李詠 劉立 徐雋 王為

(武漢市第四醫(yī)院藥學(xué)部,湖北 武漢 430033)

缺血性腦血管病(Ischemia cerebrovascular disease,ICVD)是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。盡快恢復(fù)血流循環(huán)是治療此類(lèi)疾病的主要方法,然而腦缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)過(guò)程中血流恢復(fù)后可造成腦內(nèi)氧化因子顯著升高,影響線粒體正常運(yùn)作,導(dǎo)致線粒體損傷,再次提高腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平,并啟動(dòng)凋亡程序,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,加重I/R神經(jīng)損傷[1]。有研究[2]顯示,I/R引起的氧化應(yīng)激可持續(xù)造成線粒體損傷,故線粒體可能是I/R損傷的重要治療靶標(biāo)。據(jù)此,推測(cè)恢復(fù)腦線粒體動(dòng)態(tài)平衡,降低腦組織氧化損傷,抑制細(xì)胞凋亡,可能對(duì)改善I/R神經(jīng)損傷有重要意義。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體δ(Peroxisome proliferators activate receptor δ,PPARδ)是一個(gè)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,在缺血性腦卒中大鼠模型腦組織中低表達(dá)[3],但激活PPARδ可減輕腦組織中線粒體損傷從而改善神經(jīng)功能[4]。GW501516作為PPARδ激動(dòng)劑,通過(guò)激活PPARδ調(diào)控氧化應(yīng)激、能量穩(wěn)態(tài)、線粒體生物合成、細(xì)胞凋亡和炎癥等眾多過(guò)程,可以用于治療與代謝、骨骼肌以及血管等相關(guān)疾病[5-6]。目前,尚不明確GW501516對(duì)I/R后神經(jīng)損傷的治療效果。因此,本研究探討GW501516對(duì)大鼠I/R后神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制,為其臨床治療以及新藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠48只,雄性,8周齡,體質(zhì)量260～280 g,購(gòu)自湖北貝因特生物科技有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2021-0027。于溫度22～24 ℃、相對(duì)濕度50%～60%的SPF級(jí)條件下飼養(yǎng),明暗光照各12 h。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),并獲得湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物委員會(huì)的批準(zhǔn)[安評(píng)中心動(dòng)(福)第202220224號(hào)]。

1.2 藥物與試劑 GW501516(純度:99.15 %)、SR-18292(純度≥98.0 %)購(gòu)自美國(guó)MCE公司;TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司;丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;Blood/Cell/Tissue Genomic DNA Extraction Kit、EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix和GAPDH抗體購(gòu)自武漢科鹿生物科技有限公司;PPARδ抗體和TFAM抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司;過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(PGC-1α)抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;NRF-1抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):DR-200Bs)購(gòu)自上海Diatek公司;熒光定量PCR儀(型號(hào):QuantStudio 6 Flex System)購(gòu)自美國(guó)Thermo fisher公司;電泳儀(型號(hào):DYY-6C)購(gòu)自北京六一儀器廠正置白光拍照顯微鏡(型號(hào):CX31)購(gòu)自日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及I/R模型構(gòu)建 將禁食12 h的SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、模型組(Model)、PPARδ激動(dòng)劑GW501516干預(yù)組(GW組,5 mg/kg)、GW501516+PGC-1α抑制劑SR-18292組(GW+SR-18292組,5 mg/kg GW501516聯(lián)合30 mg/kg SR-18292),每組12只。除sham組外,其余各組大鼠均采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉合并低血壓的方法來(lái)建立I/R模型[7],各組大鼠以3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后,取頸正中切口2 cm并向右延伸1 cm,分離右側(cè)頸總靜脈和雙側(cè)頸總動(dòng)脈,結(jié)扎右側(cè)頸總靜脈遠(yuǎn)心端,央閉近心端后剪“V”型切口,插管入右心房,輸入肝素溶液(25 U/mL)2 mL抗凝,抽取總血容量30%的血液,夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,缺血20 min后去除雙側(cè)動(dòng)脈夾并將血液回輸,形成再灌注,結(jié)扎右側(cè)頸總靜脈,縫合切口。除sham組不夾閉左右頸總動(dòng)脈和抽取血液外,其余組手術(shù)步驟同上述操作。GW組和GW+SR-18292組大鼠腹腔注射(ip)相應(yīng)藥物,1次/d,連續(xù)7 d;sham組和Model組ip等量溶媒,首次給藥為造模前30 min。

1.4 Zea-Longa評(píng)分法評(píng)估大鼠神經(jīng)功能 藥物干預(yù)7 d后,大鼠于清醒狀態(tài)進(jìn)行Zea-Longa評(píng)分[8]評(píng)估大鼠神經(jīng)功能。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分表示無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;1 分表示不能完全伸展對(duì)稱(chēng)前爪;2分表示向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分小鼠行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒;4 分表示無(wú)法自主行走,喪失意識(shí)。分值越高,說(shuō)明動(dòng)物神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.5 HE染色 各組取6只大鼠處死后迅速摘取腦組織,于4%多聚甲醛中固定24 h,分離出海馬區(qū)域,放在標(biāo)記好的包埋框內(nèi),水洗30 min,脫水、包埋制成石蠟切片(3 μm)。石蠟切片脫蠟至水,蘇木素染核10 min,水洗,1%鹽酸分化,水洗,1%氨水返藍(lán),水洗,伊紅染液染色3 min,脫水封片,于鏡下觀察海馬組織細(xì)胞形態(tài)。

