劉思露，陳珊珊，邵良婷，邵雪飛，徐幸蓮，王虎虎*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

發(fā)酵肉制品是通過微生物發(fā)酵加工而成的具有獨(dú)特風(fēng)味、色澤和質(zhì)地的肉類產(chǎn)品[1]，其風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者喜愛[2]，新產(chǎn)品的開發(fā)得到了越來越多的關(guān)注。發(fā)酵肉制品的方式分為自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵[3]，人工接種發(fā)酵是指選擇特定的菌株和溫度在可控制條件下進(jìn)行肉制品發(fā)酵；人工接種發(fā)酵使得發(fā)酵過程更加可控，發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量也得到提升[4]。我國(guó)對(duì)人工接種發(fā)酵的研究起步較晚，目前關(guān)于發(fā)酵肉制品和發(fā)酵劑的研究還遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家[5]。發(fā)酵劑是指在發(fā)酵過程中促進(jìn)發(fā)酵的微生物制劑[6]，理想的發(fā)酵劑不僅安全有益，且能改善風(fēng)味。在肉制品發(fā)酵過程中，葡萄球菌常作為發(fā)酵劑。

葡萄球菌屬（Staphylococcusspp.）是一類具有球形或略微橢圓的革蘭氏陽性球菌，大多數(shù)為非致病菌，少數(shù)為致病菌。發(fā)酵劑對(duì)肉制品的風(fēng)味有很大的影響，經(jīng)研究表明，在發(fā)酵肉類產(chǎn)品中，產(chǎn)生香味的菌株主要是葡萄球菌[7]。有益葡萄球菌常因耐酸、蛋白酶活性高等可改變?nèi)庵破凤L(fēng)味、色澤，被用于肉制品發(fā)酵劑，其在肉制品中的作用主要有降解硝酸鹽和亞硝酸鹽，既不造成亞硝酸鹽含量超標(biāo)，也可以促進(jìn)肉制品發(fā)色，保持良好色澤[8]；能夠分解脂肪和肉蛋白，將大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)及風(fēng)味化合物，改善風(fēng)味，進(jìn)而提高產(chǎn)品品質(zhì)[9]。葡萄球菌作為常見的發(fā)酵劑，其安全特性始終是研究的重點(diǎn)，但是隨著人們健康意識(shí)的提高，一些新型功能的發(fā)酵特性也逐漸得到關(guān)注，例如降解膽固醇、生物胺等，這對(duì)發(fā)酵劑的篩選提出了更高的要求，因此需要發(fā)掘具備更多功能特性的葡萄球菌發(fā)酵菌株。

本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中篩選得到的33 株葡萄球菌為研究對(duì)象，通過觸酶和硫化氫等基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)確定出11 株菌進(jìn)入安全性能的篩選；通過溶血、血漿凝固酶和耐熱核酸酶等安全性指標(biāo)進(jìn)一步確定上述11 株菌均符合要求；通過產(chǎn)脂肪酶、降解膽固醇、耐酸、產(chǎn)蛋白酶、降解肌原纖維蛋白、降解亞硝酸鹽、降解生物胺等功能性指標(biāo)篩選出安全性高、功能性全的發(fā)酵菌株，以期為篩選肉制品發(fā)酵劑提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用33 株菌株全部由作者課題組分離自發(fā)酵肉制品，均保藏在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心。經(jīng)過16S DNA測(cè)序和生化鑒定，33 株葡萄球菌中有6 株沃氏葡萄球菌、5 株腐生葡萄球菌、5 株木糖葡萄球菌、4 株小牛葡萄球菌、4 株馬胃葡萄球菌、4 株琥珀葡萄球菌、2 株緩慢葡萄球菌、1 株科氏葡萄球菌、1 株表皮葡萄球菌、1 株巴氏葡萄球菌。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy agar broth，TSB）、腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）、醋酸鉛培養(yǎng)基、甲苯胺藍(lán)-DNA酶瓊脂、酪蛋白瓊脂、無菌凍干兔血漿 青島海博生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維羊血北京索萊寶科技有限公司。

