劉峰，張培雨，姜雯，劉樹堂，孫雪芳，趙子鉉，劉湘，孫青

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東青島 266109)

磷是組成植物體內(nèi)核酸和磷脂等物質(zhì)的重要礦質(zhì)元素，缺磷往往會導(dǎo)致植株矮小、瘦弱、抗逆性差和產(chǎn)量降低等[1]。 我國耕地土壤全磷含量一般在0.2～1.1 g/kg，土壤磷素存量大，但其中約95%不能被植物直接吸收利用，而土壤中磷素供給不足常常是制約作物生長發(fā)育的重要原因之一[2]。 我國約有74%的土壤缺磷，生產(chǎn)上通常采用外施大量磷肥補(bǔ)充作物對磷的需求，但大部分磷肥因土壤金屬離子的吸附作用被固定成難溶磷在土壤中大量積累，只有1%～5%的土壤總磷是以可被植物吸收利用的可溶性形式存在，因此能夠被植株吸收利用的量很低，磷肥利用率只有10%～25%。 磷肥施用量高而利用率低的問題不僅造成了肥料的浪費(fèi)，對土壤質(zhì)量以及水質(zhì)也帶來了威脅[3]。 另據(jù)報(bào)道，磷肥的生產(chǎn)原料磷礦石預(yù)計(jì)將在未來50～100 年間消耗殆盡[4-5]。 因此，通過綠色、高效、經(jīng)濟(jì)的解磷措施挖掘土壤潛在磷庫對解決作物缺磷、實(shí)現(xiàn)作物對磷的高效利用、減輕土壤面源污染及維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。

解磷微生物因其高效的解磷能力被認(rèn)為是降解土壤難溶磷的有效途徑之一。 研究表明，土壤中存在大量的解磷微生物，解磷細(xì)菌包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動桿菌屬(Acinetobactersp.)等[6]，解磷真菌包括青霉菌屬(Penicillium)和曲霉菌屬(Aspergillus)等[7]。 其中，解磷真菌的解磷能力一般是解磷細(xì)菌的幾倍甚至更高，而且遺傳性狀更加穩(wěn)定，對植酸鈣、磷酸鈣等難溶磷源均有較強(qiáng)解磷能力，具備解磷效率高、適應(yīng)性強(qiáng)、多重解磷機(jī)制共同解磷的特點(diǎn)[8]，同時，解磷真菌還有促進(jìn)植株生長和提高抗逆性等作用，被廣泛開發(fā)成生物菌肥用于土壤潛在磷庫的挖掘與利用[9-10]。 如李豆豆等[11]從番茄根際土中分離出草酸青霉(Penicillium oxalicum)，發(fā)現(xiàn)其對磷酸鈣、磷酸鋁等難溶性無機(jī)磷具有較好解磷效果；李小軍等[12]從煙草根際土壤中篩選出一株煙曲霉(Aspergillus fumigatiaffinis)，能夠有效提高土壤中有效磷含量，對煙草具有較好的促生效果。 目前，關(guān)于解磷真菌的研究主要集中于解磷菌的篩選、解磷機(jī)理及其對作物生長的影響，對其解磷的分子機(jī)理研究較少。

本課題組前期從玉米根際土中篩選到一株對難溶性無機(jī)磷和有機(jī)磷均具有較好解磷效果的解磷真菌SW-10，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子鑒定確定為產(chǎn)紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)。 目前關(guān)于產(chǎn)紫青霉菌的報(bào)道多集中于其解磷條件的優(yōu)化，如Scervino 等[13]研究了產(chǎn)紫青霉菌解無機(jī)磷的最適pH 值為6.5，碳源為葡萄糖，氮源為(NH4)2SO4，能通過產(chǎn)生有機(jī)酸溶解難溶性無機(jī)磷；Della Mónica 等[14]報(bào)道了產(chǎn)紫青霉菌產(chǎn)生胞外磷酸酶的最適pH 值為6.0～6.5，磷源為卵磷脂。 但對于產(chǎn)紫青霉菌解磷的分子機(jī)制尚無報(bào)道。 本研究基于Illumina NovaSeq 平臺對該SW-10 菌株進(jìn)行全基因組序列測序分析，并對解磷相關(guān)基因及代謝通路等進(jìn)行初步分析，以期為闡明產(chǎn)紫青霉菌解磷機(jī)制、挖掘與利用功能基因提供遺傳信息基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

