鄧長青 張京蘭 金海濤

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院腦病科, 湖北 武漢 430014)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的主要特征為胰島素分泌不足、高血糖和高脂血癥,屬于一種代謝性疾病,其發(fā)病率逐漸上升,造成DM患者死亡的主要原因是患者發(fā)生心血管并發(fā)癥,而心肌梗死是死亡率最高的并發(fā)癥,推測可能與DM心肌缺血損傷有關[1-2],因此深入探索DM心肌梗死引發(fā)的心肌損傷機制有利于開發(fā)治療方案。黃芪甲苷(Astragaloside A,AS)是從黃芪中提取的黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性等廣泛的藥理活性,在缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,IR)損傷中可發(fā)揮保護心臟的作用[3]。據(jù)報道[4]鐵穩(wěn)態(tài)失衡與多種疾病有關,如心臟病、神經退行性疾病、癌癥和貧血等。膜鐵轉運蛋白1(Ferroportin1,FPN1)是在哺乳動物中唯一被發(fā)現(xiàn)的與鐵釋放相關的跨膜蛋白,在系統(tǒng)性鐵穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用[5]。核因子E2相關因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)是抗氧化反應的關鍵調節(jié)因子,參與保護心肌免于鐵死亡[6]。然而,AS能否通過NRF2/FPN1對DM心肌梗死心肌損傷產生影響尚不清楚。因此本研究通過建立DM心肌梗死大鼠模型,以不同濃度的AS干預,探索其對DM心肌梗死大鼠心肌損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g,6周齡)購自博濟醫(yī)藥科技股份有限公司,許可證號:SYXK(粵)2022-0279。將大鼠飼養(yǎng)在標準實驗室條件下,其中溫度為(25±2)℃,相對濕度為(60±15)%。所有實驗程序均經動物護理和使用委員會批準,倫理批號:2022-06-075。

1.2 實驗試劑 成都慕思生物科技有限公司購入AS(純度≥98%);Sigma Chemical提供鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、2, 3, 5-氯化三苯基四唑(2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride,TTC);Med-ChemExpress公司提供ML385;Servicebio提供Prime-Script RT試劑盒、Abcam公司提供NRF2、FPN1、谷胱甘肽過氧化酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)一抗以及鐵離子試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 DM心肌梗死大鼠模型的制備及干預 所有大鼠適應性飼養(yǎng)5 d后,隨機分為假手術組(10只)及造模組(53只),選取造模組大鼠參照劉宇等[7]方法進行制備DM大鼠模型,大鼠給予8周的高糖飼料喂養(yǎng),隨后腹腔注射65 mg/kg STZ,假手術組給予等體積的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射,并以普通飼料喂養(yǎng)。72 h后(禁食6 h),大鼠出現(xiàn)高血糖(血糖高于16.7 mmol/L),并伴隨多食、多飲、多尿癥狀,則認為DM大鼠造模成功。將DM造模成功的50只大鼠(3只失敗)腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉并進行心電圖監(jiān)測,將大鼠氣管插管,在大鼠左鎖骨中線第3～4肋間切開肋骨,完全暴露心臟,在距左心耳下緣2 mm,以6-0尼龍線結扎左冠狀動脈前降支,當心尖區(qū)和左心室壁從紅色變?yōu)榘咨?心電圖ST段升高時,表明DM心肌梗死大鼠模型構建成功[7],假手術組僅進行開胸,但不結扎。將50只造模成功的DM心肌梗死大鼠隨機分為梗死組、AS低劑量(AS-L)組、AS中劑量(AS-M)組、AS高劑量(AS-H)組、AS-H+Nrf2抑制劑(ML385)組。AS-L組、AS-M組、AS-H組分別以20 mg/kg AS、40 mg/kg AS、80 mg/kg AS灌胃干預[8];AS-H+ML385組以80 mg/kg AS灌胃,同時進行腹腔注射30 mg/kg ML385干預[9],其余各組進行等體積的生理鹽水干預,1次/d,連續(xù)30 d。

1.3.2 心功能指標檢測 彩超采集數(shù)據(jù)計算大鼠左心室射血分數(shù)(Left ventricular ejection fraction,LVEF);麻醉大鼠靜脈取血,全自動生化儀分析肌酸激酶同工酶-MB(Creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)水平。

