劉宇彪 周花玩 鞠上

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)外科,北京 102600; 2.天承金象中醫(yī)診所,北京 100045; 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院周圍血管科,北京 100061)

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月—2021年1月中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)接診的糖尿病足患者60例作為糖尿病足組,選擇同期因外傷在我院行清創(chuàng)手術(shù)的2型糖尿病非病足組患者19例作為糖尿病非病足組,并選取同期因外傷在我院接受清創(chuàng)手術(shù)的無(wú)糖尿病病史且無(wú)創(chuàng)面感染的患者60例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):①相關(guān)診斷符合《中國(guó)老年2型糖尿病診斷措施專家共識(shí)(2018)版》[12]。②糖尿病足患者除滿足①外,糖尿病足分級(jí):Wagner分級(jí)≥1。③臨床資料完整。④診斷為糖尿病足均為初次且未進(jìn)行任何治療。⑤近期未使用利尿劑、抗凝劑。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并惡性腫瘤、嚴(yán)重創(chuàng)傷及肝腎功能嚴(yán)重異常。②機(jī)體處于感染的應(yīng)急狀態(tài)。③不具有完整的臨床資料。④痛風(fēng)史、激素類藥物服用史。⑤合并免疫系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過,所有研究對(duì)象均簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 通過回顧性分析查閱患者基線資料,主要包括:年齡、性別、糖尿病病程、血壓、血糖、血生化指標(biāo)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血脂、Wanger分級(jí)及住院時(shí)間等。計(jì)算質(zhì)量體質(zhì)量指數(shù)(BMI)及腰臀比(Waist-to-Hip Ratio, WHR)。使用全自動(dòng)生化儀對(duì)纖維蛋白原(FG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、血肌酐(SCr)、血尿酸(UA)等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)糖化血紅蛋白(HbA1c)通過使用高效液相色譜法。ELISA法檢測(cè)血清中1L-6、1L-4、TNF-β、hs-CRP水平。

1.2.2 創(chuàng)面標(biāo)本采集 研究對(duì)象治療常規(guī)換藥處理過程中,創(chuàng)面覆蓋凡士林紗布,每日更換,不使用含外源性細(xì)胞因子和藥物或敷料,于換藥時(shí)用組織剪留取創(chuàng)面中央部位肉芽組織。清洗后,冷凍20～30 min于液氮中,-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 創(chuàng)面組織中HOX13蛋白表達(dá)檢測(cè) 將研究所取組織標(biāo)本放入遇冷的研缽中,將其粉碎至粉末。加適量裂解液30 min后,進(jìn)行冰上裂解反應(yīng),后在4 ℃條件下,離心5 min取上清(4 ℃,12000 r/min)。根據(jù)BCA試劑盒(Promega生物技術(shù)有限公司,美國(guó))說明檢測(cè)蛋白濃度。100 ℃條件下蛋白樣品變性3～5 min,上樣緩沖液與變性蛋白80 μg進(jìn)行充分混勻,后恒壓電泳。在行濃縮膠(90 V電壓),分離膠(120 V電壓),停止電泳在電泳至距離分離膠下端約1 cm處。后取出凝膠,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理,完成后封閉2 h(5%脫脂奶粉),后依次加入1∶1000稀釋后的一抗HOX13單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)、1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(美國(guó)Abcam公司)反應(yīng),顯色液滴加,轉(zhuǎn)移至暗室,曝光處理,加入內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),分析蛋白水平。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,提取蛋白,再檢測(cè)HOX13、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4的表達(dá),參照1.2.3中步驟。

1.2.5 HOX13免疫組化染色 固定樣本組織通過使用4%多聚甲醛,后制成石蠟切片(5 μm)。使用3%過氧化氫溶液去除脫水后的石蠟切片中的內(nèi)源性過氧化物酶,封閉組織切片30 min通過3%的胎牛血清白蛋白(美國(guó)Hyclone公司)。兔抗人HOX13單克隆抗體(Sigma公司,美國(guó))滴加處理,在4 ℃條件下對(duì)其進(jìn)行孵育過夜處理;二抗滴加。在室溫條件下進(jìn)行孵育(1 h)。對(duì)其進(jìn)行沖洗處理使用PBS,SABC孵育。對(duì)其進(jìn)行顯色處理使用DAB,蘇木素復(fù)染。有經(jīng)驗(yàn)病理師按照盲法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立判斷。判讀標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞漿呈棕色著色,陰性細(xì)胞為無(wú)棕色著色。

總之，對(duì)有攻擊性行為的幼兒，應(yīng)更多地強(qiáng)調(diào)愛和平靜、溫和的教育，注意在平時(shí)培養(yǎng)他們的愛心和善良的品格，鏟除孩子產(chǎn)生攻擊性行為的土壤，讓幼兒從小學(xué)會(huì)愛自己、愛別人，尊重自己、尊重別人。

