王小玲 何禮想 王研 呂國(guó)慶 吳隼,

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1.血液科;2.病理科,河南 衛(wèi)輝 453100)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是最常見的侵襲性大B淋巴細(xì)胞淋巴瘤類型,發(fā)病年齡峰值為60～70歲,占非霍奇金淋巴瘤的25%～30%。該病可發(fā)生在有淋巴組織存在的任何部位,異質(zhì)性較強(qiáng),臨床、病理學(xué)特征不同,對(duì)免疫化療的反應(yīng)亦不相同。其病情進(jìn)展較為迅速,若不及時(shí)治療,中位生存時(shí)間一般不超過(guò)12個(gè)月[1-2]。

淋巴造血系統(tǒng)病變,無(wú)疑也是病理診斷中的一個(gè)難點(diǎn)。一方面是因?yàn)椴》N繁多,另一方面也是因?yàn)椴煌》N間的形態(tài)學(xué)、免疫表型存在顯著重疊。也正是因?yàn)檫@一點(diǎn),近年來(lái)CD30逐漸成為體液免疫及細(xì)胞免疫中一個(gè)頗有潛力的靶點(diǎn)[3-4]。因此,本研究就CD30及c-Myc、P53蛋白在DLBCL中的表達(dá)情況及臨床病理學(xué)特征進(jìn)行分析,評(píng)估其預(yù)后價(jià)值,并確定其可能的相關(guān)因素。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019年3月—2023年1月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科收治并確診的160例DLBCL患者的臨床信息,收集納入患者資料:性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、B組癥狀、初診時(shí)乳酸脫氫酶(LDH)水平、結(jié)外累及、霍奇金淋巴瘤(Staging of Hodgkin′s lymphoma,Ann Arbor)分期、國(guó)際預(yù)后指數(shù)(International prognostic index,IPI)評(píng)分、東部腫瘤協(xié)作組體能狀態(tài)(Eastern Cooperative Oncology Group performance status,ECOG PS)評(píng)分、Hans分型、骨髓浸潤(rùn)、治療方案;病理學(xué)資料:CD30、c-Myc、P53、Ki-67、CD5及BCL-2等。160例患者按照Hans免疫分型進(jìn)行分組,生發(fā)中心B細(xì)胞樣亞型(Germinal center B cell,GCB)分型(GCB組)17例,非生發(fā)中心B細(xì)胞樣亞型(non-Germinal center B cell,non GCB)分型(non-GCB組)143例。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合WHO(2016)關(guān)于淋巴組織腫瘤修訂版相關(guān)分類標(biāo)準(zhǔn),淋巴結(jié)活檢確診為DLBCL的成年患者。②確診后生存期>6個(gè)月。③檢查完善且資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn):排除了原發(fā)性免疫缺陷、HIV感染、淋巴惡性腫瘤史、實(shí)體器官移植、同種異體干細(xì)胞移植或免疫抑制藥物導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)損害患者。該研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 利用免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)中抗原能夠與抗體特異性結(jié)合的原理,通過(guò)一些化學(xué)反應(yīng)使被熒光素酶、金屬離子、同位素等顯色劑標(biāo)記的抗體顯色,并對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量研究,間接確定組織細(xì)胞內(nèi)CD30、c-Myc、P53、CD5等的表達(dá)情況。步驟:取4～5 μm厚的連續(xù)石蠟切片,放在67 ℃烘箱中烤片2 h,二甲苯脫蠟和常規(guī)梯度酒精水化,用pH=6.0的檸檬酸鹽緩沖液微波加熱至沸騰修復(fù)抗原。PBS緩沖液沖洗,然后3%過(guò)氧化氫沖洗阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。向每張切片滴加稀釋后的一抗,恒溫箱中4 ℃過(guò)夜,PBS緩沖液沖洗,滴加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(即二抗),37 ℃恒溫箱中孵育15 min,PBS沖洗,二氨基聯(lián)苯胺試劑染色、蘇木素復(fù)染,PBS緩沖液沖洗,藍(lán)化,梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,最后用中性樹膠封片。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是原位雜交的方法之一,可以用于定位固定組織和細(xì)胞中特定核酸靶標(biāo)的強(qiáng)大技術(shù),能夠獲得與基因表達(dá)和遺傳位點(diǎn)相關(guān)的時(shí)間和空間信息。本研究收集的病例中有23例患者使用了FISH檢測(cè)技術(shù),使用的c-Myc、BCL-2基因探針為雙色斷裂探針,-20 ℃保存?zhèn)溆?。步驟:首先將探針85 ℃溫浴5 min,立即0 ℃放置5～10 min,使雙鏈DNA探針變性。將制作好的染色體玻片標(biāo)本50 ℃培養(yǎng)箱烤片2～3 h,再將其置于70～75 ℃ 70%甲酰胺/2×SSC的變性液中2～3 min,使其變性,70%、90%、100%乙醇梯度脫水,各5 min,然后空氣干燥。加10 μL已變性的DNA探針在玻片標(biāo)本上雜交區(qū)域,蓋蓋玻片,橡膠封片,放在37 ℃濕盒中雜交過(guò)夜,洗脫,暗處晾干。取10 μL雜交藍(lán)染染色液至干燥的載玻片上,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

