張樂(lè)平，涂 追*，李燕萍3，李小江，帥文苑，張 航，何慶華3

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與資源挖掘全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

類彈性蛋白多肽（elastin-like polypeptide，ELP）是一種利用基因工程方法人工合成的蛋白質(zhì)聚合物，具有良好的生物相容性[1-2]。ELP由n個(gè)重復(fù)氨基酸序列“V-PG-X-G”組成，其中殘基“X”可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸。當(dāng)溫度高于相變溫度時(shí)，ELP具有從可溶狀態(tài)向沉淀狀態(tài)轉(zhuǎn)變的能力[3-4]。除溫度外，一定濃度的鹽離子、pH值也可以誘發(fā)ELP的相變[5]。當(dāng)溫度降低、鹽離子濃度降低或在其他刺激作用存在時(shí)，ELP的相變可逆[6]。在過(guò)去的20年里，已有使用ELP標(biāo)簽純化蛋白質(zhì)的各種方法。早在1999年，Meyer等[7]就將ELP與蛋白質(zhì)融合，利用可逆相變循環(huán)（inverse transition cycling，ITC）使其從復(fù)雜混合物中分離出來(lái)，再利用蛋白酶將ELP標(biāo)簽切除掉。Shi Changhua等[8]開(kāi)發(fā)了一種基于內(nèi)含子剪接與雙ELP標(biāo)簽的新型蛋白質(zhì)純化平臺(tái)，純化得到了4 種不同分子質(zhì)量大小的目的蛋白。Coolbaugh等[9]將自切割內(nèi)含子與ELP標(biāo)簽結(jié)合，于微滴定孔板中純化了綠色熒光蛋白與半乳糖苷酶，開(kāi)發(fā)了高通量純化蛋白的親和沉淀法。Fan Yamin等[10]使用分裂內(nèi)含子與ELP標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白與純化標(biāo)簽間的受控切割。除此以外，利用親和配體與ELP融合表達(dá)，可用于捕獲和沉淀所需要的產(chǎn)物，避開(kāi)隨后從產(chǎn)物中切割ELP標(biāo)簽的步驟。Swartz等[11]將蛋白A的Z結(jié)構(gòu)域與ELP標(biāo)簽融合表達(dá)，用于純化單克隆抗體。Kostal等[12]利用細(xì)菌金屬調(diào)節(jié)蛋白對(duì)DNA的特異親和性以及ELP蛋白的相變特性實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒DNA純化。然而，ELP作為融合標(biāo)簽在蛋白純化方面的應(yīng)用廣泛，卻鮮少見(jiàn)于小分子的純化處理。

真菌毒素是食品中常見(jiàn)的小分子污染物，其種類繁多、毒性強(qiáng)、不易降解，對(duì)人體健康存在著極大威脅。日常生活中的食品種類極多、成分復(fù)雜，真菌毒素含量通常又極低，使用分析儀器直接定量檢測(cè)很難實(shí)現(xiàn)，對(duì)食品樣品進(jìn)行前處理以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物的富集純化有助于提高檢測(cè)靈敏度[13]。目前，各類食品中真菌毒素樣品前處理的方法主要有液相萃取法[14]、固相萃取法[15]、磁顆粒輔助提取法[16]、超聲輔助提取法[17]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法[18]、免疫親和柱法[19]等。其中，免疫親和柱法雖然具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，也是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的黃曲霉毒素提取方法，卻存在制作工藝復(fù)雜、成本高昂、污染環(huán)境等問(wèn)題。

為了解決免疫親和柱制備過(guò)程中抗體偶聯(lián)的不可控性，降低成本，建立環(huán)境友好型的黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）純化新方法，本研究構(gòu)建納米抗體與不同長(zhǎng)度ELP融合表達(dá)的重組載體，將轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)后的4 種蛋白分別以稀釋復(fù)性、ITC純化、透析復(fù)性、柱上復(fù)性的方式進(jìn)行復(fù)性。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析4 種復(fù)性方式得到4 種蛋白純度與含量，間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定其IC50差異，相對(duì)濁度分析測(cè)定其相變溫度，圓二色譜分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)組成。旨在為后續(xù)建立以納米抗體作為識(shí)別單元的可控相變生物純化介質(zhì)，用于AFB1檢測(cè)樣品前處理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宿主菌大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、表達(dá)載體pET30a-G8-GFP由本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pUC57-ELP10由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