溴甲酚紫、生物胺標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；組氨酸 賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司；精氨酸、賴氨酸、膽固醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；亞硝酸鈉、中性紅、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺 上海麥克林生化科技有限公司；4%～20%預(yù)制膠、4×loading buffer上樣緩沖液、蛋白Marker 南京金斯瑞生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BIO II Adcance4 Sterile GARD生物安全柜 西班牙Telstar公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FP-1100-C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；SQL1010C立式壓力蒸汽滅菌器 日本Yamato公司；pH計(jì) 德國(guó)Testo公司；M2e酶標(biāo)儀 美國(guó)MD公司；PD500勻漿機(jī) 英國(guó)Primasci公司；Acquity超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；FR-980A凝膠成像儀 上海復(fù)日科技有限公司；165-8000電泳儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將33 株在-80 ℃冷凍保存的葡萄球菌進(jìn)行解凍，在TSA平板上劃線，（36±1）℃培養(yǎng)24 h后，將TSA上的單菌落挑入TSB肉湯中，于（36±1）℃條件下培養(yǎng)24 h，完成第1次液體擴(kuò)培；取200 μL第1次擴(kuò)培完成的菌液移入至新的TSB液體培養(yǎng)基中，于（36±1）℃條件下培養(yǎng)24 h，完成第2次活化；活化后的菌液放在4 ℃保存，每次使用前進(jìn)行一次液體擴(kuò)培。

1.3.2 基礎(chǔ)生化指標(biāo)測(cè)定

生理生化實(shí)驗(yàn)包括觸酶實(shí)驗(yàn)和硫化氫實(shí)驗(yàn)，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選葡萄球菌。

1.3.3 安全性指標(biāo)測(cè)定

溶血：按照5%無菌脫纖維羊血的比例制作血瓊脂平板，將活化后的菌株劃線接種至血平板，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生溶血圈。血漿凝固酶：用BHI肉湯在（36±1）℃培養(yǎng)菌株24 h，按照試劑標(biāo)簽指示，將0.8 mL上述培養(yǎng)物加到每個(gè)含有0.5 mL凍干兔血漿的西林瓶中，緩慢搖晃至完全溶解，置（36±1）℃培養(yǎng)，每0.5 h觀察一次，觀察是否有凝塊出現(xiàn)或凝固體積超過原體積的一半。耐熱核酸酶實(shí)驗(yàn)：向甲苯胺藍(lán)-DNA酶培養(yǎng)基每個(gè)孔中加入20 μL沸水浴處理15 min后的肉湯培養(yǎng)物，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有粉紅色暈圈產(chǎn)生。

1.3.4 功能性指標(biāo)

1.3.4.1 產(chǎn)脂肪酶

脂肪酶篩選培養(yǎng)基參考劉元利[10]的方法并稍作修改：配制3%的聚乙烯醇溶液，加熱融化；聚乙烯醇與橄欖油按照3∶1的比例混合，使用勻漿機(jī)勻漿。TSA與上述乳化液按照9∶1的比例混合，加入1%的中性紅指示劑，121 ℃滅菌15 min，倒入無菌平皿，備用。將活化后的菌液劃線接種到篩選培養(yǎng)基中，（36±1）℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍是否有紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)。

1.3.4.2 降解膽固醇

參考GB 5009.128—2016《食品中膽固醇的測(cè)定》[11]，采用硫酸鐵銨顯色法測(cè)定膽固醇含量。根據(jù)膽固醇質(zhì)量濃度（mg/mL）和OD560nm的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取200 μL活化后的菌液接種至膽固醇質(zhì)量濃度為100 mg/L的膽固醇-TSB培養(yǎng)基中，（36±1）℃恒溫培養(yǎng)48 h后測(cè)定培養(yǎng)基中膽固醇含量，進(jìn)而判斷膽固醇降解能力。

菌液中膽固醇提取參考李穎[12]的方法并稍作修改：取0.2 mL培養(yǎng)物于離心管中，用無水乙醇定容至5 mL，5 000 r/min離心5 min；取上清液2 mL，加入2 mL硫酸鐵銨工作液。取2 mL無水乙醇作為空白對(duì)照，室溫下放置0.5 h后在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣品的吸光度。將無菌的膽固醇-TSB培養(yǎng)基作為對(duì)照。降解率按式（1）計(jì)算：