產(chǎn)紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)SW-10 由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室分離，已于中國普通微生物菌種保藏中心登記保藏(CGMCC No.20737)。

1.2 基因組DNA 提取

將菌株SW-10 的分生孢子接種至滅菌PDA液體培養(yǎng)基，置于200 r/min、28 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后過濾收集菌絲，無菌水沖洗3 遍后用液氮速凍研磨，采用上海生工生物公司的Ezup 柱式真菌DNA 提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3 測序方法

選取質(zhì)量檢測合格的DNA 用Covaris 打斷，使其片段化，并通過磁珠純化分選目標(biāo)片段；對DNA 片段做末端修復(fù)和3′末端加A，連接測序接頭，并用磁珠純化連接產(chǎn)物。 利用PCR 選擇性地富集兩端連有接頭的DNA 片段，同時擴(kuò)增DNA文庫；隨即利用Picogreen 定量文庫及Agilent Bioanalyzer 2100 對PCR 富集片段進(jìn)行質(zhì)控，隨后通過Illumina NovaSeq 平臺測序。

1.4 基因組拼接

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過接頭污染去除等[15]處理后過濾生成高質(zhì)量Reads 序列。 采用Falcon、CANU 軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼裝，并使用Pilon (v1.18)[16]軟件校正結(jié)果，隨后利用BUSCO(v3.0.2)評估基因組拼裝的完整性。 采用RepeatModler(v1.0.4)和RepeatMasker(v4.0.5)[17]軟件分別進(jìn)行從頭注釋和同源注釋，以完成重復(fù)序列的分析與屏蔽、構(gòu)成與種類統(tǒng)計(jì)。

1.5 蛋白編碼基因預(yù)測

利用 Augustus (v3.03)[18]、 Glimmer HMM(v3.0.1)[19]和Gene Mark-ES(v4.35)[20]三個軟件對菌株SW-10 的基因組序列進(jìn)行從頭預(yù)測；利用Exonerate 軟件(v2.2.0)和近緣物種的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源預(yù)測。 從頭預(yù)測和同源預(yù)測的結(jié)果采用EVidenceModeler 軟件[21]整合，生成菌株SW-10 的預(yù)測結(jié)果。

1.6 基因注釋

蛋白編碼基因的序列比對采用Diamond(v0.9.10.111)軟件來完成，將預(yù)測得到的蛋白編碼基因序列與NR、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot、GO、P450、TCBD 數(shù)據(jù)庫包含的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，序列比對的臨界值選取為10-6。

GO 注釋采用InterPro(v66.0)軟件來完成，將InterPro 注釋得到的結(jié)果對應(yīng)到InterPro2GO 序列ID 當(dāng)中并提取得到GO 號。 GO Slim 注釋結(jié)果采用Map2Slim 完成。 KO 及Pathway 注釋主要采用KEGG 的KAAS(v2.1)自動化注釋系統(tǒng)[22]完成，基因集選擇“For Eukaryotes”，基因KO 判別規(guī)則選取bi-directional best hit(BBH)，注釋完成后將KO 映射到相應(yīng)KEGG Pathway 通路。 KOG 注釋利用eggNOG-mapper 軟件完成，比對數(shù)據(jù)庫為eggNOG(v4.5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組測序與組裝

本研究利用Illumina NovaSeq 測序平臺對菌株SW-10 進(jìn)行全基因組測序，結(jié)果如表1 所示。 菌株SW-10 基因組測序數(shù)據(jù)量總計(jì)4 145 395 200 bp，原始Reads 總數(shù)為27 635 968 個，過濾后獲得27 257 154 個高質(zhì)量Reads，GC 含量為47.10%，K-mer 預(yù)估其基因組大小為29.10 Mb。 SW-10基因組測序數(shù)據(jù)拼裝完成后，共獲得699 個scaffolds，最小序列長度為504 bp，最大序列長度為2 390 315 bp，N50 是551 686 bp。 基因預(yù)測結(jié)果(表2)顯示，SW-10 基因組共有9 195 個蛋白編碼基因，總基因序列長度15 597 887 bp，每個基因平均長度1 696 bp，CDS 平均長度1 554 bp，平均每個基因含3 個外顯子，外顯子平均長度505 bp，內(nèi)含子平均長度68 bp。