1.2.6 細(xì)胞模型構(gòu)建與分組 HOX13基因質(zhì)粒構(gòu)建:采用GenBank查找序列獲得HOX13過表達(dá)以及敲除靶點(diǎn),通過Peimer-BLAST工具在靶點(diǎn)上設(shè)計(jì)引物序列,獲得基因過表達(dá)與敲除質(zhì)粒,以上操作由上海吉瑪公司完成。①細(xì)胞分離培養(yǎng)與分組:無(wú)菌條件下于超凈工作臺(tái)上取標(biāo)本組織,去髓核、表皮及結(jié)締組織后將組織切成2～3 mm后置于培養(yǎng)皿中,PBS清洗2次后密度以1～2塊組織/cm2排列整齊,表面滴加1～2滴胎牛血清于每顆組織表面,置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行6～8 h培養(yǎng)后組織塊貼壁,后培養(yǎng)箱中加入適量DMEM(包含10%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清),培養(yǎng)過夜,于第2 d觀察培養(yǎng)基無(wú)污染后換液,后換液每2～3 d一次,觀察有成纖維細(xì)胞組織遷移出于1周后,可傳代待貼壁生長(zhǎng)達(dá)80%以上時(shí)。而后通過Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染2 μgHOX13基因過表達(dá)、敲除質(zhì)粒,換液在24 h后,在質(zhì)粒完成轉(zhuǎn)染48 h后通過1 μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選,篩選時(shí)長(zhǎng)為72 h,后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選至96孔板上,最終分組為敲除組(轉(zhuǎn)染敲除HOX13質(zhì)粒)、過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)HOX13質(zhì)粒)、空白組(未做任何處理)。② HOX13轉(zhuǎn)染效率鑒定:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法鑒定HOX13 基因轉(zhuǎn)染效率,取3組細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA,測(cè)定RNA純度和含量,通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,通過RT-PCR法鑒定HOX13基因轉(zhuǎn)染效率,通過2-△△CC法計(jì)算。

1.2.7 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 在96孔板中共設(shè)8個(gè)孔/組,密度為3×103個(gè)/孔均勻鋪滿。在細(xì)胞培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)進(jìn)行72 h的培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)正常且細(xì)胞貼壁。吸去其內(nèi)舊液,使用PBS緩沖液進(jìn)行2次沖洗,加入含HOX13蛋白2 μg/ml培養(yǎng)基。孵育72 h后,吸出培養(yǎng)液使用排槍,加入CCK-8溶液按10%濃度配置,每孔加入100 μL混合液,37 ℃條件下孵育30 min。調(diào)節(jié)分光光度計(jì),檢測(cè)吸光度(Optical density,OD)于450 nm波長(zhǎng)處。

1.2.8 EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖數(shù)目 1×104/孔細(xì)胞培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,按照實(shí)驗(yàn)分組添加10 μmol/L5-乙炔基2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)試劑; 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)6 h后,4%多聚甲醛溶液固定45 min,按照EdU試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn); 并用5 mg/LDAPI染細(xì)胞核20 min,TCSSP2激光掃描共焦顯微鏡觀察。Image-Pro Plus 6.0.1圖像軟件分析細(xì)胞增殖數(shù)目。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 同前的細(xì)胞處理,對(duì)目的培養(yǎng)基進(jìn)行更換根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,進(jìn)行72 h的培養(yǎng),消化處理后洗滌使用PBS,Annexin VFITC 聯(lián)合PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較 糖尿病足組年齡46～71歲;糖尿病非病足組年齡38～67歲;對(duì)照組年齡35～63歲。3組患者年齡、踝肱指數(shù)、病程、Hb、WBC、FG、HbA1c、白蛋白(ALB)、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中糖尿病非病足組年齡、病程、WBL、FG、HbA1c、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著低于糖尿病足組(均P<0.05),對(duì)照組年齡、病程、WBC、FG、HbA1c、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著低于糖尿病非病足組(P<0.05)。踝肱指數(shù)、Hb、白蛋白在糖尿病病足組、糖尿病非病足組、對(duì)照組依次顯著偏高(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者一般資料比較

2.2 HOX13與臨床特征相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果表明,HOX13表達(dá)與年齡、病程、Hb、FG、HbA1c、、TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);與踝肱指數(shù)、ALB呈正相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 臨床特征與HOX13的相關(guān)性分析

2.3 免疫組化檢測(cè)HOX13在糖尿病足組、糖尿病非病足組、對(duì)照組組織中表達(dá) HOX13呈棕色顆粒表達(dá)于細(xì)胞核,相較于糖尿病非病足組與對(duì)照組,HOX13在糖尿病足組中的顏色深度明顯變淺,染色面積明顯下降,可見HOX13的表達(dá)量明顯影響糖尿病患者足的破損情況,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)HOX13在不同組別中表達(dá)(200×)