式中：n0為培養(yǎng)基膽固醇含量；n1為菌液培養(yǎng)基中膽固醇含量。

1.3.4.3 耐酸性

用1 mol/L鹽酸將TSB肉湯培養(yǎng)基pH值調(diào)整至7.0、6.5、6.0、5.5、5.0，將活化后的菌株接種至各pH值下的培養(yǎng)基，以相應(yīng)pH值的TSB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每24 h用分光光度計(jì)記錄在600 nm波長(zhǎng)處菌液的OD值，連續(xù)測(cè)定5 d。

1.3.4.4 酪蛋白分解

取活化后的菌液10 μL滴加到酪蛋白培養(yǎng)基平板上，（36±1）℃培養(yǎng)48 h，觀察是否出現(xiàn)分解圈。

1.3.4.5 肌原纖維蛋白分解

肌原纖維蛋白的提取參考李麗湲[13]的方法。采用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、OD560nm為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品蛋白根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合公式求出質(zhì)量濃度。

通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）探究葡萄球菌胞外蛋白酶是否能夠降解肌原纖維蛋白。參考王光宇[14]的方法并稍作改變，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期的菌懸液以10 000×g離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌作為細(xì)菌的胞外粗酶液。取200 μL粗酶液分別與1 mL 1 mg/mL肌原纖維蛋白溶液混合作為實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照添加200 μL TSB肉湯與1 mL肌原纖維蛋白溶液混合，于30 ℃條件下孵育20 h。取100 μL孵育后的溶液，加入33 μL 4×loading buffer上樣緩沖液，95 ℃加熱變性5 min。上樣于4%～20%預(yù)制膠中。電泳參數(shù)為80 V 30 min和110 V 2 h。結(jié)束電泳后用考馬斯亮藍(lán)G-250快染液染色4 h，染色后的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中拍攝圖像，得到電泳條帶結(jié)果。

1.3.4.6 降解亞硝酸鹽

將菌液按照4%的接種量接種到NaNO2質(zhì)量濃度為150 mg/L的NaNO2-TSB液體培養(yǎng)基中，（36±1）℃培養(yǎng)48 h。參考GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》[15]，采用第二法鹽酸萘乙二胺法測(cè)定亞硝酸鈉的含量。培養(yǎng)基中亞硝酸鈉的提取參考Liao E等[16]的方法。根據(jù)發(fā)酵前后亞硝酸鹽的含量，比較不同菌株降解亞硝酸鹽的能力，亞硝酸鹽降解率計(jì)算公式如下：

式中：m0為培養(yǎng)基亞硝酸鈉含量；m1為菌液培養(yǎng)基中亞硝酸鈉含量。

1.3.4.7 降解生物胺

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品尸胺二鹽酸鹽、腐胺二鹽酸鹽和組胺二鹽酸鹽，用0.4 mol/L高氯酸定容至100 mL，制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。采用高效液相色譜法，根據(jù)峰面積和濃度的關(guān)系進(jìn)行擬合作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制pH 7.2的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），加入精氨酸、組氨酸及賴氨酸，使氨基酸質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg/L。按照4%的接種量接種到氨基酸緩沖液中，（36±1）℃培養(yǎng)48 h，將無菌的空白氨基酸PBS做相同處理作為對(duì)照組，測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的生物胺含量。降解生物胺的菌株篩選參考Xu Ying等[17]的方法，生物胺降解率計(jì)算公式如下：

式中：p0為無菌培養(yǎng)基中生物胺含量；p1為菌液培養(yǎng)基中生物胺含量。

柱前衍生參考盧士玲等[18]的方法并稍作修改，每200 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品混合液中，按順序依次加入40 μL的NaOH溶液（2 mol/L）、60 μL飽和的NaHCO3溶液和400 μL的丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，溶于丙酮），40 ℃避光反應(yīng)45 min后，加入20 μL氨水，避光保存30 min中止反應(yīng)；加入乙腈280 μL使終體積為1 mL；然后用注射器和0.22 μm濾膜過濾，放至進(jìn)樣瓶待測(cè)。培養(yǎng)基菌液以10 000×g離心5 min后取上清液，與標(biāo)準(zhǔn)品執(zhí)行上述同樣操作進(jìn)行柱前衍生。色譜條件：流速1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為室溫，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；梯度洗脫：溶劑A（超純水）和溶劑B（乙腈）作為流動(dòng)相，標(biāo)準(zhǔn)梯度洗脫程序見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)梯度洗脫程序Table 1 Standard gradient elution program

