梁紅敏，高德艷，全巧玲，王 聰，郭亞蕓，史紅梅,*

（1.山東省葡萄研究院，山東 濟(jì)南 250100；2.哈密市食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 哈密 839000；3.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100）

還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）是一種重要的抗氧化劑，作為親核物質(zhì)直接與反應(yīng)性親電試劑結(jié)合，維護(hù)食品和飲料的氧化穩(wěn)定性[1-3]。在白葡萄酒生產(chǎn)工藝中添加GSH對保持品種特性和顏色穩(wěn)定性具有有益影響，GSH已受到世界各國學(xué)者和釀酒師的廣泛關(guān)注。

目前國外關(guān)于GSH對葡萄酒影響的研究較多，多見于GSH對葡萄酒酒精發(fā)酵階段及瓶儲階段的影響，而國內(nèi)研究較少。梁曉芳等[4]發(fā)現(xiàn)在干白葡萄酒模擬氧化過程中，GSH可以保護(hù)干白葡萄酒的顏色，延長存放時(shí)間。Roussis[5]和Ugliano[6]等在葡萄酒瓶儲前，采取添加外源食品級GSH的方法可以防止葡萄酒的氧化和香氣的喪失，GSH水平在酒的貯藏過程中降低，但它對重要的芳香化合物如酯類、單萜烯類和揮發(fā)性硫醇具有保護(hù)作用。Webber等[7]在裝瓶時(shí)加入GSH會減少乙醛的積累，并在貯藏12 個(gè)月后保持芳香的復(fù)雜性和新鮮度。也有研究表明，在某些條件下GSH這些抗氧化劑可能不能提供預(yù)期的保護(hù)，甚至破壞白葡萄酒的最終顏色[8]。GSH對葡萄酒中多酚類、芳香類等物質(zhì)的影響及其作用機(jī)制尚不完全明確，對葡萄酒的氧化穩(wěn)定性的影響也依賴于GSH的使用劑量及添加方式（包括添加時(shí)間、添加步驟等）。針對不同的葡萄品種、產(chǎn)品類型和釀造工藝，確定合適的GSH添加時(shí)間和用量非常重要，同時(shí)也需要綜合運(yùn)用多種分析技術(shù)探索GSH對葡萄酒品質(zhì)影響的機(jī)制。

代謝組學(xué)是近年來組學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。Romanini等[9]通過高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，對瓶裝白葡萄酒的氧化程度進(jìn)行研究，對氧化水平和化合物進(jìn)行了鑒定。Nikolantonaki等[10]采用感官和超高分辨率質(zhì)譜代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽對陳年霞多麗葡萄酒氧化穩(wěn)定性的影響與葡萄酒中含N和S的化合物如氨基酸、芳香族化合物和肽等物質(zhì)的抗氧化代謝有關(guān)系。在白葡萄酒發(fā)酵完成后加入GSH對裝瓶前陳釀期間的影響尚不清楚，本研究以發(fā)酵結(jié)束后的霞多麗葡萄酒為研究對象，采用化學(xué)參數(shù)、廣泛靶向代謝組學(xué)與揮發(fā)性代謝組學(xué)相結(jié)合的技術(shù)研究在低SO2濃度下，不同添加量GSH對葡萄酒主要指標(biāo)及代謝物的影響，并對其作用機(jī)理進(jìn)行探討，從而為GSH在白葡萄酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霞多麗白葡萄于2021年10月采自山東蓬萊龍湖農(nóng)業(yè)種植有限公司。

葡萄酒專用酵母（EC1118） 安琪酵母股份有限公司；沒食子酸（gallic acid，GAE）標(biāo)準(zhǔn)品、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、福林-酚試劑 美國Sigma公司；GSH（分析純，純度＞98%） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

8890-7000D氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；Nexera X2超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（配有應(yīng)用生物系統(tǒng)4500 qtrap） 日本島津公司；雷磁pHS-3C型pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV5200紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；TDL-5型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 霞多麗白葡萄酒發(fā)酵工藝流程

