱的5.35，11.46 和14.42 倍；雌成蟲在白熟期和紅熟期的草莓之間無明顯的偏好（P＝0.9859），然而腐壞期草莓對雌成蟲吸引力顯著高于紅熟期草莓（P＜0.001），腐壞期草莓陷阱中雌成蟲的數(shù)量比紅熟期草莓陷阱中高4.67 倍（圖3B）。

2.2 不同成熟度草莓揮發(fā)物的分析

首先，對20 g、5 g 和1 g 三個不同質(zhì)量的紅熟期草莓樣品揮發(fā)物進行了分析。GC-MS 結(jié)果表明，20 g草莓果肉勻漿萃取40 min 后，獲得的揮發(fā)物共11 種，各組分的峰面積在1.28×107～108.51×107；5 g 草莓樣品測得的揮發(fā)物共有16 種，各組分的峰面積在0.35×107～110.73×107；1 g 草莓樣品測得的揮發(fā)物共有9 種，各組分的峰面積在0.65×107～35.33×107（表1）。揮發(fā)物組分面積與草莓果肉質(zhì)量不呈線性關系，1 g 草莓樣品中測得的揮發(fā)物種類少、組分面積低；5 g 草莓樣品中測得的揮發(fā)物種類最多，20 g 草莓果肉樣品中測得的揮發(fā)物種類反而少于5 g，且僅個別組分的峰面積顯著高于5 g 樣品中組分的峰面積。因此，采用5 g 草莓樣品進行不同成熟期草莓揮發(fā)物組分的收集和分析。

表1 不同質(zhì)量紅熟期草莓揮發(fā)物組分分析Table 1 Analysis of volatiles from strawberries at red-ripe stage with different quality

考慮到兩種果蠅對白熟期和紅熟期的草莓沒有顯著的偏好，因此僅選取了紅熟期和腐壞期兩個成熟階段的草莓進行揮發(fā)物的收集分析。在紅熟和腐壞兩個時期的紅玉草莓中共收集到21種揮發(fā)性化合物（表2），包括18 種酯類物質(zhì)、2 種醛類物質(zhì)和1 種醇類物質(zhì)。僅有己酸乙酯和乙酸己酯在兩個成熟階段的草莓中都被檢測到。乙酸甲酯、丁酸甲酯、己醛、2-己烯醛、己酸甲酯、（Z）-己-2-烯基乙酸酯、己酸-1-甲乙酯、芳樟醇、辛酸甲酯、丁酸己酯和己酸己酯11 種揮發(fā)物組分僅在紅熟期草莓中檢測到；其中，己醛、2-己烯醛和己酸甲酯3 種化合物的相對含量最高（16.27%～24.01%）；而乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯、惕各酸乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和肉桂酸乙酯8 種化合物僅在腐壞期草莓中檢測到，其中，乙酸乙酯的相對含量最高（45.72%），其次為乙酸異戊酯（20.17%）。

2.3 果蠅對揮發(fā)物組分的行為反應

根據(jù)紅熟期和腐壞期草莓揮發(fā)物分析結(jié)果，我們篩選了在腐壞期草莓中相對含量最高的乙酸乙酯、在紅熟期草莓中相對含量較高的己酸甲酯，以及能夠買到標準樣品的一些差異化合物組分包括癸酸乙酯、肉桂酸乙酯和芳樟醇進行了果蠅的行為反應測定。兩種果蠅對5 種草莓揮發(fā)物組分的行為反應一致（圖4，圖5）。僅有乙酸乙酯對兩種果蠅具有顯著的吸引作用，0.005%～0.05%的乙酸乙酯均能顯著吸引兩種果蠅，對黑腹果蠅雌成蟲吸引效果更好（圖4A，圖5A）。兩種果蠅對0.1%的癸酸乙酯、肉桂酸乙酯、己酸甲酯和芳樟醇4 種化合物無行為反應（圖4B，圖5B）。

圖5 斑翅果蠅雌成蟲對5 種草莓揮發(fā)物標準品的行為反應Fig.5 Behavioral responses of D.suzukii female adults to 5 volatile components from strawberries