最后由2名以上病理學(xué)專家確定IHC及FISH的檢測(cè)結(jié)果。關(guān)于IHC評(píng)估CD30陽(yáng)性的閾值目前尚缺乏共識(shí),本研究使用>0%和20%的閾值分別評(píng)估了DLBCL患者中CD30的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 納入患者一般資料 納入患者中男79例,女81例;平均年齡(63.03±12.46)歲,≥60歲 103例,<60歲57例;結(jié)外累及79例;Ann Arbor分期為Ⅲ+Ⅳ分期患者75例,而Ⅰ+Ⅱ分期患者85例;IPI評(píng)分≥2分95例,而<2分65例;ECOG PS評(píng)分≥2分37例,而<2分123例。骨髓浸潤(rùn)15例,R-CHOP/ R-X-CHOP(R-mini-CHOP、DA-EPOCH-R、R-Hyper-CVAD、DA-EPOCH-R等)方案治療123例,手術(shù)、放療、BR、MA-Rix、COP、VP等單個(gè)或多個(gè)不含利妥昔單抗的方案治療37例。

2.2 臨床病理特征 DLBCL光鏡表現(xiàn),腫瘤細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)生長(zhǎng),瘤細(xì)胞體積大,核直徑>2個(gè)小淋巴細(xì)胞,高倍鏡下易見核分裂象(見圖1)。CD30研究結(jié)果如下:閾值為>0%時(shí),50例(31%)患者的CD30結(jié)果判讀陽(yáng)性;使用>20%的閾值,27例(17%)患者CD30結(jié)果判讀陽(yáng)性(見圖2)。c-Myc陽(yáng)性表達(dá)率及P53表達(dá)率分別為46%(74/160)、52%(83/160),其它臨床和病理學(xué)特征(見表1)。根據(jù)免疫組化結(jié)果對(duì)160例患者進(jìn)行了細(xì)胞起源分型評(píng)估:17例(11%)為GCB,143例(89%)為non GCB。在所有患者中,BCL-2和c-Myc的表達(dá)率分別為81.25%和46.25%(見圖2),其中有3例(1.9%)原位雜交發(fā)現(xiàn)EB病毒陽(yáng)性,并且這3例患者均表達(dá)CD30(無(wú)論陽(yáng)性閾值>0%,還是>20%),相較CD30陰性組, CD30陽(yáng)性組患者可能有較高的EB病毒陽(yáng)性率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1);另外,23例患者使用FISH檢測(cè)c-Myc、BCL-2基因是否存在斷裂,其中7例僅c-Myc斷裂,2例僅BCL-2斷裂,2例檢測(cè)到c-Myc及BCL-2同時(shí)斷裂,診斷為高級(jí)別B細(xì)胞淋巴瘤伴雙打擊,見圖3。

表1 160例DLBCL患者的臨床病理特征與CD30、c-Myc、P53蛋白表達(dá)情況的比較[n(×10-2)]

圖1 DLBCL形態(tài)特點(diǎn)

圖2 DLBCL組織CD30、c-Myc、P53、BCL-2及CD5蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果