霞多麗白葡萄除梗、壓榨取汁，分別添加0.02 g/L果膠酶，0.08 g/L SO2（焦亞硫酸鉀），10～12 ℃澄清24 h，添加0.20 g/L的酵母EC1118于18～20 ℃低溫發(fā)酵，還原糖低于2 g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)酒的理化指標(biāo)為乙醇體積分?jǐn)?shù)12.67%，還原糖1.36 g/L，揮發(fā)酸0.40 g/L（以乙酸計(jì)），總酸5.49 g/L（以酒石酸計(jì)），pH值為3.36，游離SO215.78 mg/L。發(fā)酵完成15 d后倒罐進(jìn)行罐儲實(shí)驗(yàn)。霞多麗白葡萄酒分裝于12 L的不銹鋼桶中，滿罐儲存，分別添加0、5、10、15、20、30 mg/L GSH，每組實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)重復(fù)。以添加0 mg/L GSH的酒樣作為對照，添加完成1 個(gè)月后第1次取樣，每月取樣1 次，共取樣5 次。每月測定基本理化指標(biāo)、總酚、總黃酮等。第5個(gè)月另取差異較為明顯的處理（T）和對照組酒樣（CK）進(jìn)行廣泛靶向代謝組學(xué)和揮發(fā)性代謝組學(xué)分析，每組做3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

揮發(fā)酸、總酸、p H 值、游離二氧化硫按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測定；總酚測定參考王華[11]的方法；總類黃酮測定參考Kim等[12]的方法；顏色指數(shù)測定參考Webber等[3]的方法，略有修改，即取4 mL酒樣，于4 000 r/min離心15 min，吸取上清液在波長420 nm處測定吸光度，以吸光度表示其顏色指數(shù)。

1.3.3 廣泛靶向代謝組學(xué)分析

樣品提取流程：從-80 ℃冰箱中取出樣品解凍，解凍后渦旋10 s。取混勻后的樣品5 mL裝于10 mL離心管，將離心管浸入液氮中，待樣本完全凍住后將樣品置入凍干機(jī)中凍干。加入500 μL 70%甲醇內(nèi)標(biāo)提取液，渦旋混勻15 min后4 ℃、12 000 r/min離心3 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

液相色譜條件：SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）對目標(biāo)化合物進(jìn)行分離，流動相A相為超純水，加入0.1%甲酸，B相為乙腈，加入0.1%甲酸；流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量4 μL，柱溫40 ℃；洗脫程序：0～9 min，95%～5% A、5%～95% B；5% A、95% B，維持1 min；10～11.1 min，5%～95% A、95%～5% B；95% A、5% B平衡14 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V（正離子模式）/-4 500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體I，氣體II和氣簾氣分別設(shè)置為50、60 psi和25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。分別用10 μmol/L和100 μmol/L聚丙二醇溶液在三重四極桿（triple quadrupole，QQQ）和LIT模式下進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。通過優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能，完成各個(gè)離子對的掃描與檢測。代謝物定量是采用QQQ-質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行分析。

1.3.4 揮發(fā)性代謝組學(xué)分析

樣品提取流程：從-80 ℃冰箱中取出樣品，解凍后渦旋混合均勻，每個(gè)樣本取1 mL于頂空瓶中，分別加入飽和NaCl溶液，10 μL（50 μg/mL）內(nèi)標(biāo)溶液（乙酸芐酯），進(jìn)行全自動頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）。

HS-SPME萃取條件：120 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭250 ℃老化5 min，樣品在60℃恒溫條件下，振蕩5 min，頂空萃取15 min，250 ℃解吸5 min。萃取頭采用SPME Arrow。

DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃/min升至100 ℃，再以7 ℃/min升至180 ℃，最后以25 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。流速1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲3.5 min，載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%）。電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)譜接口溫度280 ℃；掃描方式為選擇離子檢測模式，定性定量離子精準(zhǔn)掃描（GB 23200.8—2016《水果和蔬菜中500 種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0及Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以±s表示。采用Waller-Duncan事后檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。采用R語言軟件（https://www.r-project.org/）對鑒定出的代謝產(chǎn)物進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）以及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。根據(jù)獲得變量重要性投影（variable importance in projection，VIP），結(jié)合單變量分析的P值或差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）進(jìn)一步篩選差異代謝物（significant changed metabolites，SCMs），然后將差異代謝物通過代謝通路數(shù)據(jù)庫京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（www.genome.jp/kegg）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH添加量對霞多麗葡萄酒貯藏期間理化指標(biāo)影響

