劉巧麗 劉曉豆 耿永芝 李勇

(承德市中心醫(yī)院,河北 承德 067000)

后循環(huán)缺血眩暈(Posterior circulation ischemic vertigo,PCIV)是因椎-基底動脈供血障礙所致前庭神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂而引發(fā)的空間定位障礙綜合征,約占眩暈患者的20%～30%,具體表現(xiàn)為平衡失調(diào)、指物偏向、站立不穩(wěn)、眼球震顫等[1]。PCIV病理機制較為復(fù)雜,其中炎癥反應(yīng)在其進展過程中發(fā)揮著重要作用。由Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)及其下游核因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB) 蛋白組成的信號通路對細胞炎癥反應(yīng)具有重要調(diào)控作用,可作為PCIV防治藥物研究的靶點[2-3]。燈盞花素(Breviscapine,Bre)是由菊科飛蓬屬草本植物短葶飛蓬中提取的黃酮類化合物,具有擴張腦血管、改善腦循環(huán)等藥理學(xué)作用,有研究報道Bre通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路抑制炎癥反應(yīng)對腦外傷大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元起到保護作用[4]。本研究旨在探討B(tài)re對PCIV所致腦組織損傷的影響,并基于TLR4/NF-κB通路探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取清潔級健康雄性Wistar大鼠80只,由河北醫(yī)科大學(xué)(實驗動物公共服務(wù)平臺)提供[SCXK(冀)2020-001],7～8周齡,230～260 g。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫22～24 ℃、濕度40%～60%、12 h光暗交替,通風(fēng)良好,自由飲水進食。實驗過程有關(guān)動物操作均遵循減少、替代、優(yōu)化原則,實驗方案經(jīng)承德市中心醫(yī)院倫理委員審批通過。

1.2 藥物與試劑 Bre注射液(規(guī)格5 mL:20 mg)購自石藥銀湖制藥有限公司(國藥準字Z14021942,批號S2021Y09014);TLR4抑制劑TAK242購自美國Cell Signaling Technology公司(批號20A352F17);HE、TUNEL試劑盒購自長春賽默瑞特科技有限公司(批號202109008、202110013);乳酸(Lactic acid,Lac)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司(批號BC2230、BC0680、SEKR-0002、SEKR-0009、SEKR-0008);TLR4、IκBα、p-IκBα抗體購自美國Affinity公司(批號AF6073、AF5814、AF5826);NF-κB p65、p-NF-κB p65抗體購自北京博奧森生物技術(shù)公司(批號bs-23216R、bs-3543R);β-肌動蛋白(β-actin)抗體、免疫球蛋白(Ig)G二抗購自美國 Proteintech公司(批號60009-1-Ig、SA00001-2);增強化學(xué)發(fā)光(Enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號K2105013)。

1.3 主要儀器 YLS-3TB型跳臺記錄儀(濟南益延科技公司);MoorVMS-LDF1型激光多普勒腦血流檢測儀(美國Moor Instruments公司);R-80錐板型血液流變分析儀(濟南金浩峰技術(shù)有限公司);ND-17型腦立體定位儀、FLUOstar Omega型多功能酶標儀、XS-500i型血細胞分析儀(上海力申科學(xué)儀器有限公司);RM2015 型切片機(德國Leica公司);S25型組織勻漿器(德國IKA公司);7170A型生化分析儀(日本日立公司);U-2000型分光光度計(上海尤尼柯儀器公司);MP3型電泳槽、TransBlot SD型轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-Rad公司);FR-980型電泳圖分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與PCIV模型制備 將適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后的80只大鼠隨機分為假手術(shù)(Sham)組、模型(PCIV)組、Bre組、TAK242組和Bre+TAK242組,每組16只。除Sham組外,其它組通過結(jié)扎右側(cè)頸總動脈和右側(cè)鎖骨下動脈構(gòu)建PCIV大鼠模型,該方法操作簡單、成模穩(wěn)定、重復(fù)性好、與人類臨床病理特點接近等優(yōu)勢,是PCIV相關(guān)實驗研究常用的造模方法[5]。造模結(jié)局判定標準[6]:造模過程監(jiān)測前庭神經(jīng)核血流量,術(shù)后5 min血流量顯著降低并且第2 d仍存活,即可認定造模成功。