限制性內(nèi)切酶（EcoRI、DraIII、BglI）、T4-DNA連接酶 紐英倫生物技術(shù)（北京）公司；限制性內(nèi)切酶（SfiI、NotI）、rTaqDNA聚合酶、dNTP 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；尿素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、精氨酸、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺單組分顯色液 索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nanodrop1000微量分光光度計(jì)、多功能讀數(shù)儀、低溫高速離心機(jī) 賽默飛世爾上海（儀器）有限公司；SDS-PAGE電泳儀、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；CT62A全自動(dòng)滅菌鍋 馳通儀器（上海）有限公司；JY92-IIDN超聲破碎儀 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 G8-ELP20、G8-ELP40、G8-ELP60、G8-ELP80融合表達(dá)載體的構(gòu)建

退火寡核苷酸單鏈引物H1-F和H1-R見(jiàn)表1，退火條件設(shè)定為：95 ℃變性2 min；95 ℃降溫到25 ℃，每8 s降低0.1 ℃，共設(shè)置700 個(gè)循環(huán)；4 ℃冷卻10 min；以SfiI和NotI雙酶切pET30a-G8-GFP載體，與退火寡核苷酸片段進(jìn)行連接，得到改造后的重組載體pET30a-G8（R）。

表1 載體構(gòu)建相關(guān)引物序列Table 1 Primer sequences used for vector construction

ELP重復(fù)片段的連接通過(guò)遞歸定向連接法[20]實(shí)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。以EcoRI和DraIII雙酶切pUC57-ELP10載體，回收較長(zhǎng)片段，同時(shí)以EcoRI和BglI雙酶切pUC57-ELP10載體，回收較短片段，16 ℃過(guò)夜連接得到重組載體pUC57-ELP20；以EcoRI和DraIII雙酶切pUC57-ELP20載體，回收較長(zhǎng)片段，同時(shí)以EcoRI和BglI雙酶切pUC57-ELP20載體，回收較短片段，連接后得到重組載體pUC57-ELP40；以EcoRI和DraIII雙酶切pUC57-ELP40載體，回收較長(zhǎng)片段，同時(shí)以EcoRI和BglI雙酶切pUC57-ELP20載體，回收較短片段，連接后得到重組載體pUC57-ELP60；以EcoRI和DraIII雙酶切pUC57-ELP40載體，回收較長(zhǎng)片段，同時(shí)以EcoRI和BglI雙酶切pUC57-ELP40載體，回收較短片段，連接后得到重組載體pUC57-ELP80。將上述載體轉(zhuǎn)化后挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證插入片段大小是否正確，并以pUC57-F/pUC57-R引物（表1）測(cè)序確認(rèn)核苷酸序列的正確性。

圖1 遞歸定向連接得到多重復(fù)序列Fig.1 Cloning of ELP of different lengths by RDL

以SfiI和NotI雙酶切pET30a-G8（R），回收較長(zhǎng)載體片段，以SfiI和NotI雙酶切pUC57-ELP20、pUC57-ELP40、pUC57-ELP60、pUC57-ELP80重組載體，回收較短目的片段，連接后得到重組表達(dá)載體pET30a-G8-ELP20、pET30a-G8-ELP40、pET30a-G8-ELP60、pET30a-G8-ELP80，轉(zhuǎn)化后挑取單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行XbaI和NotI雙酶切驗(yàn)證插入片段大小是否正確，并以T7-F/T7 Ter-R引物（表1）測(cè)序確認(rèn)核苷酸序列的正確性。

1.3.2 重組蛋白G8-ELP20、G8-ELP40、G8-ELP60、G8-ELP80的表達(dá)

將攜帶重組載體的大腸桿菌BL21（DE3）菌株接種于含50 μg/mL卡那霉素的5 mL LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，以1%接種量轉(zhuǎn)接至含50 μg/mL卡那霉素的800 mL LB培養(yǎng)基中，于兩只2 L搖瓶中37 ℃、220 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，30 ℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)，菌液離心后收集菌體沉淀，用80 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0）重懸，分裝后于超聲破碎儀中破碎，破碎條件設(shè)置為超聲4 s，間歇6 s，總破碎時(shí)間8 min，功率200 W。6 500 r/min離心15 min收集破碎沉淀，80 mL洗滌緩沖液洗滌兩次后，以16 mL含8 mol/L尿素的變性緩沖液4 ℃過(guò)夜溶解，變性溶解液6 500 r/min離心15 min，棄沉淀，上清液等體積分成4 份，分別采取不同的復(fù)性方式進(jìn)行復(fù)性。