3 討論

昆蟲的嗅覺系統(tǒng)非常靈敏，能感知植物揮發(fā)性氣味的細微變化從而選擇更合適的寄主。劉燕等[25]利用Y-型嗅覺儀進行試驗，結(jié)果表明相較于生楊梅和半熟楊梅，成熟楊梅果實對斑翅果蠅具有更強的引誘力。本研究參考Karageorgi 等[32]的試驗裝置比較了黑腹果蠅和斑翅果蠅對不同成熟期草莓果肉的行為反應。但斑翅果蠅在進行試驗的24 h 內(nèi)，死亡率達30%～70%。推測可能是由于斑翅果蠅的活動性和生命力不如黑腹果蠅。因此對陷阱管的高度進行了調(diào)整，將果蠅管截斷至40 mm，斑翅果蠅在試驗中的死亡率下降。然而在用該裝置進行揮發(fā)物標準品試驗時，斑翅果蠅的存活率為20%～50%。因此，更換了新的試驗裝置進行試驗（圖2），并在瓊脂凝膠中加入10%的蔗糖，該裝置的優(yōu)點在于陷阱口在其活動區(qū)域下方，降低了斑翅果蠅做出選擇行為的難度。試驗結(jié)果表明與瓊脂凝膠對照相比，無論哪個成熟階段的草莓果肉對兩種果蠅都有顯著的吸引效果。白熟期和紅熟期的草莓對兩種果蠅的吸引效果沒有顯著差異，而腐壞期的草莓對兩種果蠅的吸引力顯著高于紅熟期草莓。Karageorgi 等[32]研究也表明黑腹果蠅和斑翅果蠅的雌蟲偏好取食腐爛草莓，與本試驗研究結(jié)果一致。這可能是由于果實腐壞期產(chǎn)生了大量的酵母，其揮發(fā)物增強了果實對果蠅的吸引力[33]。揮發(fā)物分析結(jié)果表明，紅熟期和腐壞期的草莓揮發(fā)物組成差異較大，僅有乙酸己酯和己酸乙酯兩個組分在兩個成熟階段都有檢測到。紅熟期的草莓揮發(fā)物中2-己烯醛、己酸甲酯、己醛和乙酸己酯的相對含量較高；腐爛期草莓揮發(fā)物中的乙酸乙酯和乙酸異戊酯的相對含量較高，分別為45.72%和20.17%。

寄主揮發(fā)物組分是高效特異性引誘劑研發(fā)的重要線索，已有一些具有吸引效應的揮發(fā)物組分從果蠅寄主中鑒定，如乙酸、己酸、水楊酸甲酯等能吸引果蠅取食或產(chǎn)卵[5]，乙酸異戊酯能引起斑翅果蠅的觸角電位反應[5]。本研究選取了5 種草莓揮發(fā)物組分進行了果蠅行為反應的測試，僅有乙酸乙酯對兩種果蠅有吸引效果。Padilla-Jiménez 等[34]研究表明芳樟醇等化合物在草莓成熟過程中的動態(tài)變化存在很大的品種間差異，本研究中只在紅熟期草莓揮發(fā)物中檢測到少量芳樟醇，兩種果蠅對0.1%的芳樟醇無行為反應。Keesey等[35]研究發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅的ab3A 嗅覺神經(jīng)元對0.1%己酸甲酯有顯著反應，然而在本試驗中，兩種果蠅對0.1%的己酸甲酯沒有行為反應。癸酸乙酯和肉桂酸乙酯僅在腐壞期草莓中檢測到且組分面積較低，兩種果蠅對這兩種低組分面積揮發(fā)物組分在0.1%濃度下均無行為反應。這些結(jié)果表明化合物的吸引效應與其濃度密切相關，需要設置更多不同的濃度才能進一步確定這些化合物是否對果蠅具有引誘效應。

酯類化合物是成熟水果揮發(fā)物的重要組分[27]，也是與草莓果實成熟過程中果香變化密切相關的一類物質(zhì)[36]。本研究在2 個成熟階段的草莓中共檢測到了18 種酯類物質(zhì)。其中，紅熟期草莓中酯類化合物10 種，占所有揮發(fā)物組分總面積的59.72%；腐壞期草莓揮發(fā)物均為酯類化合物，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯4 種組分的峰面積之和占所有組分總面積的89.94%。Padilla-Jimenez 等[34]研究也表明丁酸甲酯、丁酸乙酯、己酸甲酯等酯類化合物在草莓成熟后期的相對含量較高。酯類化合物對果蠅以及實蠅科的昆蟲具有引誘效果。藍莓揮發(fā)物中的乙酸異丁酯、乙酸異戊酯和丁酸乙酯等5 種酯類化合物對斑翅果蠅有顯著吸引效果[26]；啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)物中的3 種酯類物質(zhì)，乙酸辛酯、乙酸苯乙酯和辛酸乙酯對橘小實蠅成蟲有良好的吸引效果[37]。本研究結(jié)果顯示0.005%～0.05%的乙酸乙酯對黑腹果蠅和斑翅果蠅均有顯著的吸引效果，但當濃度降低至0.0025%時，兩種果蠅對乙酸乙酯沒有行為趨性反應。Cha 等[38]研究發(fā)現(xiàn)在乙酸乙醇混合液中添加2%乙酸乙酯對斑翅果蠅的引誘效果顯著下降。這表明果蠅對化合物的行為反應與環(huán)境中其他化合物組分的協(xié)同效應等相關，這可能也是其對不同成熟期果實有偏好差異的原因。乙酸乙酯吸引或趨避果蠅的濃度邊界還有待進一步研究。同時，這一有效吸引果蠅的化合物組分需要田間試驗以進一步明確其在果蠅防治中的應用價值。