1.3.5 生長(zhǎng)曲線

將上述篩選出的菌株活化后稀釋1 000 倍，使用生長(zhǎng)曲線自動(dòng)分析儀在37 ℃、600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線，每0.5 h測(cè)定一次，持續(xù)測(cè)定48 h。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)，采用Microsoft Office 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步數(shù)據(jù)整理，采用Origin2019b軟件（OriginLab）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和作圖。采用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差數(shù)測(cè)驗(yàn)法檢驗(yàn)不同處理組之間的顯著性水平（P＜0.05）。數(shù)據(jù)均采用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)生化指標(biāo)

33 株葡萄球菌均為觸酶實(shí)驗(yàn)陽性，均含有過氧化氫酶。33 株葡萄球菌中有11 株硫化氫陰性，作為后續(xù)篩選的待測(cè)菌株。

2.2 安全性指標(biāo)

細(xì)菌的致病性多數(shù)與溶血性相關(guān)，多數(shù)致病菌都能產(chǎn)生血漿凝固酶，讓人體中的纖維蛋白變?yōu)楣虘B(tài)纖維蛋白，使含有抗凝劑的兔血漿發(fā)生凝固[3]。產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的典型特征之一是耐熱核酸酶陽性，在沸水中水浴15 min后耐熱核酸酶仍可保持活性，水解DNA長(zhǎng)鏈，使甲苯胺藍(lán)由藍(lán)色變成粉紅色。本研究中，11 株菌在血平板上生長(zhǎng)正常，產(chǎn)生單菌落，均未產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，為溶血實(shí)驗(yàn)陰性。11 株菌均未產(chǎn)生凝固現(xiàn)象，瓶體內(nèi)也未有凝塊產(chǎn)生，均為血漿凝固酶陰性。在甲苯胺藍(lán)-DNA酶培養(yǎng)基上均未產(chǎn)生粉紅色暈圈，為耐熱核酸酶實(shí)驗(yàn)陰性。

2.3 功能性指標(biāo)

2.3.1 產(chǎn)脂肪酶

脂肪酶能夠分解脂肪，提高脂肪酸的含量，對(duì)產(chǎn)品的香味和風(fēng)味起著重要作用[19]，同時(shí)，脂肪酶水解脂肪產(chǎn)生對(duì)人體有益的亞油酸等必需脂肪酸，賦予了新型保健功能[20]。如圖1所示，有8 株菌可產(chǎn)生脂肪酶，能夠分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸，使中性紅變色，在培養(yǎng)基中顯示紅色斑點(diǎn)。這與陳亞杰[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，通過培養(yǎng)基顏色變化篩選出21 株產(chǎn)脂肪酶的葡萄球菌發(fā)酵劑。

圖1 脂肪酶實(shí)驗(yàn)Fig.1 Results of lipase test

2.3.2 降解膽固醇

低密度脂蛋白中的膽固醇含量較高，因此在血管內(nèi)易沉積造成堵塞，是造成心血管疾病的主要原因[22]。目前普遍采用藥物降低膽固醇，但會(huì)對(duì)人體器官造成一定的副作用?；诖耸朝煹姆椒ㄖ饾u受到關(guān)注，能降解膽固醇的益生菌也被發(fā)掘，已經(jīng)有研究表明益生菌可以降解膽固醇[23-24]。