表1 產(chǎn)紫青霉菌SW-10 基因組測序與組裝

表2 產(chǎn)紫青霉菌SW-10 基因組基因預(yù)測結(jié)果

2.2 基因功能注釋

通過NCBI 的NR 數(shù)據(jù)庫共注釋到基因9 123個，占預(yù)測基因總數(shù)的99.22%；利用KOG 數(shù)據(jù)庫和KEGG 數(shù)據(jù)庫分別注釋到基因8 817 個和3 878個，分別占預(yù)測基因總數(shù)的95.89%和42.18%；通過SwissProt 數(shù)據(jù)庫共注釋到基因7 026 個，占預(yù)測基因總數(shù)的76.41%；通過GO 數(shù)據(jù)庫共注釋到基因6 608 個，占預(yù)測基因總數(shù)的71.87%；利用P450 數(shù)據(jù)庫和TCDB 數(shù)據(jù)庫分別注釋到基因9 003 個和1 513 個，分別占預(yù)測基因總數(shù)的97.91%和16.45%(圖1)。

圖1 產(chǎn)紫青霉菌SW-10 基因功能注釋數(shù)據(jù)庫分布情況

2.2.1 GO 功能注釋 對菌株SW-10 的基因組利用InterPro 注釋共得到6 608 個基因，按基因功能分為3 大亞類，即生物學(xué)過程47 個分支、分子功能27 個分支和細(xì)胞組分15 個分支(圖2)。 生物學(xué)過程亞類中涉及基因較多的是生物過程和細(xì)胞氮化合物代謝過程，分別為6 044 個(91.46%)和1 712 個(25.91%)；細(xì)胞組分亞類中涉及基因最多的是細(xì)胞過程，達(dá)到2 592 個(39.21%)；分子功能亞類涉及基因較多的是分子功能和離子結(jié)合過程，分別為5 535 個(83.76%)和2 321個(35.12%)。 其中，具有檸檬酸合成酶活性基因5 個，蘋果酸脫氫酶活性基因4 個，堿性磷酸酶活性基因2 個，酸性磷酸酶活性基因15 個，植酸酶活性基因1 個，均參與分子功能過程。

圖2 產(chǎn)紫青霉菌SW-10 基因組GO 功能分類結(jié)果

2.2.2 KEGG 功能注釋 對菌株SW-10 進(jìn)行KEGG Pathway 注釋后發(fā)現(xiàn)能對應(yīng)至代謝通路的基因共3 878 個，富集在52 條代謝通路中(圖3)。涉及基因數(shù)量較多的代謝通路主要有以下7 條:遺傳信息處理代謝通路，共2 420 個基因(62.40%)；信號和細(xì)胞過程通路，共646 個基因(16.66%)；代謝通路，共542 個基因(13.98%)；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，共549 個基因(14.16%)；碳水化合物代謝通路，共474 個基因(12.22%)；氨基酸代謝通路，共430 個基因(11.09%)；運(yùn)輸和分解代謝通路，共377 個基因(9.72%)。 其中，與菌株SW-10 解磷相關(guān)基因包括檸檬酸合成酶基因5個、蘋果酸脫氫酶基因5 個、酸性磷酸酶基因7個、堿性磷酸酶基因2 個和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5 個，主要參與碳水化合物代謝、信號和生物學(xué)過程等代謝通路。