如表1所示，隨著貯藏時(shí)間的延長，各組酒樣揮發(fā)酸含量略有升高，總酸含量降低，添加GSH組酒樣與對照組相比，揮發(fā)酸含量無顯著差異，總酸含量與對照相比略微降低，這可能是因?yàn)槠咸丫频乃犷愔饕捎袡C(jī)酸組成，添加GSH后，GSH能與酒中的有機(jī)酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致部分酸含量降低，或者能夠抑制某些醇類和醛類氧化成酸[4]。pH值在貯藏過程中變化不大，而且不隨GSH添加量的變化有明顯差異。

表1 GSH對霞多麗葡萄酒貯藏期間理化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of GSH on physicochemical indexes of Chardonnay wine during storage

SO2與GSH之間存在協(xié)同作用，而且在釀造酒過程中添加GSH的步驟不同，可能造成不同的影響[1,13]。由表1可知，在貯藏過程中，游離SO2含量逐漸降低，添加GSH能夠延緩SO2含量的下降，貯藏5 個(gè)月后，添加20 mg/L GSH的酒樣SO2含量最高。有研究表明在起泡酒的基酒中與成品起泡酒中添加GSH，游離SO2的變化不同，在基酒中添加GSH，游離SO2含量比較穩(wěn)定，而在成品酒中GSH有保護(hù)游離SO2的作用[7]。因此，GSH對SO2的作用與GSH添加時(shí)間有關(guān)系，這可能與酒所處環(huán)境的穩(wěn)定性有關(guān)，環(huán)境的穩(wěn)定性影響酒中的溶解氧水平，進(jìn)而影響GSH和SO2的協(xié)同作用[3]。

隨著貯藏時(shí)間的延長，各組總酚含量、類黃酮含量逐漸升高，添加GSH的酒樣總酚含量比對照組高，而總類黃酮含量沒有明顯差異，在第5個(gè)月時(shí)，添加30 mg/L GSH的酒樣總酚含量最高。多酚含量的變化與Vaimakis[14]和Xu Junnan[15]等研究結(jié)果一致，在貯藏過程中酚類化合物的氧化有2 種即酶促氧化和非酶促氧化，貯藏期間谷胱甘肽傾向于還原環(huán)境，可以在很大程度上抑制非酶促氧化，GSH與多酚生成的鄰醌類化合物發(fā)生反應(yīng)，形成谷胱甘酰咖啡酰酒石酸，其具有鄰二羥基苯酚結(jié)構(gòu)能被測量為總酚，這可能是添加谷胱甘肽能提高總酚含量的主要原因[7,14]。

根據(jù)顏色指數(shù)的數(shù)據(jù)變化分析，不同添加量GSH都有助于防止霞多麗白葡萄酒氧化褐變，添加20 mg/L GSH的酒樣顏色指數(shù)在第5個(gè)月最低。GSH防止褐變的作用主要與它和鄰醌類化合物的反應(yīng)性有關(guān)，鄰醌類化合物是酚類化合物氧化的產(chǎn)物[16]，其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致鄰醌類化合物之間或與蛋白質(zhì)、氨基酸、酚類化合物等容易發(fā)生聚合[17]，這些聚合反應(yīng)可以產(chǎn)生深色聚合物，并導(dǎo)致果酒褐變。有研究表明添加30 mg/L GSH，會引起顏色加深，原因是多余的GSH可能與羰基化合物反應(yīng)形成加合物，這些加合物又可能會反應(yīng)形成深色聚合物，但這仍然是一個(gè)假設(shè)，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)[7]。在本研究中，添加30 mg/L GSH的酒樣顏色指數(shù)低于對照組，與前人的研究結(jié)果不一致[7,14]，也可能是因?yàn)檠b瓶之前貯藏期5 個(gè)月時(shí)間較短引起的。