膽固醇質(zhì)量濃度與吸光度的擬合公式為Y=0.004 78X-0.010 23（X為膽固醇質(zhì)量濃度（μg/mL），Y為560 nm波長(zhǎng)處吸光度，R2=0.998 13），標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度R2＞0.99，擬合度較高，擬合程度較好。由圖2可知，8 株菌均具有降解膽固醇的能力，其中沃氏葡萄球菌5F’-2降解率最高50.05%；琥珀葡萄球菌9P-3降解率相比于其他菌較低，為41.77%；兩株之間存在顯著差異（P＜0.05）。Ren Dayong等[25]分離出1 株膽固醇降解率為38.0%的嗜酸乳桿菌；黃燕燕等[26]從開菲爾粒和陳年泡菜水中篩選出1 株膽固醇去除率37.58%的植物乳桿菌；瑪麗娜·庫爾曼等[27]篩選出降解率分別為37.06%和47.41%的兩株葡萄球菌。相比之下，本實(shí)驗(yàn)中8 株菌降解膽固醇能力較高，基本穩(wěn)定在40%～50%之間，因此選擇此8 株菌繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 8 株葡萄球菌對(duì)膽固醇的降解作用Fig.2 Percentage degradation of cholesterol by eight strains of Staphylococcus

2.3.3 耐酸

葡萄球菌常常與乳酸菌作為復(fù)配發(fā)酵劑用于肉制品發(fā)酵中，乳酸菌產(chǎn)酸性能較強(qiáng)，因此葡萄球菌需具有一定的耐酸能力[28]。由圖3可得，實(shí)驗(yàn)中8 株葡萄球菌更適合在偏中性環(huán)境生長(zhǎng)，酸性條件會(huì)在一定程度上影響菌株的生長(zhǎng)能力，相同時(shí)間內(nèi)隨著pH值的下降，菌液濃度逐漸下降，菌株進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的時(shí)間逐漸延后。

圖3 8 株葡萄球菌的耐酸性Fig.3 Acid tolerance of eight strains of Staphylococcus

待測(cè)8 株菌相對(duì)比，5F-2耐酸性能相對(duì)最強(qiáng)，A31、8A-1、5F’-2隨后，5D-1、C15、9N-1、9P-3耐酸性能較差。隨著pH值下降，5F-2雖生長(zhǎng)速度減緩，對(duì)數(shù)期推遲，但是生長(zhǎng)趨勢(shì)一直居首。A31、8A-1、5F’-2在pH 6.0時(shí)也表現(xiàn)出相對(duì)較強(qiáng)的耐酸性能，雖然相較于5F-2的耐酸性能不足，但是在酸性環(huán)境中可以生長(zhǎng)。5D-1、C15、9N-1、9P-3對(duì)酸性環(huán)境較為敏感，在pH 6.5時(shí)即表現(xiàn)出相比于其他4 株菌較弱的生長(zhǎng)狀態(tài)，在pH 5.0時(shí)，連續(xù)5 d OD600nm＜0.1，基本處于不生長(zhǎng)的狀態(tài)。因此選擇5F-2、A31、8A-1、5F’-2耐酸性能較好的4 株菌進(jìn)入后續(xù)的篩選。

2.3.4 分解酪蛋白

蛋白酶分解蛋白質(zhì)可形成游離氨基酸，對(duì)肉制品的風(fēng)味具有良好影響。董杰等[29]采用酪蛋白水解法作為產(chǎn)蛋白酶葡萄球菌的初步篩選。本研究4 株葡萄球菌在酪蛋白培養(yǎng)基上均形成了透明水解圈（圖4），說明4 株菌均可產(chǎn)生蛋白酶分解酪蛋白，因此進(jìn)入下一步胞外蛋白酶活性的篩選，以探究葡萄球菌作為發(fā)酵劑能否降解肌肉蛋白。

圖4 4 株葡萄球菌對(duì)酪蛋白的分解作用Fig.4 Decomposition of casein by four strains of Staphylococcus