圖3 DLBCL FISH基因檢測(cè)結(jié)果

2.3 CD30、c-Myc、P53及CD5表達(dá)情況及其與患者的臨床病理和預(yù)后參數(shù)之間的相關(guān)性 盡管CD30判讀陽(yáng)性的閾值(>0%和>20%)不同,但分析所得出的結(jié)果卻是相似的。當(dāng)CD30陽(yáng)性閾值>0%時(shí),CD30陽(yáng)性組與CD30陰性組數(shù)據(jù)分析顯示:ECOG PS評(píng)分、EBER兩組參數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);當(dāng)CD30陽(yáng)性閾值>20%時(shí),IPI評(píng)分和EB病毒陽(yáng)性相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。c-Myc陽(yáng)性和陰性表達(dá)組患者與初診時(shí)LDH水平、骨髓浸潤(rùn)發(fā)生率之間對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且c-Myc陽(yáng)性組有較高的Ki-67(>70%,58例,78%)增殖指數(shù)(P=0.001)。CD5陽(yáng)性組與陰性組高BMI及結(jié)外累及的發(fā)生對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余參數(shù)包括B組癥狀、診斷時(shí)的LDH水平、Ann Arbor 分期、IPI評(píng)分、骨髓浸潤(rùn)及ECOG PS評(píng)分等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外,P53陽(yáng)性與陰性之間臨床、預(yù)后參數(shù)數(shù)據(jù)分析差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4 不同亞組CD30、P53表達(dá)與BCL-2、c-Myc蛋白與基因變化的相關(guān)性分析 GCB組與non-GCB組143例,不同亞組CD30、P53表達(dá)患者與BCL-2、c-Myc基因重排或蛋白表達(dá)之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)僅non GCB組中,CD30陽(yáng)性(>20%)患者相較于CD30陰性患者有較高的c-Myc陽(yáng)性表達(dá)率(P<0.05),其余比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同樣,P53表達(dá)組對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、表3。

表2 CD30、P53蛋白表達(dá)情況與c-Myc蛋白和基因變化的相關(guān)性

表3 CD30、P53蛋白表達(dá)情況與BCL-2蛋白和基因變化的相關(guān)性

3 討論

DLBCL是一類由中等至大B淋巴樣細(xì)胞構(gòu)成的腫瘤,腫瘤細(xì)胞的核相當(dāng)于或超過(guò)正常巨噬細(xì)胞的胞核,或者是大于正常淋巴細(xì)胞胞核的2倍,呈彌漫性生長(zhǎng)。形態(tài)學(xué)上包括中心母細(xì)胞變型、免疫母細(xì)胞變型、間變變型以及其它少見的變型(如梭形細(xì)胞變型、印戒細(xì)胞樣變型)[1];DLBLC是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型,是一種高侵襲性腫瘤,在細(xì)胞起源、形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)表型、分子遺傳學(xué)、累及部位、化療反應(yīng)及生存率等方面都表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性[5-6]。

根據(jù)Hans分型,DLBLC細(xì)胞起源可以通過(guò)聯(lián)合使用CD10、BCL-6、IRF4/MUM1抗體,從免疫表型上將其分為具有對(duì)預(yù)后良好的GCB亞型和不良的non GCB亞型。然而,環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松(CHOP)傳統(tǒng)方案聯(lián)合利妥昔單抗作為最基礎(chǔ)的治療方案,可以改善non GCB亞型患者的預(yù)后,減少兩個(gè)亞組之間的預(yù)后差異,但這兩種亞型之間仍然是異質(zhì)的[7]。R-CHOP僅可以治愈60%的患者,仍然有高達(dá)40%的患者對(duì)一線標(biāo)準(zhǔn)治療原發(fā)難治,或者在一線治療緩解后或早或晚出現(xiàn)復(fù)發(fā)[8],其中涉及多種機(jī)制和相關(guān)基因蛋白的異常表達(dá)。因此精確的病理診斷及分子學(xué)分類,早期確定腫瘤病情惡化及不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn),是優(yōu)化DLBLC治療方案,進(jìn)一步提升療效的關(guān)鍵所在。