1.4.2 給藥 ①藥物溶液配制:取1支Bre注射液加入45 mL生理鹽水稀釋制備濃度0.4 mg/mL的Bre溶液;精確稱量30 mg TAK242溶解于50 mL生理鹽水中制備濃度0.6 mg/mL的TAK242溶液,每天給藥前配制。②給藥:造模完成后,依照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”進行換算,Bre組腹腔注射Bre溶液5 mL/kg,TAK242組腹腔注射TAK242溶液5 mL/kg,Sham組和PCIV組腹腔注射生理鹽水5 mL/kg,各組給藥頻次均為1次/d,療程7 d。

1.4.3 逃避電刺激潛伏期檢測 檢測前3 d開始,每天給藥1 h后進行逃避電刺激實驗訓(xùn)練2次。末次給藥1 h后,將大鼠放入500 rpm轉(zhuǎn)筒中30 s,取出后馬上置入跳臺記錄儀,給予電刺激(30 V、50 Hz),記錄大鼠自受到電刺激到跳上平臺(平臺停留超過30 s)所需的時間,即為逃避電刺激潛伏期。

1.4.4 前庭神經(jīng)核血流量檢測 在造模前和逃避電刺激實驗之后,通過腦立體定位儀定位右側(cè)前庭神經(jīng)核,通過激光多普勒腦血流檢測儀測定前庭神經(jīng)核血流量,血流量下降率(%)=[(造模前血流量-治療后血流量)/造模前血流量]×100%。

1.4.5 血液流變學(xué)指標檢測 腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg實施麻醉,由腹主動脈采血5 mL,通過血液流變分析儀、血細胞分析儀檢測血液流變學(xué)指標,包括全血黏度(低切、中切、高切)、血漿黏度、紅細胞壓積(hematocrit,HCT)、紅細胞聚集指數(shù)(Erythrocyte aggregation index,EAI)、紅細胞變形指數(shù)(Erythrocyte deformability index,EDI)、血沉(Erythrocyte sedimentation rate,ESR)。

1.4.6 海馬神經(jīng)元病理改變和神經(jīng)元凋亡狀況觀察 頸椎脫臼處死大鼠,切取部分右側(cè)海馬組織,4%多聚甲醛溶液固定3 d,經(jīng)脫水、石蠟浸潤包埋、4 μm厚度切片、烤片、梯度乙醇脫蠟、透明處理后,①按照試劑盒說明,取部分切片行HE染色,通過顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元病理改變。②按照試劑盒說明,取部分切片行TUNEL染色,然后通過光學(xué)顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元凋亡狀況(細胞核著黃褐色為凋亡神經(jīng)元),每張染色切片選取5個不重疊的視野計數(shù)神經(jīng)元總數(shù)目和凋亡神經(jīng)元數(shù)目,凋亡指數(shù)(%)=(凋亡神經(jīng)元數(shù)目/神經(jīng)元總數(shù)目)×100%。

1.4.7 海馬組織Lac、LDH、IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量檢測 取剩余的右側(cè)海馬組織,加9倍量生理鹽水后冰上勻漿,4 ℃、3500 rpm離心(離心半徑10 cm)10 min取上清液,按照試劑盒說明,通過生化分析法檢測海馬組織Lac、LDH含量,通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測海馬組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量。

1.4.8 海馬組織蛋白表達檢測 取右側(cè)海馬組織勻漿上清液,通過4 ℃、12000 rpm離心(離心半徑10 cm)30 min提取總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度并配平后,通過Western blot法檢測蛋白表達:10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%蛋白封閉液室溫封閉1 h,加一抗稀釋液TLR4(1∶800)、NF-κB p65(1∶1000)、p-NF-κB p65(1∶1000)、IκBα(1∶800)、p-IκBα(1∶800)、β-actin(1∶2000) 4 ℃孵育過夜,PBS緩沖液沖洗3次后加二抗稀釋液IgG (1:3000)室溫孵育1.5 h,PBS緩沖液沖洗3次后加ECL顯色后,通過image pro plus 6.0軟件測定蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠逃避電刺激潛伏期比較 與Sham組相比,PCIV組逃避電刺激潛伏期明顯延長(P<0.05)。與PCIV組相比,Bre組、TAK242組和Bre+TAK242組逃避電刺激潛伏期明顯縮短(P<0.05)。與Bre組和TAK242組相比,Bre+TAK242組逃避電刺激潛伏期明顯縮短(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠逃避電刺激潛伏期和前庭神經(jīng)核血流量比較