2.4 組織中HOX13蛋白表達(dá) 收集3組新鮮組織,提取總蛋白后,通過western blot檢測(cè)HOX13蛋白的表達(dá)水平,與對(duì)照組相比,糖尿病非病足組與糖尿病足組的HOX13蛋白表達(dá)水平明顯降低,其中表達(dá)更低的為糖尿病足組(P<0.05),見圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)各組HOX13蛋白表達(dá)

2.5 體外細(xì)胞模型

2.5.1HOX13基因轉(zhuǎn)染效率鑒定 過表達(dá)組、敲除組、空白組HOX13基因mRNA表達(dá)量分別為(2.36±0.80)、(0.44±0.12)、(1.65±0.51),組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.207,P<0.001)。過表達(dá)組HOX13基因mRNA表達(dá)量顯著偏高,敲除組HOX13基因mRNA表達(dá)量顯著偏低。提示細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

2.5.2 過表達(dá)組、敲除組、空白組間細(xì)胞炎性因子比較 ELISA法檢測(cè)各組炎癥因子,較于空白組,過表達(dá)組TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著偏低(P<0.05);敲除組TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著升高(P<0.05)。western blot檢測(cè)各組TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4蛋白表達(dá),與空白組比較,敲除組顯著升高,過表達(dá)組顯著降低(均P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)3組間細(xì)胞內(nèi)炎癥因子

表3 3組間細(xì)胞內(nèi)炎癥因子比較

2.5.3 3組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞目的蛋白表達(dá),較于空白組,敲除組Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)顯著偏高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著偏低(均P<0.05);較于空白組,過表達(dá)組Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)顯著偏低,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著偏高(均P<0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)

2.5.4 3組細(xì)胞凋亡率比較 相較于空白組與過表達(dá)組,HOX13敲除組的糖尿病足組Q4象限正常細(xì)胞占比明顯下降,表明HOX13低表達(dá)明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡,(F=6.791,P<0.001),見圖5。

圖5 各組細(xì)胞凋亡情況比較

2.6 3組間細(xì)胞增殖影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過表達(dá)組細(xì)胞增殖狀態(tài)較空白組顯著增高(F=6.842,P<0.001),敲除組較空白組顯著降低(F=8.537,P<0.001)。見圖6。

圖6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

2.7 EDU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 與空白組比較,敲除組EDU標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P<0.05);過表達(dá)組EDU標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目明顯升高(P<0.05)。由此說明HOX13低表達(dá)的糖尿病足細(xì)胞增殖能力明顯降低。見圖7。

圖7 EDU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況(200 μm,200×)

3 討論

糖尿病足是以足部保護(hù)性感覺喪失為特征的神經(jīng)病變,常伴有外周動(dòng)脈疾病的血流受限,嚴(yán)重者可能會(huì)感染并導(dǎo)致截肢[13]。糖尿病足具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確,已有研究表明細(xì)胞過度凋亡是其重要的病理特征。多項(xiàng)研究證實(shí)HOX13可參與細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控[14-15],而細(xì)胞凋亡對(duì)維持細(xì)胞的正常形態(tài)與功能,維持機(jī)體穩(wěn)定具有重要作用,細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種疾病[16]。

糖尿病足的發(fā)生發(fā)展受多種因素共同作用[17],本研究結(jié)果表明糖尿病足組患者較其他組患者年齡偏大,病程較長(zhǎng)。與費(fèi)揚(yáng)帆等[18-19]研究結(jié)果一致。另外本研究還發(fā)現(xiàn)WBC、FG、HbA1c水平也較其他組高,分析機(jī)制可能為就理論上血糖控制不佳,患病時(shí)間較久,機(jī)體免疫抵抗能力降低,進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病足等相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率升高,而白細(xì)胞計(jì)數(shù)可以對(duì)感染情況進(jìn)行評(píng)估。糖尿病足組HbA1c顯著偏高,分析可能血糖長(zhǎng)期控制水平與糖尿病足發(fā)生顯著相關(guān),外周動(dòng)脈粥樣硬化可由長(zhǎng)期高血糖引起,肢體潰瘍壞死風(fēng)險(xiǎn)隨之增加。這與既往研究[20-21]結(jié)果類似。同時(shí)因糖尿病患者的機(jī)體長(zhǎng)期在高血糖條件下,其具有血管內(nèi)皮功能障礙加重,脂質(zhì)過氧化,黏附因子水平升高,血液凝固型增高等一系列病理生理變化,下肢缺血性病變隨之加快,糖尿病足發(fā)生率升高。而糖尿病足組FG顯著偏高可導(dǎo)致血液黏度增加,隨之血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷增加,病灶內(nèi)血栓形成,這與李惠琴等[22]相關(guān)研究相一致?？梢娔挲g、WBC、FG、HbA1c、病程等升高,可加大發(fā)生糖尿病足的風(fēng)險(xiǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)糖尿病足組患者踝肱指數(shù)、Hb、ALB較其他組顯著偏低。分析原因可能低ALB及低HB可加重血脂紊亂及感染。提示踝肱指數(shù)、低ALB、低HB偏低可加大發(fā)生糖尿病足的風(fēng)險(xiǎn)。