圖3 產(chǎn)紫青霉菌SW-10 基因組KEGG 數(shù)據(jù)庫主要代謝通路分析

2.2.3 KOG 功能注釋 通過eggNOG 數(shù)據(jù)庫對菌株SW-10 進(jìn)行基因注釋及KOG 預(yù)測分類，共注釋到8 817 個基因，分為25 個大類(圖4)。 除功能未知一類外，涉及到基因數(shù)量較多的分別是:碳水化合物運(yùn)輸和代謝類(G)，共691 個基因，占比為7.84%；翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)及分子伴侶類(O)，共493 個基因，占比為5.59%；次級代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝類(Q)，共490 個基因，占比為5.56%；轉(zhuǎn)錄類(K)，共389 個基因，占比為4.41%。 另外，無機(jī)離子運(yùn)輸與代謝類(P)和細(xì)胞壁/膜/包膜生物合成類(M)分別涉及161 個和97 個基因，占比分別為1.83%和1.10%。其中，與菌株SW-10 有機(jī)酸分泌相關(guān)的基因包括檸檬酸合成酶基因5 個和蘋果酸脫氫酶基因4個，參與能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化；與有機(jī)磷礦化水解相關(guān)的基因包括3-植酸酶基因1 個、酸性磷酸酶基因10 個和堿性磷酸酶基因2 個，參與脂質(zhì)代謝與運(yùn)輸、碳水化合物運(yùn)輸和代謝等過程；磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因6 個，參與無機(jī)離子運(yùn)輸與代謝過程。

圖4 產(chǎn)紫青霉菌SW-10 基因組KOG 功能分類結(jié)果

2.3 碳水化合物活性酶基因分析

采用hmmscan 軟件預(yù)測菌株SW-10 基因組序列中存在的CAZy 酶類基因，發(fā)現(xiàn)其中有209個糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GH)基因、86個糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferases，GT)基因、83個碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CE)基因、80 個輔助活性酶(auxiliary activities，AA)基因、12 個碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydratebinding modules，CBM)基因和2 個多糖裂解酶(polysaccharide lyases，PL)基因(圖5)。

圖5 產(chǎn)紫青霉菌SW-10 基因組CAZyme 基因數(shù)目

2.4 解磷及磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因分析

解磷微生物可以通過產(chǎn)生和分泌有機(jī)酸(包括檸檬酸、蘋果酸等)、磷酸酶(包括堿性磷酸酶和酸性磷酸酶)及植酸酶等將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，從而有利于植物對磷的吸收。經(jīng)過蛋白編碼基因的NR 序列比對、KEGG、GO 及KOG 功能分析，本研究發(fā)現(xiàn)了2 個檸檬酸合成酶基因、2 個蘋果酸脫氫酶基因、2 個磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、2 個堿性磷酸酶基因、7 個酸性磷酸酶基因和1 個植酸酶基因，推測其參與了解磷過程(表3)。

表3 產(chǎn)紫青霉菌SW-10 解磷及磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因

3 討論

活化土壤中的難溶性磷、增強(qiáng)土壤有效磷的供給能力對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。 土壤解磷微生物能夠通過酸解、酶解作用等將土壤中無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷供植物吸收利用，從而促進(jìn)植物生長發(fā)育。 解磷微生物改善土壤磷素營養(yǎng)是一項(xiàng)有利于資源節(jié)約、環(huán)境友好的重要農(nóng)業(yè)措施[23]。 本課題組前期從玉米根際土壤中分離出一株產(chǎn)紫青霉菌SW-10，研究發(fā)現(xiàn)該菌株對難溶性無機(jī)磷和有機(jī)磷均具有較好的解磷效果，并且能夠促進(jìn)玉米生長，接種產(chǎn)紫青霉菌后地上部鮮重和干重、根部鮮重和干重以及株高均顯著增加，較對照分別增加36. 33%、37. 93%、31. 20%、31.25%、13.03%，地上部和根部的磷含量分別增加了32.86%和9.77%[24]。 為深入了解該菌株解磷的生物學(xué)特性，挖掘具有促進(jìn)解磷的功能基因，本研究利用Illumina NovaSeq 測序平臺獲得菌株SW-10 的全基因組序列，確定了該菌株的基因組大小為29.10 Mb，與已報(bào)道的煙曲霉、構(gòu)巢曲霉等基因組大小相近[25]；同時將菌株SW-10 基因組測序數(shù)據(jù)在NR、GO、KEGG、eggNOG 等數(shù)據(jù)庫比對分析，在分子生物學(xué)層面揭示其解磷過程中可能涉及到的基因及代謝通路。