2.3.5 分解肌原纖維蛋白

在肉制品發(fā)酵過程中，肌肉內(nèi)源酶和微生物蛋白酶共同作用降解肌肉蛋白[30]。肌原纖維蛋白是肌肉蛋白中的主要組成成分之一，主要決定了發(fā)酵肉制品的質(zhì)地、風(fēng)味與持水性等[31]。肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白和肌動(dòng)球蛋白構(gòu)成，肌球蛋白構(gòu)成粗絲，肌動(dòng)蛋白構(gòu)成細(xì)絲，粗絲和細(xì)絲配合產(chǎn)生肌肉收縮。不同蛋白因分子質(zhì)量不同在SDS-PAGE圖中顯示出來，葡萄球菌胞外蛋白酶對(duì)雞肉肌原纖維蛋白降解作用結(jié)果如圖5所示。處理組中270、45 kDa和37 kDa左右的3 個(gè)條帶發(fā)生了不同程度的降解。270 kDa左右的條帶可能是肌球蛋白重鏈，45 kDa左右的條帶可能是肌動(dòng)蛋白，37 kDa左右的條帶可能是肌鈣蛋白[14,30,32-33]。相比于空白對(duì)照組，4 株菌的胞外蛋白酶在上述條帶中均發(fā)生了降解，條帶顏色變淺，說明對(duì)肌原纖維蛋白均產(chǎn)生了一定的降解作用，因此4 株菌進(jìn)入下一步功能篩選。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)上述篩選所得的4 株葡萄球菌進(jìn)行了胞外蛋白酶降解雞肉肌原纖維蛋白能力的研究，值得注意的是蛋白質(zhì)的降解效果受多種因素影響，溫度、孵育時(shí)間均會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解效果的差異。另外不同種的葡萄球菌特性不一，不同來源的肌原纖維蛋白也可能會(huì)產(chǎn)生影響；例如田媛等[3]從發(fā)酵肉制品中篩選出了8 株葡萄球菌，在25 ℃孵育20 h，其胞外蛋白酶對(duì)豬肉肌原纖維蛋白無顯著降解。

2.3.6 降解亞硝酸鈉

亞硝酸鹽既可以抑制毒素的生成，也可以產(chǎn)生穩(wěn)定的紅色澤，因此常被用于肉制品中[34-35]。但因其潛在的致癌性，屬于2A類致癌物，所以在食品中亞硝酸鹽的含量需要嚴(yán)格控制。因此發(fā)酵劑被期待具有一定的降解亞硝酸鹽的能力，既能控制亞硝酸鹽的含量，又能維持肉制品的色澤。

亞硝酸鈉質(zhì)量濃度與吸光度的擬合公式為Y=0.006 57X＋0.021 31（X為亞硝酸鈉質(zhì)量濃度（μg/mL），Y為538 nm波長(zhǎng)處吸光度，R2=0.999 1），標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度R2＞0.999，擬合度高，擬合程度好。由圖6可知，前述指標(biāo)中篩選出的4 株菌均具有降解亞硝酸鹽的能力，其中沃氏葡萄球菌5F’-2降解率最高，為35.76%；琥珀葡萄球菌A31降解率相比于其他菌最低，僅為3.50%；4 株菌降解亞硝酸鹽的能力相互之間存在顯著差異，但是亞硝酸鹽降解率可能會(huì)影響到肉制品色澤，因此不能單純的將降解率的高低作為唯一篩選標(biāo)準(zhǔn)，所以具有降解亞硝酸鹽的4 株菌均保留到下一步篩選中。

圖6 4 株葡萄球菌對(duì)亞硝酸鹽的降解作用Fig.6 Degradation efficiency of nitrite by four strains of Staphylococcus

2.3.7 降解生物胺

生物胺是一類具有潛在毒性的生物活性物質(zhì)，發(fā)酵食品中生物胺主要是微生物的氨基酸脫羧酶分解氨基酸生成[36]，過多攝入生物胺會(huì)引起不良反應(yīng)甚至危及生命[37]，因此在發(fā)酵過程中需控制生物胺的含量。本實(shí)驗(yàn)以腐胺、尸胺和組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化圖譜為參考，確定腐胺、尸胺和組胺的出峰位置，腐胺、尸胺和組胺分別于9.67、10.53、11.13 min分離出峰。20 min內(nèi)所有生物胺衍生物都被洗脫出來。在營(yíng)養(yǎng)匱乏的情況下，具有氨基酸脫羧酶活性的細(xì)菌可能會(huì)將氨基酸脫羧形成對(duì)應(yīng)的生物胺改善生長(zhǎng)環(huán)境，維持自身的正常生長(zhǎng)[38]。因此在PBS中只加入對(duì)應(yīng)的氨基酸檢驗(yàn)。結(jié)果可知，4 株菌均不產(chǎn)生物胺。