2.2 GSH對霞多麗葡萄酒貯藏期間非揮發(fā)性代謝物的影響

2.2.1 對照組和GSH組樣品代謝組成分總體分析

貯藏5 個(gè)月后，添加20 mg/L GSH的酒樣顏色指數(shù)最低，選擇添加20 mg/L GSH的酒樣處理組（T）與對照組（CK）進(jìn)行代謝組學(xué)分析。首先采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，通過與公共數(shù)據(jù)庫的串聯(lián)質(zhì)譜譜圖信息以及MetWare自建代謝物數(shù)據(jù)庫的標(biāo)品進(jìn)行比對，對CK組酒樣與T組樣品中的初生和次級代謝物進(jìn)行鑒定，一共鑒定出693 種代謝物，其中氨基酸及其衍生物112 種、酚酸145 種、核苷酸及其衍生物42 種、有機(jī)酸91 種、脂質(zhì)46 種、黃酮78 種、木質(zhì)素和香豆素12 種、生物堿73 種、其他代謝物94 種。對樣本進(jìn)行PCA，了解樣本間總體代謝差異及組內(nèi)變異情況，PCA結(jié)果如圖1a所示，添加GSH的樣品主要分布在PC1的正半軸上，而對照組樣品在PC1的負(fù)半軸上，表明這2 組樣本在橫坐標(biāo)方向呈現(xiàn)分離，從總體上能反映出添加GSH組樣本與對照組之間存在代謝物差異。根據(jù)OPLS-DA模型分析代謝組數(shù)據(jù)，繪制各分組的得分圖，進(jìn)一步展示各個(gè)分組之間的差異。如圖1b所示，對照組和添加GSH組3 個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)點(diǎn)分別位于置信區(qū)間的左側(cè)和右側(cè)，表明這2 組樣本能夠被明顯區(qū)分效果，組間存在代謝差異。對OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證，預(yù)測參數(shù)R2Y、Q2值大小分別為1、0.786，均大于0.5，模型具有良好的預(yù)測能力，也不存在過擬合現(xiàn)象。

圖1 樣品代謝組PCA（a）及OPLS-DA（b）圖Fig.1 PCA (a) and OPLS-DA (b) plots of non-volatile metabolites in wine samples

2.2.2 差異代謝物篩選與分析

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)VIP大于1.0和FC不小于1.4篩選不同的代謝物，總共篩選出33 種差異代謝物質(zhì)，占總代謝物種類的5.48%，說明霞多麗葡萄酒發(fā)酵結(jié)束后在罐內(nèi)儲存期間，添加20 mg/L GSH對非揮發(fā)性代謝物的變化具有一定影響，但篩選出差異代謝物質(zhì)的種類較少。有17 種代謝物在添加20 mg/L GSH后相對含量下降，包括黃酮4 種、酚酸類1 種、生物堿3 種、有機(jī)酸1 種、脂質(zhì)3 種、氨基酸及其衍生物1 種、有機(jī)酸酯1 種、芪類1 種以及糖類物質(zhì)2 種；共有16 種代謝物質(zhì)相對含量增加，包括黃酮1 種、酚酸類5 種、香豆素1 種、生物堿5 種以及氨基酸及其衍生物4 種，其中黃酮類、脂質(zhì)以及生物堿類化合物顯著差異代謝物下調(diào)比例較高，酚酸類、生物堿類以及氨基酸及其衍生物差異代謝物上調(diào)比例較高（圖2）。

圖2 差異代謝物火山圖Fig.2 Volcano plot of significantly differential metabolites

VIP值大于1.5的物質(zhì)中，按照VIP值從大到小排序依次為甘氨酰色氨酸、甲氧基吲哚乙酸、乳二糖、吲哚-3-乳酸、4’-羥基-5,7-二甲氧基黃烷酮、1-甲氧基-吲哚-3-乙酰胺、川陳皮素（5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮）、L-吖啶-2-羧酸、氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸、鄰苯二甲酸二異丁酯、色醇、N-乙酰-β-丙氨酸、吲哚-2-甲酸、3-氨基甲酰-1-甲基氧化吡啶、γ-亞麻酸、橘皮素（4’,5,6,7,8-五甲氧基黃酮）、13-甲基十四烷酸、芐基水楊酸、沒食子兒茶素，這19 種物質(zhì)中，甘氨酰色氨酸屬于氨基酸類物質(zhì)，對整個(gè)模型的貢獻(xiàn)率最大，其他物質(zhì)依次遞減。根據(jù)代謝物定量信息發(fā)生的差異倍數(shù)，篩選出差異倍數(shù)前20的代謝物，繪制柱狀圖，有10 種上調(diào)和10 種下調(diào)代謝物（圖3）。