2.2 5組大鼠前庭神經(jīng)核血流量比較 與Sham組相比,PCIV組前庭神經(jīng)核血流量下降率明顯升高(P<0.05)。與PCIV組相比,Bre組、TAK242組和Bre+TAK242組前庭神經(jīng)核血流量下降率明顯降低(P<0.05)。與Bre組和TAK242組相比,Bre+TAK242組前庭神經(jīng)核血流量下降率明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3 5組大鼠血液流變學(xué)指標比較 與Sham組相比,PCIV組全血(低切、中切、高切)黏度、血漿黏度、HCT、EAI、ESR等血液流變學(xué)指標均明顯升高, EDI明顯降低(P<0.05)。與PCIV組相比,Bre組和TAK242組全血(低切、中切、高切)黏度、血漿黏度、HCT、EAI、ESR明顯降低,EDI明顯升高(P<0.05)。與Bre組和TAK242組相比,Bre+TAK242組全血(低切、中切、高切)黏度、血漿黏度、HCT、EAI、ESR明顯降低,EDI明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血液流變學(xué)指標比較

2.4 5組大鼠海馬神經(jīng)元病理改變比較 Sham組海馬神經(jīng)元排列整齊、形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整,未見病理改變。PCIV組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少、排列疏松紊亂、胞體固縮深染、胞核偏移、邊界不清等病理改變。與PCIV組相比,Bre組和TAK242組海馬神經(jīng)元病理改變均明顯減輕。與Bre組和TAK242組相比,Bre+TAK242組海馬神經(jīng)元病理改變明顯減輕。見圖1。

圖1 5組大鼠海馬神經(jīng)元病理改變比較(HE染色,200×)

2.5 5組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡狀況比較 與Sham組相比,PCIV組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯增多,凋亡指數(shù)明顯升高(P<0.05)。與PCIV組相比,Bre組和TAK242組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少,凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)。與Bre組和TAK242組相比,Bre+TAK242組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少,凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 5組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡狀況比較(TUNEL染色,200×)

表3 5組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較

2.6 5組大鼠海馬組織Lac、LDH含量比較 與Sham組相比,PCIV組海馬組織Lac、LDH含量明顯升高(P<0.05)。與PCIV組相比,Bre組和TAK242組海馬組織Lac、LDH含量明顯降低(P<0.05)。與Bre組和TAK242組相比,Bre+TAK242組海馬組織Lac、LDH含量明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠海馬組織Lac、LDH含量比較

2.7 5組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量比較 與Sham組相比,PCIV組海馬組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量明顯升高(P<0.05)。與PCIV組相比,Bre組和TAK242組海馬組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量明顯降低(P<0.05)。與Bre組和TAK242組相比,Bre+TAK242組海馬組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量明顯降低(P<0.05)。見表5。

表5 5組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量比較

2.8 5組大鼠海馬組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達比較 與Sham組相比,PCIV組海馬組織TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα表達量及NF-κB p65、IκBα磷酸化率(p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα)明顯升高(P<0.05)。與PCIV組相比,Bre組和TAK242組海馬組織TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα表達量及NF-κB p65、IκBα磷酸化率明顯降低(P<0.05)。與Bre組和TAK242組相比,Bre+TAK242組海馬組織TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα表達量及NF-κB p65、IκBα磷酸化率明顯降低(P<0.05)。見圖3、表6。

圖3 5組大鼠海馬組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達比較

表6 5組大鼠海馬組織TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα蛋白表達及NF-κB p65、IκBα磷酸化率比較

3 討論

PCIV在中醫(yī)可歸屬“眩暈”“眩冒”“眩悸”“目?！狈懂?“風(fēng)、痰、瘀、火、虛”等所致“氣血虧虛、痰瘀互結(jié)、髓海不足”是其主要病機[7]。收錄于《中國藥典(一部)》的燈盞花具有祛風(fēng)散寒、活血化瘀、化痰通絡(luò)、行氣止痛等功效。Bre是燈盞花的主要有效成分,主要包括燈盞乙素和燈盞甲素,具有擴張血管、抗炎、抗氧化等生物學(xué)活性[8-10]。