1.3.3 TTC染色評估心肌梗死體積比 各組隨機選取3只大鼠,麻醉并使大鼠安樂死,取出心臟,在-20 ℃下冷凍30 min,然后制備組織2 mm厚切片,將切片在1% TTC緩沖液中孵育30 min,然后在10%甲醛溶液中固定24 h,對切片進行成像,Image Pro Plus 7.0軟件測量心肌梗死體積,其百分比以梗塞體積與切片總體積的占比表示。

1.3.4 樣本采集 麻醉并處死各組剩余7只大鼠,取出心肌組織,一部分浸泡到甲醛溶液中;另一部分于-80 ℃保存。

1.3.5 HE檢測心肌組織病理學變化 取出固定于甲醛溶液中的心肌組織,然后將組織在一系列乙醇和二甲苯溶液中脫水并包埋在石蠟中,切片機將心臟組織切成4 μm厚的切片,使用蘇木精和伊紅染色檢查組織病理學變化。

1.3.6 試劑盒檢測鐵離子含量 取出-80 ℃保存的心肌組織,離心后按照試劑盒說明書檢測鐵離子含量。

1.3.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表達水平 Trizol試劑從心肌樣品中提取總RNA。然后以Prime-Script RT試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板,通過Bio-Rad CFX Connect實時PCR檢測系統(tǒng)進行qRT-PCR反應,使用2-ΔΔCT方法分析基因的表達,其中β-actin為參照。引物序列,見表1。

1.3.8 Western blot檢測心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達 取出1.3.4中保存的心肌組織,采用預冷的RIPA裂解緩沖液中提取蛋白,取上清液并添加到蛋白質緩沖液中。然后測量蛋白濃度并通過SDS-PAGE凝膠分離總蛋白,之后轉移到PVDF膜上,于脫脂牛奶中孵育1 h。將一抗(GPX4,1∶1000;NRF2,1∶1000;FPN1,1∶1000;β-actin,1∶1000)在4 ℃下與膜一起孵育過夜。然后在室溫下加入二抗(1∶5000)孵育1 h,Image J分析NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達水平。

2 結果

2.1 AS對各組大鼠心功能指標的影響 與假手術組相比,梗死組大鼠LVEF顯著降低,CK-MB、CK顯著增加(P<0.05);與梗死組相比,AS-L組、AS-M組、AS-H組大鼠LVEF顯著增加,CK-MB、CK顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05);與AS-H組相比,AS-H+ML385組大鼠LVEF顯著降低,CK-MB、CK顯著增加(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠LVEF、CK-MB、CK比較

2.2 AS對各組大鼠心肌梗死體積比的影響 心肌梗死體積比:梗死組較假手術組、AS-H+ML385組較AS-H組均顯著增加,AS-L組、AS-M組、AS-H組較梗死組顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性(均P<0.05),見圖2。

圖2 各組大鼠心肌梗死體積比比較

2.3 AS對各組大鼠心肌組織病理學的影響 假手術組大鼠無病理損傷出現(xiàn);梗死組大鼠出現(xiàn)嚴重水腫、炎癥發(fā)生并伴隨心肌壞死;AS-L組、AS-M組、AS-H組干預后,各組大鼠病理損傷逐漸得到改善,以AS-H組改善最為顯著;AS-H+ML385組水腫等病理現(xiàn)象較AS-H組加重。見圖3。

2.4 AS對各組大鼠鐵離子含量的影響 鐵離子含量:梗死組較假手術組顯著增加, AS-H+ML385組較AS-H組顯著增加(均P<0.05);AS-L組、AS-M組、AS-H組較梗死組顯著降低,呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠鐵離子比較

2.5 AS對各組大鼠心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1mRNA表達的影響 NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表達:梗死組較假手術組, AS-H+ML385組較AS-H組均顯著降低(P<0.05);AS-L組、AS-M組、AS-H組較梗死組顯著增加,呈現(xiàn)劑量依賴性(均P<0.05)。見圖5。