有研究[23]發(fā)現(xiàn)成人成纖維細(xì)胞可在體內(nèi)和多層體內(nèi)維持胚胎HOX模式的特征,這表明它們是跟蹤轉(zhuǎn)錄記憶機(jī)制的有價(jià)值的系統(tǒng)。而HOX13可實(shí)現(xiàn)對(duì)多項(xiàng)關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展[24]。有研究[25]發(fā)現(xiàn)在解剖遠(yuǎn)端部位出生后的人類皮膚中,HOXA13蛋白在表皮中不表達(dá),而在真皮中表達(dá)。但是否與糖尿病足發(fā)生和創(chuàng)面的潰瘍加重及愈合等相關(guān)還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),相較于糖尿病非病足組與對(duì)照組,糖尿病足患者的HOX13表達(dá)顯著降低,且HOX13表達(dá)與年齡、病程、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等呈負(fù)相關(guān),踝肱指數(shù)、白蛋白與HOX13呈正相關(guān)。這提示HOX13可能與DF的發(fā)生相關(guān),其可能對(duì)DF的治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有指導(dǎo)作用。有研究[26-27]發(fā)現(xiàn)隨著累積血糖負(fù)荷的加重,足部潰瘍的發(fā)病率也在增加,而糖基化終末產(chǎn)物的啟動(dòng)因子可能促進(jìn)了炎癥的發(fā)生,同時(shí)也通過細(xì)胞增殖促進(jìn)了血管壁基質(zhì)增生,另外還對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)病足患者TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著偏高,且與HOX13呈負(fù)相關(guān),說明HOX13可能加重了糖尿病足的發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng),且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)HOX13敲除時(shí)TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著偏高,HOX13過表達(dá)時(shí),TNF-β、hs-CRP、1L-6、1L-4顯著降低。進(jìn)一步提示HOX13可能可能會(huì)加重炎癥反應(yīng),進(jìn)而加重糖尿病足的潰瘍。

在成人成纖維細(xì)胞中的特異性HOX基因的表達(dá)可作為穩(wěn)態(tài)和再生期間皮膚的位置記憶源[28]。有研究[30]發(fā)現(xiàn)HOXA13對(duì)成纖維細(xì)胞WNT5A的調(diào)控是調(diào)控位點(diǎn)特異性表皮分化的機(jī)制之一,HOXA13可能決定了誘導(dǎo)成年人成纖維細(xì)胞WNT5A表達(dá)是否繼續(xù)提供遠(yuǎn)端特異性功能,而HOXA13的表達(dá)可能與傷口難愈與細(xì)胞增殖減慢及細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。且已有多項(xiàng)研究[31]表明HOX13可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,HOX13調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡通過多種通路。本研究也發(fā)現(xiàn)較于空白組,HOX13敲除時(shí)明顯增加細(xì)胞凋亡,過表達(dá)時(shí)顯著抑制凋亡,經(jīng)典凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白在HOX13敲除組表達(dá)顯著偏高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著偏低,當(dāng)HOX13過表達(dá)時(shí)以上凋亡因子出現(xiàn)顯著相反的結(jié)果。提示HOX13可能控制了糖尿病足細(xì)胞的凋亡,這與以往研究結(jié)果具有一致性。本研究提示HOX13敲低的糖尿病足成纖維細(xì)胞增殖能力明顯降低,這與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致?？梢奌OX13在細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用,這與其他研究[32]發(fā)現(xiàn)的HOX基因可誘導(dǎo)人脂肪肉瘤、白血病細(xì)胞等多種細(xì)胞增殖和凋亡的結(jié)果一致。但本研究樣本量較少,導(dǎo)致結(jié)果具有一定偏奇性,另外基礎(chǔ)研究方法較為簡(jiǎn)單,實(shí)驗(yàn)具有一定局限性,將在后續(xù)研究中優(yōu)化這些問題,為糖尿病的研究提供更多可靠信息。

4 結(jié)論

HOX13在糖尿病足中呈低表達(dá),HOX13高表達(dá)可促進(jìn)糖尿病足成纖維細(xì)胞的增殖,抑制凋亡,并抑制炎癥因子的表達(dá)。HOX13表達(dá)變化量與糖尿病足發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),HOX13有希望成為糖尿病足治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)的新靶點(diǎn)因子,可為糖尿病足發(fā)病機(jī)制提供新思路。