圖3 差異代謝物柱狀圖Fig.3 Top 20 significantly differential metabolites

酚酸類化合物主要包括對羥基苯甲酸以及對羥基苯丙烯酸的衍生物，它可與糖、醇、有機(jī)酸等結(jié)合形成酯類化合物。羥基肉桂酸類物質(zhì)又稱羥基苯丙烯酸類酚酸，包括咖啡酸、香豆酸、阿魏酸等，它們是白葡萄酒中含量較多的酚酸類物質(zhì)，容易發(fā)生氧化褐變，從而導(dǎo)致顏色和香氣的喪失，降低白葡萄酒的質(zhì)量[18]。白葡萄酒添加20 mg/L GSH，貯藏5 個(gè)月后，酚酸類物質(zhì)中沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、芐基水楊酸、乙酸丁香酚酯等得到了積累，GSH保護(hù)這些酚酸類物質(zhì)不被氧化，其中PG具有清除自由基、阻止生物膜多種不飽和脂肪酸過氧化以及保護(hù)抗氧化酶活性的作用，還對各種細(xì)胞如肺癌細(xì)胞等有抗增殖作用，PG的抗增殖作用與活性氧和谷胱甘肽水平有關(guān)[19]。白葡萄酒中咖啡酸、香豆酸和阿魏酸的相對含量沒有明顯差異，這與Panero[1]和Webber[7]等的研究結(jié)果一致。

黃酮類物質(zhì)是葡萄酒中重要的一類酚類化合物，與葡萄酒的苦味和色澤密切相關(guān)[20-21]。有研究表明白葡萄酒陳釀過程中的褐變也可能與酒中存在的黃烷醇類化合物如兒茶素和表兒茶素有關(guān)[22]。Webber等[7]發(fā)現(xiàn)在起泡酒釀造的葡萄酒基酒中添加GSH后，兒茶素和表兒茶素的含量與對照組相比沒有變化，顏色指數(shù)也沒有變化。徐俊南[23]研究發(fā)現(xiàn)在蘋果酒中添加GSH和接種GSH預(yù)培養(yǎng)的釀酒酵母能顯著降低兒茶素的含量。在本研究中，黃烷-3-醇類物質(zhì)如總兒茶素水平?jīng)]有顯著差異（P＞0.05），沒食子兒茶素、表兒茶素-4’-O-β-D-葡萄糖苷等相對含量下降。黃烷-3-醇類會在含有醛基物質(zhì)的介導(dǎo)作用下參與聚合反應(yīng)，如乙醛、乙醛酸等。乙醛、乙醛酸能通過異構(gòu)和質(zhì)子化形成半縮醛類物質(zhì)，這種物質(zhì)帶有親電性，能夠攻擊黃烷醇類C6或C8位的碳原子，然后脫水形成帶黃烷醇的碳正離子，這些帶正電的碳原子進(jìn)一步攻擊其他半縮醛分子的C6或C8位，形成聚合黃烷醇類或者花色苷類物質(zhì)，聚合黃烷醇類可以通過脫水氧化形成呫噸鎓，此反應(yīng)被認(rèn)為是引起葡萄酒尤其是白葡萄酒發(fā)生顏色褐變的原因之一[24]，添加20 mg/L GSH酒樣中沒食子兒茶素表達(dá)量下調(diào)，證明此物質(zhì)很有可能與GSH防止白葡萄酒的氧化褐變有關(guān)。另外，黃酮類物質(zhì)中川陳皮素、橘皮素、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黃酮的相對含量下降，由于黃酮類物質(zhì)屬于有色多酚，這些物質(zhì)含量的下降，也許與GSH能夠延緩顏色褐變有關(guān)[25]，其原理需要進(jìn)一步的研究。