解磷真菌可通過產(chǎn)生蘋果酸、檸檬酸等有機(jī)酸促進(jìn)難溶性無機(jī)磷的磷酸根離子釋放[26]。Cunningham 等[27]發(fā)現(xiàn)比萊青霉在溶解磷酸鈣時產(chǎn)生大量草酸和檸檬酸等有機(jī)酸。 唐超西等[28]自黑曲霉H1 獲得解磷基因psgA和psgB，均能促進(jìn)甲酸、乙酸和蘋果酸的合成，同時分別可以誘導(dǎo)合成α-酮戊二酸和檸檬酸。 Lü 等[29]研究發(fā)現(xiàn)將一株草酸青霉的蘋果酸脫氫酶mMDH基因?qū)氪竽c桿菌后能夠有效提高大腸桿菌的解磷能力。 本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫青霉菌SW-10 基因組具有2 個檸檬酸合成酶基因和2 個蘋果酸脫氫酶基因，表明其對難溶性無機(jī)磷具有降解潛力。

解磷真菌也可通過分泌磷酸酶、植酸酶等加快有機(jī)磷礦化過程。 Yadav 等[30]研究發(fā)現(xiàn)解磷真菌在溶解有機(jī)磷時其分泌的植酸酶和磷酸酶活性分別可達(dá)19.9EU 和0.29EU；吳靜[31]發(fā)現(xiàn)黑曲霉N-2 含有植酸酶基因phyA，能夠促進(jìn)真菌快速分泌植酸酶并提高植酸酶活性，進(jìn)而加快植酸鈣溶解。 本研究發(fā)現(xiàn)菌株SW-10 含有2 個堿性磷酸酶基因、7 個酸性磷酸酶基因和1 個植酸酶基因，說明該菌株能夠通過分泌植酸酶和磷酸酶等多種途徑礦化土壤中難溶性有機(jī)磷，增加土壤磷的有效性，進(jìn)而促進(jìn)作物對養(yǎng)分的吸收。

研究表明，碳水化合物活性酶(CAZymes)與抑菌作用相關(guān)[32]。 本研究通過hmmscan 軟件預(yù)測到菌株SW-10 中與碳水化合物活性酶相關(guān)基因共計(jì)460 個，包括糖苷水解酶(GH)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)、碳水化合物酯酶(CE)、輔助活性酶(AA)、多糖裂解酶(PL)五類碳水化合物活性酶基因，這與Mardones 等[33]報(bào)道產(chǎn)紫青霉Penicillium purpurogenum具有大量的木質(zhì)纖維素降解酶相一致。 另外，Echeverría 等[34]從Penicillium purpurogenum基因組中鑒定出糖苷水解酶基因(XynD)，表明菌株SW-10 可能具有較好的細(xì)胞壁水解酶活性，可用于木質(zhì)纖維素的降解過程。

4 結(jié)論

本研究采用Illumina NovaSeq 測序平臺對解磷真菌產(chǎn)紫青霉菌SW-10 進(jìn)行全基因組測序，得到菌株的基因組大小為29.10 Mb。 通過在NR、GO、KEGG、KOG 及Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)其含有2 個檸檬酸合成酶基因、2 個蘋果酸脫氫酶基因、2 個磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、2 個堿性磷酸酶基因、7 個酸性磷酸酶基因和1 個植酸酶基因，從基因角度證實(shí)了菌株SW-10 具有較強(qiáng)的解磷能力；同時，預(yù)測菌株SW-10 基因組含有碳水化合物活性酶相關(guān)基因460 個，推測其具有較好的細(xì)胞壁水解酶活性。 本研究可為揭示產(chǎn)紫青霉菌的解磷分子機(jī)制、推動其在生物解磷方面的進(jìn)一步開發(fā)利用及改良其遺傳信息提供理論基礎(chǔ)。