楊春，孟澤洪，李帥，沈強(qiáng)，張小琴，陳正武

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州貴陽 550006)

茶葉作為重要的采葉類經(jīng)濟(jì)作物，蟲害的發(fā)生嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。 綠盲蝽(Apolygus lucorum)屬半翅目盲蝽科，是棗、茶樹、葡萄、棉花、桃等多種經(jīng)濟(jì)作物上的多發(fā)害蟲[1-5]。 不同于茶小綠葉蟬、茶棍薊馬等其他茶樹刺吸性害蟲，綠盲蝽屬細(xì)胞取食者，取食后茶樹嫩梢破損嚴(yán)重幾無可利用價(jià)值，嚴(yán)重?fù)p害茶葉產(chǎn)量及品質(zhì)。 綠盲蝽在貴州[6]、江蘇[7]、山東[8]、湖北[9]等茶區(qū)已發(fā)展成為春茶期間頭號(hào)害蟲。

在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中，植物面對(duì)植食性昆蟲的持續(xù)侵?jǐn)_演化出一套有效的誘導(dǎo)防御體系，防御保護(hù)酶活性變化是植物誘導(dǎo)防御反應(yīng)的重要體現(xiàn)。 如南美斑潛蠅幼蟲和蚜蟲取食黃瓜葉片后，過氧化物酶(POD) 、苯丙氨酸解氨酶(PAL) 、超氧化物歧化酶(SOD) 等保護(hù)酶活性顯著升高[10-11]。 茶角盲蝽取食后，茶樹葉片中多酚氧化酶(PPO)、POD 和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性升高[12]。 何應(yīng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)毛花雀稗在蝗蟲取食脅迫下能激發(fā)POD 和過氧化氫酶(CAT)積極參與防御反應(yīng)，以維持正常代謝。 可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和內(nèi)源茉莉酸甲酯等發(fā)生變化同樣是植物誘導(dǎo)防御機(jī)制的具體表現(xiàn)[14-16]。

隨著綠盲蝽為害范圍的擴(kuò)大，茶樹上綠盲蝽為害的報(bào)道增多，但較少涉及茶樹自身應(yīng)對(duì)綠盲蝽取食為害的生理生化變化。 因此，本研究以綠盲蝽取食為害不同程度的茶樹葉片為研究對(duì)象，通過探索初級(jí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白)、防御酶(PPO、PAL、POD、CAT 等)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸、丙二醛)及防御信號(hào)因子(水楊酸甲酯、茉莉酸甲酯)的變化，研究茶樹對(duì)綠盲蝽不同程度取食為害的防御應(yīng)答，這對(duì)于進(jìn)一步研究綠盲蝽與茶樹的互作關(guān)系、實(shí)現(xiàn)茶園綠盲蝽的高效防控有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茶品種為‘苔選0310’，來自貴州省茶葉研究所貴陽茶樹種質(zhì)資源圃。 參考張輝[17]、陳嘉靜[18]等的取樣方法，于2022 年4 月下旬綠盲蝽為害盛期，依據(jù)葉片受害面積占總面積的百分比，田間采集4 級(jí)受害程度的芽下第二葉作為供試材料(圖1)。 0 級(jí)，葉片完整未受害；1 級(jí)為輕度受害，受害面積占葉片總面積的1%～30%；2 級(jí)為中度受害，受害面積占葉片總面積的31%～60%；3級(jí)為重度受害，受害面積占葉片總面積的61%以上。 葉片采集后放入液氮速凍，再轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存，待測(cè)。

圖1 綠盲蝽為害不同程度葉片

1.2 儀器及試劑

儀器:UV-2600 分光光度計(jì)；Agilent A1100高效液相色譜儀；BioTek Epoch2 酶標(biāo)儀。

標(biāo)準(zhǔn)品:茉莉酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉，純度≥98%)、水楊酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(上海阿拉丁，純度≥99.5%)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 初級(jí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的測(cè)定 可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[19]，可溶性蛋白含量測(cè)定采用BCA 法[20]。

1.3.2 防御酶活性測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、脂氧合酶(LOX)活性均按照試劑盒方法測(cè)定。 試劑盒購自蘇州夢(mèng)犀生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3.3 脯氨酸和丙二醛含量測(cè)定 脯氨酸(PRO)含量測(cè)定采用磺基水楊酸法[21]，丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[22]。

1.3.4 水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯含量測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定茶樹葉片中水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯含量，其中水楊酸甲酯含量測(cè)定參照徐建白等[23]的方法，茉莉酸甲酯含量測(cè)定參照呂桂珍等[24]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SPSS 21.0 進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用Origin 2021繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠盲蝽不同為害程度茶樹葉片中初級(jí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較

由圖2 可知，不同受害程度的茶樹葉片中可溶性糖和可溶性蛋白含量存在一定差異。 可溶性糖含量隨綠盲蝽取食程度的加深呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，輕度受害的葉片中可溶性糖含量最高，中度受害葉片中可溶性糖含量最低，輕度和重度受害葉片中可溶性糖含量與健康和中度受害葉片存在顯著差異(P＜0.05)。 可溶性蛋白含量隨著受害程度的增加而逐漸降低，健康葉片中可溶性蛋白含量極顯著高于受害葉片(P＜0.01)，三種程度受害葉片中可溶性蛋白含量不存在極顯著差異，但重度受害葉片中可溶性蛋白含量顯著低于輕度受害葉片。