在檢測到的46 種脂質(zhì)代謝物包括游離脂肪酸、甘油酯、溶血磷脂酰膽堿和鞘酯中，3 種游離脂肪酸（γ-亞麻酸、13-甲基十四烷酸、順-10-十五碳烯酸）明顯下調(diào)。脂肪酸在芳香物質(zhì)合成中起重要作用，游離脂肪酸的降低可能與酒中一些香氣成分的形成有關(guān)[26-27]。氨基酸與葡萄酒的褐變密切相關(guān)，因?yàn)樗鼌⑴c美拉德反應(yīng)，美拉德反應(yīng)是氨基化合物（氨基酸或蛋白質(zhì)）與還原糖反應(yīng)形成棕色或者黑色的大分子物質(zhì)，導(dǎo)致酒的非酶褐變。氨基酸負(fù)責(zé)葡萄酒中一些典型香氣或陳年香氣的產(chǎn)生，這與美拉德反應(yīng)有關(guān)[28]。氨基酸中甘氨酰色氨酸、3,4-二羥基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、3-氰基-L-丙氨酸發(fā)生上調(diào)，N-乙酰-β-丙氨酸下調(diào)，上調(diào)的比例顯著高于下調(diào)的比例，說明GSH對酒中的氨基酸具有保護(hù)作用，因而可能會降低因氨基酸引起的非酶褐變。

2.3 GSH對霞多麗葡萄酒貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)代謝物的影響

采用新型HS-SPME Arrow與氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，對添加GSH前后酒的揮發(fā)性代謝物質(zhì)進(jìn)行鑒定及差異分析，一共檢測到816 種代謝物，OPLS-DA模型得分圖見圖4，組間存在一定的代謝差異，對OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證，預(yù)測參數(shù)R2Y、Q2值分別為0.994、0.749，均大于0.5，表明模型具有良好的預(yù)測能力，也不存在過擬合現(xiàn)象。根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)VIP值大于1.0和FC不小于1.4篩選不同的代謝物，總共篩選出22 種差異代謝物質(zhì)，只占代謝物總量的2.70%，說明添加20 mg/L GSH對霞多麗白葡萄酒在裝瓶之前貯藏期間的揮發(fā)性物質(zhì)總體影響不大。在這22 種差異代謝物中，有3 種物質(zhì)下調(diào)，19 種物質(zhì)上調(diào)，即有3 種揮發(fā)性物質(zhì)添加20 mg/L GSH后相對含量下降，包括1 種酯類（順式-6-壬烯-1-醇乙酸酯）、1 種醛類（棕櫚醛）、1 種烴類物質(zhì)（2,6-二甲基癸烷）；共有19 種揮發(fā)性物質(zhì)相對含量增加，包括4 種酯類（乙酸二乙氧基甲酯、1’-乙酰氧基茶酚乙酸酯、十五烷酸乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯）、5 種萜類（惕各酸香茅酯、[2R-(2α,4α,8αβ)]-1,2,3,4,4α,5,6,8α-八氫-α,α,4α,8-四甲基-2-萘甲醇、1-亞甲基-4-(1-甲基乙烯基)-環(huán)己烷、乙酸二氫香芹酯、(1R,4aR,7R,8αR)-7-(2-羥基丙烷-2-基)-1,4α-二甲基十氫萘-1-醇）、3 種芳烴類（苯乙烯、1,1’-[氧雙(亞甲基)]雙苯、α-甲基苯乙烯）、2 種酮類（1,2,3,5,6,7-六氫-1,1,2,3,3-五甲基-4H-茚滿-4-酮、3-氯-2,4-戊二酮）、2 種烴類（3-乙基-2-甲基-1,3-己二烯、2,6-二甲基癸烷）、2 種酸類（對甲基苯乙酸、4-羥基-苯丙酸）以及1 種雜環(huán)類物質(zhì)（苯并呋喃），與對照組相比，添加20 mg/L GSH白葡萄酒中差異揮發(fā)性物質(zhì)上調(diào)的物質(zhì)種類明顯高于下調(diào)的物質(zhì)種類，其中酯類、萜烯類和芳烴類為差異個(gè)數(shù)最多的3 類成分，表明添加20 mg/L GSH對白葡萄酒的揮發(fā)性物質(zhì)如酯類、萜烯類、芳烴類等具有保護(hù)作用。之前的研究也表明在葡萄酒的陳釀過程中添加GSH對香氣有保護(hù)作用，尤其是酯類、萜烯類以及揮發(fā)性硫醇類物質(zhì)[29]。酯類物質(zhì)是葡萄酒中主要的呈香物質(zhì)，它們具有果香和花香，萜烯類物質(zhì)賦予葡萄酒的品種香氣，具有生理活性，對身體健康大有好處但萜烯類物質(zhì)容易氧化。GSH能夠保護(hù)葡萄酒的芳香物質(zhì)，可能與它含有游離的—SH組分有關(guān)，—SH結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的氧化還原和親核性質(zhì)，還具有清除自由基和過氧化物的作用[30-31]。