1.3.3 融合蛋白包涵體的不同復(fù)性方式

稀釋復(fù)性：取4 mL融合蛋白變性溶解液，每隔2 h加入等體積的復(fù)性緩沖液，倍比稀釋直至尿素終濃度為2 mol/L，將稀釋復(fù)性后得到的16 mL蛋白溶解液過(guò)鎳柱純化，以含2 mol/L尿素的20、50、80 mmol/L咪唑溶液洗雜，含2 mol/L尿素的100 mmol/L咪唑溶液洗脫，將得到的蛋白洗脫液置于透析袋中，于含2 mol/L尿素的PBS中透析12 h，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

透析復(fù)性：取4 mL融合蛋白變性溶解液過(guò)鎳柱純化，以含8 mol/L尿素的20、50、80 mmol/L咪唑溶液洗雜，含8 mol/L尿素的100 mmol/L咪唑溶液洗脫，將得到的蛋白洗脫液置于透析袋中，每隔12 h換一次透析液，直至將蛋白溶解液替換為含2 mol/L尿素的PBS，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

柱上復(fù)性：取4 mL融合蛋白變性溶解液過(guò)鎳柱，以含6、4、2 mol/L尿素的復(fù)性緩沖液依次緩慢沖洗5～10 個(gè)柱體積，最后以含2 mol/L尿素的20、50、80 mmol/L咪唑溶液洗雜，含2 mol/L尿素的100 mmol/L咪唑溶液洗脫，將得到的蛋白洗脫液置于透析袋中，于含2 mol/L尿素的PBS中透析12 h，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

ITC純化：取4 mL融合蛋白變性溶解液，每隔2 h加入等體積的復(fù)性緩沖液，倍比稀釋直至尿素終濃度為2 mol/L，向稀釋復(fù)性后得到的16 mL蛋白溶解液中加入終濃度為2 mol/L的NaCl，37 ℃孵育30 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀以含2 mol/L尿素的PBS重懸，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

復(fù)性后的蛋白得率由下式計(jì)算得出：

1.3.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定重組蛋白結(jié)合活性

棋盤(pán)滴定確定間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的最佳包被抗原抗體濃度。4 ℃過(guò)夜包被最佳濃度的人工抗原AFB1-牛血清蛋白，含吐溫的PBS（PBST）洗板3 次；4%脫脂乳37 ℃封閉2 h，PBST洗板3 次；以終質(zhì)量濃度100 ng/mL為AFB1標(biāo)準(zhǔn)品最大競(jìng)爭(zhēng)濃度，倍比稀釋16 個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)平行，與人工抗原競(jìng)爭(zhēng)孔中加入的不同長(zhǎng)度、不同復(fù)性方式獲得的納米抗體融合蛋白，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3 次；加入HRP標(biāo)記抗His標(biāo)簽的二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3 次；顯色終止后測(cè)定孔中OD450nm，計(jì)算每種蛋白的IC50。

1.3.5 融合蛋白相變溫度測(cè)定

取以稀釋復(fù)性方式純化得到的4 種長(zhǎng)度融合蛋白儲(chǔ)液，將其濃度均一為15 μmol/L，各加入濃度為5 mol/L的氯化鈉200 μL，使氯化鈉的終濃度為1 mol/L，每種蛋白取200 μL于酶標(biāo)孔中，并設(shè)置3 個(gè)平行，在溫度由16 ℃升至52 ℃的過(guò)程中，每升溫2 ℃記錄一次OD350nm，以溫度為橫坐標(biāo)、相對(duì)濁度為縱坐標(biāo)作圖，斜率最大處即為該融合蛋白的相變溫度。

1.3.6 融合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

取以稀釋復(fù)性方式純化得到的4 種融合蛋白儲(chǔ)液，將其質(zhì)量濃度均一為0.3 mg/mL，取800 μL置于圓二色譜儀樣品檢測(cè)瓶中，設(shè)定二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定程序，同時(shí)檢測(cè)空白背景值，將減去空白背景值后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入在線擬合網(wǎng)站Dichroweb進(jìn)行擬合[21]，得到4 種融合蛋白的峰圖與二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算表。

1.4 數(shù)據(jù)處理

重組蛋白靈敏度數(shù)據(jù)使用Origin 2021軟件進(jìn)行處理；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)由在線網(wǎng)站Dichroweb獲得；電泳圖使用Quantity one進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建

表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中重復(fù)序列的延長(zhǎng)是以遞歸定向連接方式實(shí)現(xiàn)。如圖2A所示，分別得到了ELP20、ELP40、ELP60、ELP80序列。以SfiI和NotI分別雙酶切不同長(zhǎng)度的ELP序列，克隆到SfiI和NotI雙酶切過(guò)的pET30a載體上，如圖2B所示，分別得到了不同長(zhǎng)度的重組表達(dá)載體。

