薛德星，李美，孫作文，李紀(jì)順，扈進(jìn)冬，高興祥，李健

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東濟(jì)南 250100；2. 山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心植物保護(hù)部，山東濟(jì)南 250100；3. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生態(tài)研究所，山東濟(jì)南 250103)

鏈格孢屬(Alternaria)和炭疽菌屬(Colletotrichum)病原真菌種類繁多，地理分布廣泛，可侵害各種農(nóng)作物，對(duì)全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[1]。鏈格孢屬病原菌感染南瓜、甜瓜、西葫蘆、黃瓜等瓜類植物引起葉斑病[1-2]。 蕓薹鏈格孢(Alternar-ia brassicae)是全球性植物病原菌，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，能夠快速引起十字花科蔬菜黑斑病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。 近年來，草莓炭疽病危害日趨嚴(yán)重，其致死率一般在10%～20%，嚴(yán)重可達(dá)80%以上，對(duì)我國(guó)草莓產(chǎn)業(yè)造成巨大危害[5]。 化學(xué)藥劑可以很好地防治病菌感染，但長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成環(huán)境污染，且農(nóng)藥殘留影響人類身體健康[6]。 生物防治是利用微生物之間的拮抗、競(jìng)爭(zhēng)等方式阻礙病原微生物繁殖，改善土壤理化性質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗病性[7-8]，具有安全、有效和持久的特點(diǎn)，可以更好地防治植物病蟲害[9]。

應(yīng)用于植物病害的生防細(xì)菌、真菌、放線菌等多種菌劑相繼被開發(fā)，并取得了良好的生防效果[10]。 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種常見的產(chǎn)芽孢桿狀細(xì)菌，廣泛存在于土壤和植物表面，對(duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境，具有很強(qiáng)的抗逆能力[11-12]，能產(chǎn)生多種抗菌素和抗菌酶，對(duì)植物病原菌具有廣譜抗性，已成為重要的生防菌之一[13-14]。 目前，枯草芽孢桿菌已經(jīng)應(yīng)用在小麥、玉米、大豆、花生、番茄、辣椒、蘋果等多種作物上，并取得理想的生防效果[14-15]。 本研究從土壤中分離篩選到一株芽孢桿菌KC1723，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析和16S rDNA 基因鑒定，確定為枯草芽孢桿菌，并通過抑菌試驗(yàn)研究其對(duì)炭疽菌、鏈格孢菌的抑菌效果，以期為其生防制劑的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

菌株KC1723:分離自濟(jì)南地區(qū)土壤樣本。

供試病原菌:暹羅炭疽菌(Colletotrichum siamense)、平頭炭疽菌(C. truncatum)、鏈格孢菌(Alternaria burnsii)，均為山東省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心分離保存。

1.2 主要儀器和試劑

紫外透射反射分析儀，上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司；PCR 儀，北京宏達(dá)恒業(yè)科技有限公司；電熱恒溫水槽，浙江恒岳儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；高速離心機(jī)，山東德瑞克儀器股份有限公司。 細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LB 培養(yǎng)基)，每升去離子水中加入酵母提取物5 g、胰化蛋白胨10 g、氯化鈉10 g，用NaOH 調(diào)pH 至7.0，121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的分離篩選 稱取5 g 土壤樣品，加入裝有45 mL 無菌水的三角瓶中，充分振蕩混勻，85 ℃水浴20 min，制成土壤懸液。 吸取1 mL 上層液，加入裝有9 mL 無菌水的試管中，10 倍梯度稀釋至10-2、10-3和10-4；分別吸取0.5 mL，均勻涂布在LB 培養(yǎng)基平板上，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d。

1.4.2 菌株鑒定 形態(tài)特征觀察:挑取生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌落接種到LB 培養(yǎng)基平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的形態(tài)特征。

生理生化特性分析:挑取單菌落培養(yǎng)5 d 后進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，包括葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、過氧化物酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)[15]。

分子生物學(xué)鑒定[16]:采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA。 基于16S rDNA 基因設(shè)計(jì)上、下游引物，分別為27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。 PCR 反應(yīng)體系(50 μL):模板DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×LA Taq MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃10 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min 。 PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4.3 芽孢桿菌生理生物學(xué)特征研究 pH 值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響:將LB 培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)為4、5、6、7、8、9 和10，121℃滅菌20 min 后，按照1∶20體積比接種活化的菌液，30 ℃恒溫培養(yǎng)，每小時(shí)測(cè)菌株生長(zhǎng)變化情況。

熱處理對(duì)菌株活性的影響:挑取芽孢桿菌單菌落接入LB 液體培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h。 芽孢桿菌樣品分別在25、40、55、70、85、100 ℃水浴中處理20 min，采用10 倍梯度稀釋法依次稀釋，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

菌株的抑菌作用:采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，以暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌為靶標(biāo)菌，測(cè)定菌株的抑菌能力。 每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，記錄病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率[17]。 抑菌率(%) ＝ (對(duì)照平均直徑-處理平均直徑)/對(duì)照平均直徑×100。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan’s 法(P＜0.05)。 將16S rDNA 基因測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌KC1723 形態(tài)特征