圖2 不同綠盲蝽為害程度葉片中可溶性糖和可溶性蛋白含量比較

2.2 綠盲蝽為害對(duì)防御酶活性的影響

由表1 可知，茶樹葉片中POD、CAT 和PPO的活性均隨著綠盲蝽危害程度加深而升高。 健康葉片中POD 活性為108.71 U/g，輕度和中度受害葉片中POD 活性分別為129.87 U/g 和152.69 U/g，重度受害葉片中POD 活性達(dá)283.93 U/g。健康和輕度受害葉片中PPO 活性在10 U/g 左右，且不存在顯著差異；中度受害葉片中PPO 活性為20.16 U/g，極顯著高于健康和輕度受害葉片；重度受害時(shí)PPO 活性升至82.92 U/g。 健康葉片中CAT 活性為187.57 μmol/(min·g)，輕度受害葉片中CAT 活性達(dá)320.05 μmol/(min·g)，中度和重度受害葉片中CAT 活性略有升高，分別為358.94、376.77 μmol/(min·g)。 可以看出，CAT對(duì)綠盲蝽取食脅迫的反應(yīng)更為快速，輕度受害下CAT 活性便迅速升高；POD 和PPO 同樣在應(yīng)對(duì)綠盲蝽取食脅迫時(shí)積極響應(yīng)，在重度受害時(shí)兩者活性大幅升高。

表1 不同綠盲蝽為害程度葉片中防御酶活性比較

PAL 和GR 活性均隨著綠盲蝽危害程度的加深呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì):健康葉片中PAL 和GR 活性最高，在綠盲蝽取食脅迫下活性下降，中度受害時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，到重度受害時(shí)略有回高。其中GR 活性下降幅度較大，健康葉片中GR 活性為1 018.50 nmol/(min·g)，受害葉片中GR 活性僅為健康葉片的46.1%(中度受害) ～56.1%(重度受害)。

LOX 和APX 活性變化相似，均為先升高后下降再升高的趨勢(shì):輕度受害時(shí)LOX 和APX 活性最高，LOX 活性在健康葉片中最低，APX 活性在中度受害時(shí)最低。 綠盲蝽取食脅迫對(duì)茶樹葉片中SOD 活性影響較小，健康葉片和輕度受害葉片中SOD 活性顯著高于中度和重度受害葉片。

2.3 綠盲蝽不同為害程度茶樹葉片中脯氨酸和丙二醛含量比較

由圖3 可知，在不同程度的綠盲蝽取食脅迫下，茶樹葉片中PRO 含量隨受害程度的加深而升高，健康葉片中PRO 含量為10.53 μg/g，極顯著低于受害葉片中PRO 含量；輕度和中度受害葉片中PRO 含量分別是15.93 μg/g 和17.32 μg/g，兩者間差異不顯著；重度受害葉片中PRO 含量為22.47 μg/g，極顯著高于其他受害程度葉片。MDA 含量變化不大，健康及各種受害葉片中MDA 含量均在38.0 nmol/g 上下。

圖3 不同綠盲蝽為害程度葉片中脯氨酸和丙二醛含量比較

2.4 綠盲蝽不同為害程度茶樹葉片中水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯含量比較

綠盲蝽為害使茶樹葉片中水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯的含量發(fā)生變化(圖4)。 其中，水楊酸甲酯含量隨受害程度加深而不斷降低，健康葉片中水楊酸甲酯含量最高，為2.48 μg/g，極顯著高于綠盲蝽取食后的茶樹葉片；綠盲蝽為害后，葉片中水楊酸甲酯含量迅速下降，降幅達(dá)50%以上，重度受害葉片中水楊酸甲酯含量?jī)H為健康葉片的38.3%。 茶樹葉片中茉莉酸甲酯含量的變化存在先降低后升高的趨勢(shì)，輕度受害葉片中茉莉酸甲酯含量最低，后隨著受害程度的加深茉莉酸甲酯含量回升，中度受害葉片中茉莉酸甲酯含量與健康葉片、重度葉片間無顯著差異。

圖4 不同綠盲蝽為害程度葉片中水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯含量比較

3 討論

植物所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是植食性昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育能量的來源，害蟲取食前后植物中可溶性糖和可溶性蛋白等初級(jí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化可作為植物抗蟲性研究的生理生化指標(biāo)之一[25]。 本研究發(fā)現(xiàn)，綠盲蝽取食后的葉片可溶性蛋白含量均極顯著低于健康葉片，且隨著葉片受害程度的增加呈下降趨勢(shì)。這與茍長(zhǎng)青[26]、竇玲玲[27]等的研究結(jié)果一致，即植物通過降低可溶性蛋白含量來應(yīng)對(duì)害蟲取食為害。