圖2 不同長(zhǎng)度ELP片段及表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Verification of ELP of different lengths and expression vectors by double enzyme digestion

2.2 蛋白表達(dá)與復(fù)性結(jié)果

4 種融合蛋白的理論分子質(zhì)量大小分別為26.53、34.87、43.22、51.56 kDa。SDS-PAGE結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的融合蛋白大小與預(yù)期一致（圖3）。4 種融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)破碎上清液中目標(biāo)蛋白含量極少，絕大部分以包涵體形式存在于超聲破碎沉淀中（圖4）。將4 種融合蛋白的包涵體分別用4 種復(fù)性方法進(jìn)行了復(fù)性，SDS-PAGE及Quantity one軟件分析結(jié)果顯示，4 種融合蛋白包涵體變性溶解液中目的蛋白含量均在50%以上（圖5，泳道1），4 種復(fù)性方式所得的融合蛋白純度差異不顯著（圖5，泳道2～5）；結(jié)合上樣濃度與收獲體積計(jì)算蛋白得率，4 種復(fù)性方式中，ITC純化得率最高（表2）。

圖3 融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖與誘導(dǎo)前后SDS-PAGE分析Fig.3 Structural diagrams of and SDS-PAGE patterns of fusion proteins before and aft.er induction

圖4 破碎上清液與破碎沉淀Fig.4 SDS-PAGE patterns of proteins in supernatant and precipitate from disrupted cells

圖5 4 種復(fù)性方式得到4 種不同長(zhǎng)度的蛋白Fig.5 SDS-PAGE patterns of four of proteins of different lengths obtained by four refolding methods

表2 不同復(fù)性方式所得重組蛋白得率Table 2 Yield of recombinant proteins obtained by different refolding methods

2.3 納米抗體靈敏度測(cè)定

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定不同復(fù)性方式得到不同長(zhǎng)度融合蛋白的IC50。圖6結(jié)果顯示，4 種復(fù)性方式中，稀釋復(fù)性的IC50為4 種復(fù)性方式中最低，4 種蛋白IC50分別為6.24、5.99、5.88、4.35 ng/mL，提示稀釋復(fù)性的方法更有利于重組蛋白重新折疊；4 種融合蛋白中，G8-ELP80的IC50最低，表明G8-ELP80靈敏度最高。

圖6 4 種蛋白的靈敏度測(cè)定Fig.6 Sensitivity of four proteins

2.4 融合蛋白相變溫度測(cè)定

當(dāng)溶液中半數(shù)蛋白發(fā)生聚集時(shí)的溫度為該ELP標(biāo)記蛋白的相變溫度，在以溫度為橫坐標(biāo)、相對(duì)濁度為縱坐標(biāo)的圖中表現(xiàn)為斜率變化最劇烈處所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)溫度值。融合蛋白的相變溫度與多種因素有關(guān)，如蛋白濃度、鹽離子種類、鹽離子濃度等[22]。將4 種融合蛋白稀釋至終濃度為15 μmol/L，在NaCl濃度為1 mol/L時(shí)，G8-ELP20、G8-ELP40、G8-ELP60、G8-ELP80的相變溫度分別為45、38、32、28 ℃（圖7），符合ELP重復(fù)數(shù)越多相變溫度越低的相變規(guī)律，與預(yù)估結(jié)果一致。

圖7 融合蛋白相變溫度Fig.7 Phase transition temperatures of fusion proteins

2.5 圓二色譜結(jié)果分析

納米抗體的結(jié)構(gòu)是由9 個(gè)反向平行的β-折疊片層（A-B-C-D-E-F-G-H-I）組成，它們之間通過(guò)二硫鍵和鏈間氫鍵連接在一起[23]；ELP中含有大量重復(fù)序列VPGXG，當(dāng)環(huán)境溫度低于相變溫度時(shí)，重復(fù)序列中的Pro-Gly是β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[24]。結(jié)果顯示，4 種長(zhǎng)度融合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋所占比例極低，β-結(jié)構(gòu)是融合蛋白主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，與理論預(yù)估結(jié)果一致（表3）；隨著重復(fù)序列數(shù)的升高，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角比例均有所升高，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)比例則有所降低，且序列數(shù)越多此規(guī)律越不顯著；值得注意的是，G8-ELP80中α-螺旋的比例較G8-ELP20相對(duì)升高了75%，提示一定范圍內(nèi)α-螺旋結(jié)構(gòu)的升高可能與納米抗體的靈敏度相關(guān)。

表3 不同長(zhǎng)度融合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 3 Secondary structure contents of fusion proteins of different lengths%