經(jīng)分離篩選，從濟(jì)南地區(qū)土壤中得到一株芽孢桿菌，定名為KC1723。 在LB 培養(yǎng)基上30 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，菌落邊緣呈不規(guī)則齒形，表面突起有皺紋，菌落顏色為白色(圖1A)。 在顯微鏡下，菌株KC1723 呈桿狀，產(chǎn)生橢圓形芽孢，芽孢位于細(xì)胞中部附近。 革蘭氏染色為陽(yáng)性(圖1B)

圖1 菌株KC1723 菌落形態(tài)(A)及染色情況(B)

2.2 芽孢桿菌KC1723 的生理生化特征

對(duì)菌株KC1723 進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、過氧化物酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、耐鹽試驗(yàn)共10 項(xiàng)常規(guī)生化試驗(yàn)，結(jié)果表明，菌株KC1723 生理生化反應(yīng)與枯草芽孢桿菌相同(表1)。

表1 菌株KC1723 的生理生化特征

2.3 芽孢桿菌KC1723 16S rDNA 基因序列分析

擴(kuò)增的菌株KC1723 16S rDNA 片段長(zhǎng)度為1 466 bp，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示菌株KC1723 與枯草芽孢桿菌聚為一支，同源性為99.39%(圖2)。

圖2 菌株KC1723 的系統(tǒng)發(fā)育樹

通過上述形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA 基因序列分析，將菌株KC1723 鑒定為枯草芽孢桿菌。 保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(編號(hào)CGMCC No. 24397)。

2.4 不同pH 值和培養(yǎng)基對(duì)菌株KC1723 生長(zhǎng)的影響

菌株KC1723 生長(zhǎng)的適宜pH 值在6.0 ～8.0之間，最適pH 為7.0。 隨培養(yǎng)基pH 值升高或降低，菌落生長(zhǎng)速度明顯減慢(圖3)。

圖3 不同pH 值對(duì)菌株KC1723 生長(zhǎng)的影響

2.5 溫度對(duì)菌株KC1723 的影響

由圖4 可知，40 ℃處理20 min 后，細(xì)胞數(shù)量為1.07×109cfu/mL，隨著溫度提高，細(xì)胞數(shù)量逐漸降低。 100 ℃時(shí)仍有398 cfu/mL 細(xì)胞存活，表明菌株可以很好地耐高溫。

圖4 不同溫度對(duì)菌株KC1723 的影響

2.6 菌株KC1723 的抑菌作用

平板對(duì)峙試驗(yàn)表明，KC1723 對(duì)供試3 種病原菌都有較好的抑菌作用，抑菌率分別為68.3%、66.7%、48.9%，其中對(duì)暹羅炭疽菌抑菌效果最好(表2)。

表2 菌株KC1723 對(duì)3 種病原菌的拮抗效果

3 討論與結(jié)論

通過細(xì)菌形態(tài)特征、革蘭氏染色鏡檢結(jié)果以及生理生化鑒定，菌株KC1723 與枯草芽孢桿菌的形態(tài)及生化特征極為相似；測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果進(jìn)一步確定菌株KC1723 為枯草芽孢桿菌。KC1723 生長(zhǎng)適宜pH 值為6.0～8.0，最適pH 值為7.0；在10% NaCl 培養(yǎng)液中可以生長(zhǎng)；100 ℃處理20 min 仍有 KC1723 菌株存活。 表明菌株KC1723 具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，能夠在惡劣的生態(tài)環(huán)境下存活并繁殖，有利于生防菌開發(fā)。

利用微生物防治植物病害具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。 篩選和鑒定有生防潛力的微生物極為關(guān)鍵[9]。 前人研究表明，利用枯草芽孢桿菌防治植物病害具有巨大研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力[18]。經(jīng)枯草芽孢桿菌處理后，尖孢鐮刀菌古巴專化型、灰葡萄孢、茄病鐮刀菌、大麗輪枝菌、麥根腐平臍蠕孢、尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)受到顯著抑制，PDA培養(yǎng)基上均形成明顯的抑菌圈[7]。 本試驗(yàn)通過平板對(duì)峙培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)菌株KC1723 對(duì)暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌有較好的抑菌效果，特別對(duì)暹羅炭疽菌抑菌率達(dá)到68.3%，表明菌株KC1723 對(duì)由暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌引起的花生炭疽病、大白菜炭疽病和辣椒灰葉斑病具有很好的生防潛力。

本試驗(yàn)分離、篩選并鑒定了一株枯草芽孢桿菌KC1723，并對(duì)其培養(yǎng)條件和抑菌效果進(jìn)行了研究。 為了更好地應(yīng)用生防菌KC1723，下一步將提取其抗菌活性產(chǎn)物，解析抑菌機(jī)理以及開展田間防效研究和評(píng)估。