圖4 樣品代謝組OPLS-DA圖Fig.4 OPLS-DA plot of volatile metabolites in wine samples

2.4 關(guān)鍵非揮發(fā)性代謝物對霞多麗葡萄酒揮發(fā)性代謝物的影響

葡萄酒中主要有非揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分，這些成分對其風(fēng)味和香氣起著重要的作用。非揮發(fā)性代謝物（多酚類化合物、氨基酸、脂肪酸、糖等）和揮發(fā)性代謝物（酯類、萜烯類、醇類等）之間的相互作用會影響葡萄酒的感官和化學(xué)性質(zhì)。將33 種非揮發(fā)性差異代謝物進(jìn)行KEGG注釋和通路富集分析發(fā)現(xiàn)，有10 種被注釋到14 條代謝途徑中，如圖5所示。添加20 mg/L GSH的酒樣游離脂肪酸γ-亞麻酸參與不飽和脂肪酸的生物合成途徑且在白葡萄酒中下調(diào)表達(dá)，另外2 種游離脂肪酸（13-甲基十四烷酸、順-10-十五碳烯酸）相對含量降低。脂肪酸在脂氧合酶、氫過氧化物裂解酶和乙醇脫氫酶的催化作用下形成醛類和醇類，并且它們進(jìn)一步轉(zhuǎn)化形成相應(yīng)的酯[26]。氨基酸類中的差異代謝物質(zhì)N-乙酰-β-丙氨酸參與β-丙氨酸代謝通路且下調(diào)表達(dá)，這可能與酒中揮發(fā)性酯類和酸類的生成有關(guān)。一些酚酸類物質(zhì)在葡萄酒中會抑制酯類物質(zhì)的揮發(fā)，將香氣化合物保留在葡萄酒基質(zhì)中，從而有利于酒液中酯類物質(zhì)的保留，使得酒體整體香氣強(qiáng)度和品質(zhì)提高[32-33]。添加20 mg/L GSH的酒樣酚酸類物質(zhì)的上調(diào)比例較高，其中PG、芐基水楊酸、乙酸丁香酚酯等得到了積累，這些酚酸類物質(zhì)的對香氣的作用還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

圖5 不同差異非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物途徑的富集分析Fig.5 Enrichment analysis of differential nonvolatile metabolite pathways

3 結(jié) 論

發(fā)酵結(jié)束后的霞多麗葡萄酒在貯藏期間，隨著貯藏時(shí)間的延長，各組酒樣揮發(fā)酸含量略有升高，總酚、類黃酮含量升高、顏色指數(shù)上升，總酸、游離SO2含量降低，pH值基本不變；添加GSH對葡萄酒揮發(fā)酸、總酸及pH值無顯著影響，總酚、類黃酮含量發(fā)生變化。不同添加量GSH都能夠延緩SO2含量的下降而且都有防止霞多麗葡萄酒氧化褐變的作用，添加20 mg/L GSH的酒樣顏色指數(shù)最低，防止霞多麗葡萄酒氧化褐變效果最好。

采用廣泛靶向代謝組學(xué)與揮發(fā)性代謝組學(xué)分析添加20 mg/L GSH前后霞多麗白葡萄酒非揮發(fā)性和揮發(fā)性代謝物的變化，一共檢測出693 種非揮發(fā)性代謝物和816 種揮發(fā)性代謝物，分別篩選出33 種重要的非揮發(fā)性差異代謝物和22 種揮發(fā)性差異代謝物。GSH的添加使差異物質(zhì)中酚酸類上調(diào)種類較多，黃酮類下調(diào)種類較多，脂肪酸類物質(zhì)都下調(diào)、除N-乙酰-β-丙氨酸外，其他氨基酸類物質(zhì)都發(fā)生上調(diào)。GSH對葡萄酒的酯類、萜烯類、芳烴類具有保護(hù)作用。進(jìn)一步分析說明了葡萄酒中一些酚酸類、脂肪酸以及氨基酸類物質(zhì)可能對酒的揮發(fā)性成分有著重要影響。本研究結(jié)果為GSH在白葡萄酒中的應(yīng)用以及對代謝物的形成機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。