3 討 論

當(dāng)重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中高度表達(dá)時(shí)，會(huì)形成高密度、不溶性的蛋白聚集體，由于錯(cuò)誤折疊而不具備生物活性。包涵體中，重組蛋白的含量約為50%，其他成分為雜蛋白、脂多糖、質(zhì)粒DNA等[25]。當(dāng)重組蛋白在細(xì)胞中以包涵體形式表達(dá)時(shí)，雖然純化步驟較可溶性表達(dá)繁瑣，但也存在一定優(yōu)點(diǎn)，大腸桿菌內(nèi)部的蛋白酶未必能降解結(jié)構(gòu)致密的包涵體，可實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高表達(dá)，獲得質(zhì)量可觀的重組蛋白[26]；包涵體中的重組蛋白純度較高，便于純化分離；對(duì)于一些在天然構(gòu)象下對(duì)細(xì)胞存在毒害作用的蛋白質(zhì)，包涵體表達(dá)是一種可行的方法[27]。包涵體變性溶解后的復(fù)性方法主要有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性、柱上復(fù)性等。

以ELP作為純化標(biāo)簽為目的蛋白的純化提供了一種非色譜分離的方法。相較于傳統(tǒng)的離子交換層析、疏水層析、親和層析，ELP標(biāo)簽賦予融合蛋白相變特征，通過(guò)簡(jiǎn)單的ITC即可實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分離純化，具有經(jīng)濟(jì)、操作方便、損耗低等優(yōu)點(diǎn)[28]。以往研究表明，在大腸桿菌中外源蛋白與ELP標(biāo)簽融合蛋白表達(dá)時(shí)多數(shù)為可溶性表達(dá)，利用ELP標(biāo)簽的ITC，已成功純化出綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、硫氧還蛋白、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶等[29]重組蛋白，但由于ELP標(biāo)簽相變性質(zhì)受濃度影響較大，當(dāng)融合蛋白的表達(dá)濃度低于1 μmol/L時(shí)，目的蛋白的分離純化效率極低[30]。

本研究中，18 ℃低溫過(guò)夜誘導(dǎo)后可溶性表達(dá)量依然較低，無(wú)法使用ITC進(jìn)行純化，使用鎳柱雖然可以純化到有活性的目的蛋白，但是濃度卻極低，不能滿足后續(xù)捕獲AFB1后整體相變的要求。將存在于菌體沉淀中的重組蛋白包涵體變性溶解后，嘗試了不同的復(fù)性方式對(duì)其進(jìn)行復(fù)性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，透析或超濾將尿素濃度降至2 mol/L以下時(shí)，出現(xiàn)蛋白溶液渾濁的現(xiàn)象，提示蛋白發(fā)生聚集，在PBS（pH 7.0）中不能穩(wěn)定存在。已有研究報(bào)道，納米抗體在嚴(yán)酷的條件下具有很強(qiáng)的耐受性，并能抵抗化學(xué)和熱變性[31]，故而將其溶解在含2 mol/L尿素的PBS中測(cè)定其蛋白特性并計(jì)算復(fù)性比例。4 種復(fù)性方式中，稀釋復(fù)性得到的重組蛋白靈敏度最高；4 種重組蛋白中，G8-ELP80的靈敏度最高，IC50僅為4.35 ng/mL；相變溫度最低，在體系中氯化鈉濃度為1 mol/L、重組蛋白濃度為15 μmol/L時(shí)其相變溫度僅為28 ℃，表明在37 ℃條件下即可以先后進(jìn)行AFB1的捕獲和聚集，避免了因溫度變化而導(dǎo)致回收率降低。

4 結(jié) 論

本研究成功獲得了4 種具有溫度刺激響應(yīng)性和抗原識(shí)別特異性的納米抗體，并對(duì)4 種納米抗體的結(jié)合活性、復(fù)性方法、相變溫度、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)等性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為易形成包涵體的融合蛋白復(fù)性時(shí)變性處理劑的去除程度提供新思路。后續(xù)將以此為基礎(chǔ)，建立以納米抗體為核心的全生物合成純化介質(zhì)，用于AFB1樣品前處理，研究結(jié)果可為納米抗體的進(jìn)一步功能化鞏固基礎(chǔ)。同時(shí)，已有借助ELP標(biāo)簽的單克隆抗體相分離免疫檢測(cè)[32-33]，ELP標(biāo)簽功能化的納米抗體或可依靠其在均相檢測(cè)體系中的優(yōu)勢(shì)在快速檢測(cè)領(lǐng)域取得突破，如改進(jìn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移、開(kāi)發(fā)生物傳感器等。