CD30是腫瘤壞死因子超家族的成員之一,主要在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞表面表達(dá)[9],生理狀態(tài)下表達(dá)水平較低;而在疾病狀態(tài)下,例如病毒感染、自身免疫性疾病及多種淋巴瘤中,CD30則會(huì)呈現(xiàn)較高水平表達(dá)[10]。既往的研究[11]表明,相當(dāng)數(shù)量的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中會(huì)有比例不等的瘤細(xì)胞表達(dá)CD30。有研究認(rèn)為不管細(xì)胞來(lái)源如何(GCB、non GCB),CD30陽(yáng)性DLBCL的總體預(yù)后、無(wú)進(jìn)展預(yù)后都優(yōu)于CD30陰性DLBCL,但其在預(yù)后方面的預(yù)測(cè)價(jià)值仍不十分明確,尚不能將CD30作為DLBCL患者的獨(dú)立預(yù)后因素[12-14]。并且隨著CD30靶向藥物Brentuximab vedotin(BV,維布妥昔單抗)在我國(guó)的上市及多項(xiàng)單/多中心臨床試驗(yàn)的開展,一致認(rèn)為BV與傳統(tǒng)療法相結(jié)合治療CD30陽(yáng)性B細(xì)胞淋巴瘤是一種可行且積極的一線治療方法[15]。本研究中31%(閾值>0%)的DLBCL患者表達(dá)CD30,閾值為20%時(shí),17%的患者表達(dá)CD30,這些結(jié)果與之前其他研究[12,16]中的數(shù)據(jù)是一致的,相對(duì)于CD30陽(yáng)性患者,CD30陰性組患者中存在B組癥狀、IPI評(píng)分≥2分、ECOG PS評(píng)分≥2分患者比例更高。此外有研究發(fā)現(xiàn)兩種不同閾值可以得出類似的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果,提出低水平的CD30表達(dá)似乎足以對(duì)CD30靶向治療做出反應(yīng),閾值>0%可能成為識(shí)別新發(fā)CD30陽(yáng)性DBLCL患者的最佳方法[3]。并且有研究[11]提出絕大部分EBV陽(yáng)性DLBCL患者也表達(dá)CD30,它們之間的這種關(guān)聯(lián)可能是由于特定的病毒機(jī)制引起的,而本研究中3例EBV陽(yáng)性患者也同樣是如此,不管CD30陽(yáng)性閾值>0%還是>20%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外,因?yàn)榇蟛糠諩BV陽(yáng)性DLBCL病例表達(dá)PD-L1或PD-L2[17],有研究指出這類患者可能會(huì)從CD30靶向治療中獲益,尤其是聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療。

癌蛋白c-Myc和腫瘤抑制因子P53在調(diào)控正常細(xì)胞存活和增殖中密不可分,它們的功能也維持組織的穩(wěn)態(tài):c-Myc能夠誘導(dǎo)ARF腫瘤抑制因子的表達(dá),隨后結(jié)合并抑制MDM2的表達(dá),最終引起P53的激活;而P53能夠通過(guò)包括轉(zhuǎn)錄失活和micro-RNA介導(dǎo)的抑制作用在內(nèi)的多種機(jī)制來(lái)對(duì)c-Myc起抑制作用[18-19]。本研究同時(shí)也納入了c-Myc、P53與臨床及病理相關(guān)參數(shù)的觀察,發(fā)現(xiàn)c-Myc陽(yáng)性患者有更高的LDH水平(初診時(shí))、骨髓浸潤(rùn)發(fā)生率及Ki-67(>70%)增殖指數(shù),而P53蛋白表達(dá)與否在本研究中沒(méi)有指標(biāo)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能是樣本量較少的原因。除此之外,CD5在DLBLC患者中有11%的陽(yáng)性表達(dá)率,CD5陽(yáng)性患者結(jié)外累及發(fā)生率較高,雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)提示其與BMI之間存在相關(guān)性,但臨床意義并不大。

2017年WHO第四版[20]造血與淋巴組織腫瘤分類中提出BCL-2和c-Myc雙表達(dá)的DLBLC患者,其預(yù)后比沒(méi)有雙表達(dá)的DLBLC患者差。而后,2022年第五版[21]再次指出BCL-2和c-Myc雙表達(dá)的DLBLC患者不一定有BCL-2和c-Myc基因的重排,而非雙表達(dá)的DLBLC患者也有個(gè)別的病例可以出現(xiàn)BCL-2和c-Myc基因的重排,所以不能根據(jù)BCL-2和c-Myc表達(dá)情況來(lái)準(zhǔn)確推測(cè)是否有BCL-2和c-Myc基因重排。因此,本研究還進(jìn)一步探討了CD30、P53與c-Myc、BCL-2蛋白表達(dá)及基因重排之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示僅在non GCB組,CD30陽(yáng)性與c-Myc表達(dá)相關(guān),但考慮本研究總樣本量較少,且使用FISH檢測(cè)基因重排的患者數(shù)量有限,并未得到更多有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的陽(yáng)性結(jié)果,但是確有其他研究認(rèn)為CD30陽(yáng)性表達(dá)與“雙打擊”之間存在某種聯(lián)系[22],Campuzano-Zuluaga、Hao等[23-24]甚至認(rèn)為CD30與BCL-2表達(dá)和不良預(yù)后之間呈正相關(guān)。

4 結(jié)論

CD30蛋白陽(yáng)性與c-Myc蛋白陰性提示DLBLC患者的臨床病理分級(jí)更低,可能具有更好的預(yù)后,因此其在判斷DLBCL患者的臨床病理及預(yù)后中具有重要作用;同時(shí),可能是受樣本量大小的影響,在本研究中P53蛋白的意義暫不明確,這需要更深層次的研究及干預(yù)實(shí)驗(yàn)明確其在DLBCL中的意義。