1.6 TUNEL染色 將石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水,添加蛋白酶K工作液,37 ℃水浴鍋孵育30 min,PBS洗3次,添加破膜液,室溫孵育10 min,PBS洗3次,添加TUNEL孵育液,避光37 ℃孵育1.5 h,PBS洗3次,滴加DAPI染核,室溫避光孵育30 min,PBS洗,用抗熒光淬滅封片劑封片,顯微鏡下觀察拍照,同時(shí)隨機(jī)選取5個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)海馬組織細(xì)胞凋亡(綠染的細(xì)胞核為陽(yáng)性著色)情況,計(jì)算凋亡率(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 生化檢測(cè)大鼠海馬組織中MDA含量及SOD活性 藥物干預(yù)7 d后,取各組剩余大鼠新鮮海馬組織于80 ℃凍存。取50 mg海馬組織低溫制備100 g/L組織勻漿,1000×g離心10 min,取上清液按照MDA和SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,檢測(cè)大鼠海馬組織中MDA含量和SOD活性。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)大鼠海馬組織中線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù) 將100 mg海馬組織充分研磨后,按照Blood/Cell/Tissue Genomic DNA Extraction Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取,將提取的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,每個(gè)樣本做3復(fù)孔,按照EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,反應(yīng)體系:2×Master Mix 5 μL,引物工作液(2.5 μmol/L)1 μL,Template 1 μL,ddH2O 2 μL,Rox 1 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 ℃ 3 min;95 ℃,58 ℃ 10 s,72 ℃ 30 s,30 s,循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算海馬組織中mtDNA拷貝數(shù)。引物序列為:mtDNA引物F:5′-CTATTCGGAGCCCTACGAGC-3′,R:5′-GCGTATTCGACGTTAAAGCCT-3′;GAPDH(內(nèi)參)引物F:5′-GAGGGTGCAGCGAACTTTATT-3′,R:5′-GACAATGAATATGGCTACAGCAAC-3′。

1.9 Western blot檢測(cè)海馬組織中PPARδ、PGC-1α、核呼吸因子1(Nuclar respiratory factor-1,NRF-1)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Mitochondrial transcription factor,TFAM)蛋白表達(dá)水平 將剩余的海馬組織使用RIPA裂解液提取蛋白質(zhì),BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取10 μL樣本加入蛋白上樣緩沖液,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗PPARδ抗體(1∶1000)、PGC-1α抗體(1∶1000)、NRF-1抗體(1∶2000)、TFAM抗體(1∶1000)和內(nèi)參GAPDH(1∶1000)抗體孵育,TBST清洗,加入按照1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗孵育,TBST清洗后,滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?暗室中曝光,調(diào)整曝光條件,顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描,使用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的光密度值/內(nèi)參蛋白的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 sham組、Model組、GW組、GW+SR-18292組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別為(0.00±0.00)、(3.75±0.50)、(1.25±0.50)、(2.75±0.50)分,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.111,P<0.001);sham組大鼠神經(jīng)功能無(wú)損傷,而Model大鼠神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重。與Model組比較,GW組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05);與GW組比較,GW+SR-18292組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05)。

2.2 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化 sham組大鼠海馬組織細(xì)胞排列緊密、整齊,核大而圓。Model組大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯水腫,細(xì)胞排列疏松,細(xì)胞核明顯皺縮;與Model組比較,GW組大鼠海馬組織病變減輕,細(xì)胞排列趨于規(guī)整;與GW組比較,GW+SR-18292組大鼠海馬組織病變加重,部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核模糊。見(jiàn)圖1。

圖1 海馬組織病理學(xué)變化

2.3 各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡水平 sham組、Model組、GW組、GW+SR-18292組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率分別為(5.07±1.01)%、(40.47±4.13)%、(12.52±1.99)%、(24.71±2.55)%,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=134.299,P<0.001);與sham組比較,Model組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。與Model組比較,GW組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與GW組比較,GW+SR-18292組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 海馬組織中細(xì)胞凋亡水平

2.4 各組大鼠海馬組織中MDA含量及SOD活性 與sham組比較,Model組大鼠海馬組織中MDA含量顯著升高,SOD活性顯著降低(P<0.05);與Model組比較,GW組大鼠海馬組織中MDA含量顯著減低,SOD活性顯著升高(P<0.05);與GW組比較,GW+SR-18292組大鼠海馬組織中MDA含量顯著升高,SOD活性顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠海馬組織中MDA含量和SOD活性