圖5 心肌組織NRF2、GPX4、FPN1 mRNA表達比較

2.6 AS對各組大鼠心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達的影響 NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達:梗死組較假手術組, AS-H+ML385組較AS-H組均顯著降低(P<0.05);AS-L組、AS-M組、AS-H組較梗死組顯著增加,呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)。見圖6、表2。

圖6 心肌組織中NRF2、GPX4、FPN蛋白表達(Western blot圖)

表2 心肌組織中NRF2、GPX4、FPN1蛋白表達的比較

3 討論

心肌梗死嚴重威脅人們健康狀況和生活質量,但對DM患者的威脅更大,是DM患者常見的并發(fā)癥,且預后差,死亡率更高,且在全球范圍內產生醫(yī)療費用較高,引起了人們的關注[10-11]。因此本研究通過高糖飼料及STZ建立DM大鼠模型,當血糖高于16.7 mmol/L時,并伴隨三多癥狀(多食、多飲、多尿),則認為DM大鼠造模成功。將DM大鼠通過結扎左冠狀動脈前降支,心電圖顯示ST段提高則表明DM心肌梗死大鼠模型構建成功,可進入下一步探究中。

AS是一種從柿子葉或綠茶種子中提取的黃酮類化合物,具有多種藥理特性,包括抗炎、抗氧化和抗病毒以及對皮炎和神經元損傷的保護作用[12]。吳紅偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)AS具有保護心臟的作用。除此之外,在對心肌梗死大鼠的研究中,AS可改善大鼠心功能及心室重構[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)梗死組大鼠病理損傷嚴重,梗死體積比增加,心功能受損,提示DM心肌梗死大鼠心肌嚴重受損。但經AS-L、AS-M、AS-H干預后,大鼠心功能及病理損傷得到改善,梗死體積比減少,提示AS可保護DM心肌梗死大鼠心肌受損。

NRF2是一種應激誘導的轉錄因子,許多負責預防脂質過氧化以及由此引發(fā)的鐵毒性的蛋白質和酶均是NRF2靶基因[16]。FPN1是一種鐵運轉氨酶哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的一種重要的鐵輸出物,受鐵水平的影響,其水平不足以維持鐵過載細胞中的鐵穩(wěn)態(tài),可導致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)過度循環(huán)產生,引發(fā)氧化應激損傷,導致鐵死亡[17]。而鐵死亡是一種新型的細胞死亡,與氧化應激密切相關,以產生ROS和脂質過氧化為特征,研究[18]表明,鐵死亡是心肌梗死發(fā)展的關鍵機制。在谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)家族成員中,已知GPX4特異性催化脂質過氧化物的減少,從而清除脂質ROS,與鐵死亡息息相關[19]。如柚皮素通過調節(jié)NRF2/GPX4軸抑制鐵生死亡減輕心肌缺血/再灌注損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)梗死組大鼠鐵離子含量增加,NRF2、GPX4、FPN1 mRNA及蛋白表達降低,提示DM心肌梗死大鼠心肌受損可能通過抑制NRF2/FPN1通路發(fā)生鐵死亡實現(xiàn)。但經AS-L、AS-M、AS-H干預后,NRF2、GPX4、FPN1mRNA及蛋白表達上調,鐵含量減少,推測AS可通過激活NRF2/FPN1信號通路保護DM心肌梗死大鼠心肌受損,可能和鐵素相互作用,幫助蛋白質與藥物結合,抑制鐵死亡,以調節(jié)疾病的進展。為驗證實驗推測,以NRF2抑制劑-ML385回復驗證,結果顯示,AS-H+ML385組LVEF、NRF2、GPX4、FPN1mRNA及蛋白表達顯著降低,梗死體積比、鐵離子含量、CK-MB、CK顯著增加,推測AS-H可DM心肌梗死大鼠心肌受損,但由于NRF2/FPN1通路被ML385阻斷,致使DM心肌梗死大鼠心肌受損,逆轉了AS-H對DM心肌梗死大鼠的保護作用,進一步表明AS可通過激活NRF2/FPN1通路抑制鐵死亡保護DM心肌梗死大鼠心肌受損。

4 結論

AS通過激活NRF2/FPN1通路抑制鐵死亡,改善DM心肌梗死大鼠受損,為DM心肌梗死治療提供依據(jù),但由于機制復雜,后續(xù)需開展細胞實驗進一步核實。