3 種生物胺（腐胺、尸胺、組胺）的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式分別為：Y腐胺=37 036.783 36X-1 119.370 49（X為腐胺質(zhì)量濃度（μ g/m L），Y為峰面積，R2=0.999 9）、Y尸胺=27 296.707 54X＋433.799 84（X為尸胺質(zhì)量濃度（μg/mL），Y為峰面積，R2=0.999 9）、Y組胺=20 047.998 12X-3 894.753 53（X為組胺質(zhì)量濃度（m g/m L），Y為峰面積，R2=0.9 9 9 9），R2≥0.999 9，擬合程度高，說明該方法成熟可靠，能夠定量分析這3 種生物胺。由圖7可知，4 株葡萄球菌中均能夠選擇性降解生物胺，均能降解腐胺和組胺，4 株菌在降解腐胺能力上沒有顯著差異（P＞0.05），其中5F-2和5F’-2降解組胺能力較強(qiáng)，降解率達(dá)64%以上，且與另外兩株菌形成了顯著差異（P＜0.05），但是二者卻很少降解尸胺，5F’-2的尸胺降解率幾乎為0。A31和8A-1雖然對(duì)3 種生物胺降解率沒有明顯優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)3 種生物胺均能均衡降解，在后續(xù)使用中需要根據(jù)具體的使用情景確定具體使用菌株，或與其他菌株復(fù)配使用。

圖7 4 株葡萄球菌對(duì)生物胺的降解作用Fig.7 Degradation efficiency of biogenic amines by four strains of Staphylococcus

2.4 生長(zhǎng)曲線

自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定的37 ℃條件下菌株生長(zhǎng)曲線如圖8所示。可以看出包括了細(xì)菌生長(zhǎng)周期中的遲緩期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，因測(cè)定細(xì)菌密度觀察不到衰亡期，即測(cè)定的48 h內(nèi)可能包括衰亡期，但衰亡期菌體出現(xiàn)死亡、活菌數(shù)量降低、活性減弱，對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究意義不大。4 株葡萄球菌在37 ℃條件下長(zhǎng)勢(shì)良好，在4 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在10～20 h間即進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖8 4 株葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線（n=10）Fig.8 Growth curves of four strains of Staphylococcus (n = 10)

3 結(jié) 論

首先通過常規(guī)基礎(chǔ)生化指標(biāo)和安全性指標(biāo)對(duì)33 株葡萄球菌進(jìn)行篩選，共有11 株菌進(jìn)入功能性篩選，確保了發(fā)酵菌株的安全；進(jìn)而通過降解脂肪、降解蛋白等傳統(tǒng)功能指標(biāo)和降解膽固醇、生物胺、亞硝酸鹽等新型功能性指標(biāo)結(jié)合進(jìn)行發(fā)酵特性分析和研究。最終選出沃氏葡萄球菌5F’-2、小牛葡萄球菌8A-1、沃氏葡萄球菌5F-2、琥珀葡萄球菌A31這4 株葡萄球菌，均滿足觸酶實(shí)驗(yàn)陽性、不產(chǎn)硫化氫、不發(fā)生溶血現(xiàn)象、血漿凝固酶陰性、耐熱核酸酶陰性。上述菌株均可產(chǎn)生脂肪酶分解脂肪；均可降解膽固醇，且降解率較高，穩(wěn)定在40%～50%之間；能耐酸，在pH 5.0的環(huán)境下可生長(zhǎng)；均產(chǎn)生蛋白酶，可降解肌原纖維蛋白；均可降解亞硝酸鈉，降解率排序?yàn)?F’-2＞8A-1＞5F-2＞A31；均能夠選擇性降解生物胺，均能降解腐胺和組胺。生長(zhǎng)性能良好，可作為肉制品發(fā)酵菌株以便后續(xù)研究。