2.5 各組大鼠mtDNA拷貝數(shù) sham組、Model組、GW組、GW+SR-18292組大鼠mtDNA拷貝數(shù)分別為(1.00±0.00)、(0.35±0.06)、(1.82±0.11)、(0.72±0.08),組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=212.812,P<0.001);與sham組比較,Model組大鼠海馬組織中mtDNA拷貝數(shù)顯著降低(P<0.05)。與Model組比較,GW組大鼠海馬組織中mtDNA拷貝數(shù)顯著升高(P<0.05);與GW組比較,GW+SR-18292組大鼠mtDNA拷貝數(shù)顯著降低(P<0.05)。

2.6 各組大鼠海馬組織中PPARδ、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平 與sham組比較,Model組大鼠海馬組織中PPARδ、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與Model組比較,GW組大鼠海馬組織中PPARδ、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與GW組比較,GW+SR-18292組大鼠海馬組織中PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),而PPARδ蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

表2 各組大鼠海馬組織中PPARδ、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平

圖3 海馬組織中PPARδ、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白印跡圖

3 討論

ICVD導(dǎo)致的死亡和殘疾在全球排名第二,唯一的治療方式為血管疏通,但恢復(fù)血流會(huì)引起腦組織氧化和抗氧化失衡,加重氧化,導(dǎo)致線粒體功能障礙,直接或間接引起細(xì)胞凋亡,從而加重神經(jīng)損傷[9-10]。本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉合并低血壓方法構(gòu)建大鼠I/R模型,結(jié)果顯示I/R大鼠海馬組織中MDA含量增加,mtDNA拷貝數(shù)和SOD活性降低,出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,使神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高,神經(jīng)損傷嚴(yán)重。然而,采用GW501516干預(yù)后,I/R大鼠神經(jīng)損傷明顯改善,海馬組織細(xì)胞凋亡率和MDA含量顯著降低,而SOD活性和mtDNA拷貝數(shù)顯著升高,從而推測(cè)GW501516通過(guò)恢復(fù)腦線粒體生物合成,降低腦組織氧化損傷,抑制細(xì)胞凋亡,從而減輕I/R大鼠的神經(jīng)損傷。

GW501516是最有效的PPARδ激動(dòng)劑[11]。而PPARδ 作為一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,屬于PPARs其中一個(gè)亞基。PPARs活化后在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、維持體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、線粒體生物合成、調(diào)控炎癥和氧化應(yīng)激等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。劉仙紅等[13]研究表明,PPARs激活后可導(dǎo)致腦內(nèi)MDA含量降低,SOD活性升高,達(dá)到抗氧化作用。同時(shí),PPARδ 在腦組織中高表達(dá),被認(rèn)為是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)[14]。嚙齒動(dòng)物的大量研究[15-16]表明,GW501516可上調(diào)PPARδ表達(dá),使調(diào)節(jié)線粒體氧化代謝的酶和蛋白質(zhì)水平升高,從而刺激線粒體生物合成。本研究結(jié)果揭示GW501516上調(diào) PPARδ 的表達(dá),以刺激線粒體生物合成,使I/R大鼠海馬組織中mtDNA拷貝數(shù)增加,細(xì)胞凋亡被抑制,并且引起MDA含量降低,SOD活性升高,氧化應(yīng)激損傷降低,減輕神經(jīng)損傷。此外,本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)GW501516還可以上調(diào)PGC-1α。

PGC-1α是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關(guān)鍵基因,可以啟動(dòng)線粒體生物合成,調(diào)控mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。PGC-1α和PPARδ在維持線粒體穩(wěn)態(tài)中顯示出重要的位置。PPARδ可以激活PGC-1α促進(jìn)TFAM和NRF-1的表達(dá)[17-18]。TFAM 是一種線粒體DNA結(jié)合蛋白,NRF-1是一種核DNA結(jié)合因子,兩者可以調(diào)節(jié)線粒體轉(zhuǎn)錄,從而維持線粒體穩(wěn)態(tài)以防止細(xì)胞凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示,GW501516可顯著升高I/R大鼠海馬組織中PPARδ、PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)線粒體生物合成,抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,從而減輕神經(jīng)損傷;但抑制PGC-1α表達(dá)可以顯著逆轉(zhuǎn)GW501516的治療作用,降低I/R大鼠海馬組織中PGC-1α、NRF-1和TFAM蛋白表達(dá)水平,對(duì)PPARδ蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著影響。提示GW501516可能的作用機(jī)制為激活PPARδ受體,上調(diào)PGC-1α表達(dá),當(dāng)PGC-1α表達(dá)被抑制時(shí),GW501516無(wú)法維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的正常,治療中斷。

4 結(jié)論

PPARδ激動(dòng)劑GW501516通過(guò)上調(diào)PGC-1α表達(dá),促進(jìn)線粒體生物合成,降低氧化應(yīng)激損傷,抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而改善大鼠I/R后神經(jīng)損傷。這為探討PPARδ對(duì)I/R引起的神經(jīng)損傷病理生理機(jī)制的作用補(bǔ)充了新內(nèi)容,為臨床提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。