本研究結(jié)果顯示,PCIV模型大鼠逃避電刺激潛伏期延長,缺血側(cè)海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)數(shù)量減少、排列疏松紊亂、胞體固縮深染、胞核偏移、邊界不清等病理改變,凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯增多,海馬組織Lac、LDH含量升高,與鄢圣娟等[11]和趙元奎等[12]報道一致;經(jīng)Bre治療能夠明顯縮短PCIV大鼠逃避電刺激潛伏期,改善海馬神經(jīng)元病理改變,提示Bre可減輕PCIV大鼠眩暈癥狀和腦組織損傷,與苗紅星等[13]研究顯示Bre能夠減輕局灶性腦缺血大鼠海馬組織病理改變的結(jié)果相似。主要由前庭感受器、前庭神經(jīng)核及相應(yīng)中樞構(gòu)成的前庭系統(tǒng)對維持機體平衡和空間感知具有重要作用,前庭系統(tǒng)對缺血十分敏感,椎-基底動脈供血障礙導(dǎo)致前庭系統(tǒng)供血不足,引發(fā)前庭神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂而出現(xiàn)眩暈癥狀[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)Bre能夠明顯改善PCIV大鼠前庭神經(jīng)核血流量,改善血液流變學(xué)指標[降低全血(低切、中切、高切)黏度、血漿黏度、HCT、EAI、ESR并提高EDI],這可能是Bre能夠減輕PCIV癥狀的原因。這與張彩峰等[16]和陳玄等[17]研究結(jié)果相似。腦組織缺血刺激小膠質(zhì)細胞分泌IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子而引發(fā)腦炎癥反應(yīng),并且IL-1β和TNF-α具有炎性趨化屬性,二者能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)細胞進一步釋放促炎因子并促進炎細胞浸潤[18-19]。而Bre能夠明顯降低PCIV大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α、IFN-γ含量,抑制腦炎癥反應(yīng),減輕腦組織病理改變。與王少華等[20]報道Bre能夠抑制慢性腦缺血大鼠腦炎癥反應(yīng)、減輕神經(jīng)元損傷的結(jié)果相似。

TLR4是定位于腦小膠質(zhì)細胞的一種跨膜識別受體蛋白,以p65/p50二聚體形式存在的NF-κB為TLR4下游靶蛋白。IκBα為NF-κB特異性抑制蛋白,形成無生理活性的“p65/p50-IκBα”聚合體。本研究發(fā)現(xiàn)PCIV大鼠海馬組織TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα表達量及NF-κB p65、IκBα磷酸化率(p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα)明顯升高,而Bre能夠明顯抑制TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα表達上調(diào)和NF-κB p65、IκBα磷酸化率升高。TLR4可促進NF-κB p65亞基和IκBα磷酸化,“p65/p50-IκBα”聚合態(tài)解離,游離態(tài)p-NF-κB p65核轉(zhuǎn)位后可誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達[21-23]。因此,Bre抑制PCIV大鼠腦炎癥反應(yīng)的作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路活化有關(guān)。這與童軍衛(wèi)等[24]研究結(jié)論相似。為了驗證上述推論,本研究設(shè)置了TLR4抑制劑TAK242組和Bre+TAK242組,結(jié)果顯示,TAK242對PCIV大鼠海馬組織TLR4表達和NF-κB p65、IκBα磷酸化,眩暈癥狀、海馬神經(jīng)元病變與凋亡、腦炎癥反應(yīng)的調(diào)控方向與Bre一致,而Bre+TAK242組上述作用明顯優(yōu)于Bre組和TAK242組,從而進一步證實了Bre減輕PCIV大鼠眩暈癥狀和腦組織損傷的作用與抑制TLR4/NF-κB通路活化有關(guān)。

4 結(jié)論

Bre可減輕PCIV大鼠眩暈癥狀,改善前庭神經(jīng)核血流量,減輕腦組織損傷,作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實驗結(jié)論為Bre作為PCIV治療藥物提供了理論依據(jù),但其作用機制還有待進一步深入研究。