植物在遭受害蟲取食、病菌侵染等生物脅迫時(shí)，可通過主動(dòng)積累代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)滲透來抵抗脅迫，而脯氨酸是植物細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[28]。 本研究發(fā)現(xiàn)綠盲蝽取食脅迫越嚴(yán)重，茶樹葉片中脯氨酸含量越高。 結(jié)合可溶性蛋白的變化，推測(cè)茶樹在遭受綠盲蝽取食脅迫后，通過降低蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、增加脯氨酸等代謝產(chǎn)物含量來調(diào)節(jié)滲透進(jìn)而抵御傷害。

植物遭受害蟲取食脅迫后存在一定的誘導(dǎo)抗性，主要方式是通過提高抗氧化酶活性，清除植物體內(nèi)多余氧化自由基，維持ROS 平衡，從而減少害蟲取食對(duì)植株造成的傷害。 SOD、CAT、POD、APX 和GR 等抗氧化酶在穩(wěn)定植物ROS 系統(tǒng)、構(gòu)建植物防御體系中起到重要作用。 李林懋等[29]研究發(fā)現(xiàn)，POD 在冬棗防御系統(tǒng)中起主要作用，其活性變化與綠盲蝽為害程度之間相關(guān)性最為顯著。 Gao 等[30]研究同樣發(fā)現(xiàn)POD 積極參與葡萄葉片對(duì)綠盲蝽的防御反應(yīng)，其活性隨綠盲蝽為害持續(xù)時(shí)間增加而不斷升高。 賈尊尊等[31]研究發(fā)現(xiàn)，CAT 積極參與棉花對(duì)煙粉虱的防御反應(yīng)，其活性隨煙粉虱取食為害加重而不斷升高。 本研究中，CAT 和POD 積極參與茶樹對(duì)綠盲蝽的防御反應(yīng)，兩者活性隨受害程度加深不斷升高，其中CAT 對(duì)綠盲蝽取食脅迫的反應(yīng)更為快速，在綠盲蝽輕度取食后其活性便迅速升高。

PAL、LOX 和PPO 積極參與JA 和SA 循環(huán)代謝途徑，進(jìn)而參與植物誘導(dǎo)抗性，在辣椒、番茄抵御桃蚜和玉米抵御蚜蟲取食的防御反應(yīng)中起著積極作用[32-33]。 前人研究發(fā)現(xiàn)，PAL、LOX 和PPO在參與植物防御體系時(shí)反應(yīng)不一，PPO 對(duì)蟲害取食反應(yīng)較快，活性不斷升高，重度受害下活性激增[34]；LOX 活性的上升速度快，達(dá)到峰值后活性下降[35]；PAL 活性下降但變化相對(duì)穩(wěn)定[13]。 本研究與前人研究結(jié)果相對(duì)一致，PPO 在茶樹應(yīng)對(duì)綠盲蝽取食脅迫中起著積極作用，隨綠盲蝽為害程度加深PPO 活性不斷升高，且綠盲蝽重度為害下PPO 活性激增；LOX 活性在綠盲蝽輕度為害時(shí)達(dá)到峰值，然后活性下降；PAL 活性變化相對(duì)穩(wěn)定，受害葉片中PAL 活性略有下降。

水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯是植物系統(tǒng)獲得性抗性的關(guān)鍵信號(hào)因子[36-38]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，綠盲蝽為害程度越重的茶樹品種，葉片中檢測(cè)到的揮發(fā)性水楊酸甲酯含量越高[6]。 本研究中綠盲蝽取食越嚴(yán)重的葉片中非揮發(fā)性的水楊酸甲酯含量越少，結(jié)合前期研究結(jié)果推測(cè)，綠盲蝽取食導(dǎo)致茶樹葉片細(xì)胞破碎，細(xì)胞中的水楊酸甲酯以揮發(fā)物的形式迅速釋出，并隨著受害程度加深釋放量加大，釋放出的水楊酸甲酯通過趨避害蟲或引誘天敵從而起到抗蟲作用。 茉莉酸甲酯作為一種常見的信號(hào)物質(zhì)存在于植物體內(nèi)，具有誘導(dǎo)植物抵御害蟲的能力[39]。 本研究發(fā)現(xiàn)，在綠盲蝽取食脅迫下，茶樹葉片中茉莉酸甲酯含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。 可能的原因是，輕度受害時(shí)，茶樹葉片細(xì)胞中存儲(chǔ)的茉莉酸甲酯以揮發(fā)物的形式迅速釋放，而在受害程度加深后，茶樹加快合成茉莉酸甲酯，積極參與綠盲蝽的防御反應(yīng)。

4 結(jié)論

茶樹在受到綠盲蝽取食為害后，葉片中可溶性蛋白、脯氨酸、水楊酸甲酯、茉莉酸甲酯及多酚氧化酶等防御酶均有所變化。 與健康葉片相比，綠盲蝽取食為害后的葉片中脯氨酸含量、PPO 活性、CAT 活性和POD 活性均不同程度升高，表明茶樹在面對(duì)綠盲蝽取食脅迫時(shí)，通過調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)和防御酶活性積極地進(jìn)行防御。 水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯參與防御綠盲蝽的作用機(jī)理需開展進(jìn)一步研究。