薛德星,李美,孫作文,李紀順,扈進冬,高興祥,李健
(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,山東濟南 250100;2. 山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心植物保護部,山東濟南 250100;3. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生態(tài)研究所,山東濟南 250103)
鏈格孢屬(Alternaria)和炭疽菌屬(Colletotrichum)病原真菌種類繁多,地理分布廣泛,可侵害各種農(nóng)作物,對全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重威脅[1]。鏈格孢屬病原菌感染南瓜、甜瓜、西葫蘆、黃瓜等瓜類植物引起葉斑病[1-2]。 蕓薹鏈格孢(Alternar-ia brassicae)是全球性植物病原菌,具有很強的環(huán)境適應(yīng)性,能夠快速引起十字花科蔬菜黑斑病,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失[3-4]。 近年來,草莓炭疽病危害日趨嚴重,其致死率一般在10%~20%,嚴重可達80%以上,對我國草莓產(chǎn)業(yè)造成巨大危害[5]。 化學(xué)藥劑可以很好地防治病菌感染,但長期大量使用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性,造成環(huán)境污染,且農(nóng)藥殘留影響人類身體健康[6]。 生物防治是利用微生物之間的拮抗、競爭等方式阻礙病原微生物繁殖,改善土壤理化性質(zhì),促進植物生長,提高植物抗病性[7-8],具有安全、有效和持久的特點,可以更好地防治植物病蟲害[9]。
應(yīng)用于植物病害的生防細菌、真菌、放線菌等多種菌劑相繼被開發(fā),并取得了良好的生防效果[10]。 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種常見的產(chǎn)芽孢桿狀細菌,廣泛存在于土壤和植物表面,對人畜無毒無害,不污染環(huán)境,具有很強的抗逆能力[11-12],能產(chǎn)生多種抗菌素和抗菌酶,對植物病原菌具有廣譜抗性,已成為重要的生防菌之一[13-14]。 目前,枯草芽孢桿菌已經(jīng)應(yīng)用在小麥、玉米、大豆、花生、番茄、辣椒、蘋果等多種作物上,并取得理想的生防效果[14-15]。 本研究從土壤中分離篩選到一株芽孢桿菌KC1723,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征分析和16S rDNA 基因鑒定,確定為枯草芽孢桿菌,并通過抑菌試驗研究其對炭疽菌、鏈格孢菌的抑菌效果,以期為其生防制劑的開發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
菌株KC1723:分離自濟南地區(qū)土壤樣本。
供試病原菌:暹羅炭疽菌(Colletotrichum siamense)、平頭炭疽菌(C. truncatum)、鏈格孢菌(Alternaria burnsii),均為山東省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心分離保存。
紫外透射反射分析儀,上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司;PCR 儀,北京宏達恒業(yè)科技有限公司;電熱恒溫水槽,浙江恒岳儀器有限公司;紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;高速離心機,山東德瑞克儀器股份有限公司。 細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒,上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;其他常用試劑為國產(chǎn)分析純試劑。
細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LB 培養(yǎng)基),每升去離子水中加入酵母提取物5 g、胰化蛋白胨10 g、氯化鈉10 g,用NaOH 調(diào)pH 至7.0,121 ℃下高壓滅菌20 min。
1.4.1 菌株的分離篩選 稱取5 g 土壤樣品,加入裝有45 mL 無菌水的三角瓶中,充分振蕩混勻,85 ℃水浴20 min,制成土壤懸液。 吸取1 mL 上層液,加入裝有9 mL 無菌水的試管中,10 倍梯度稀釋至10-2、10-3和10-4;分別吸取0.5 mL,均勻涂布在LB 培養(yǎng)基平板上,倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1~2 d。
1.4.2 菌株鑒定 形態(tài)特征觀察:挑取生長優(yōu)勢菌落接種到LB 培養(yǎng)基平板上,30 ℃倒置培養(yǎng)1~2 d,觀察菌落生長情況,同時進行革蘭氏染色,利用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的形態(tài)特征。
生理生化特性分析:挑取單菌落培養(yǎng)5 d 后進行鑒定試驗,包括葡萄糖發(fā)酵試驗、蔗糖發(fā)酵試驗、乳糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、VP 試驗、檸檬酸鹽試驗、過氧化物酶試驗、硝酸鹽還原試驗、耐鹽性試驗[15]。
分子生物學(xué)鑒定[16]:采用細菌DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA。 基于16S rDNA 基因設(shè)計上、下游引物,分別為27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。 PCR 反應(yīng)體系(50 μL):模板DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,2×LA Taq MasterMix 25 μL,ddH2O 19 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃10 min;95 ℃30 s,57 ℃30 s,72 ℃2 min,35 個循環(huán);72 ℃10 min 。 PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。
1.4.3 芽孢桿菌生理生物學(xué)特征研究 pH 值對菌株生長的影響:將LB 培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)為4、5、6、7、8、9 和10,121℃滅菌20 min 后,按照1∶20體積比接種活化的菌液,30 ℃恒溫培養(yǎng),每小時測菌株生長變化情況。
熱處理對菌株活性的影響:挑取芽孢桿菌單菌落接入LB 液體培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h。 芽孢桿菌樣品分別在25、40、55、70、85、100 ℃水浴中處理20 min,采用10 倍梯度稀釋法依次稀釋,進行平板菌落計數(shù)。
菌株的抑菌作用:采用平板對峙培養(yǎng)法,以暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌為靶標菌,測定菌株的抑菌能力。 每組設(shè)3 個重復(fù),記錄病原菌菌落直徑,計算抑菌率[17]。 抑菌率(%) = (對照平均直徑-處理平均直徑)/對照平均直徑×100。
試驗所得數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0 軟件進行方差分析,多重比較采用Duncan’s 法(P<0.05)。 將16S rDNA 基因測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對,利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
經(jīng)分離篩選,從濟南地區(qū)土壤中得到一株芽孢桿菌,定名為KC1723。 在LB 培養(yǎng)基上30 ℃恒溫培養(yǎng)36 h,菌落邊緣呈不規(guī)則齒形,表面突起有皺紋,菌落顏色為白色(圖1A)。 在顯微鏡下,菌株KC1723 呈桿狀,產(chǎn)生橢圓形芽孢,芽孢位于細胞中部附近。 革蘭氏染色為陽性(圖1B)
圖1 菌株KC1723 菌落形態(tài)(A)及染色情況(B)
對菌株KC1723 進行葡萄糖發(fā)酵試驗、蔗糖發(fā)酵試驗、乳糖發(fā)酵試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、VP 試驗、硝酸鹽還原試驗、過氧化物酶試驗、檸檬酸鹽試驗、耐鹽試驗共10 項常規(guī)生化試驗,結(jié)果表明,菌株KC1723 生理生化反應(yīng)與枯草芽孢桿菌相同(表1)。
表1 菌株KC1723 的生理生化特征
擴增的菌株KC1723 16S rDNA 片段長度為1 466 bp,系統(tǒng)進化樹顯示菌株KC1723 與枯草芽孢桿菌聚為一支,同源性為99.39%(圖2)。
圖2 菌株KC1723 的系統(tǒng)發(fā)育樹
通過上述形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA 基因序列分析,將菌株KC1723 鑒定為枯草芽孢桿菌。 保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(編號CGMCC No. 24397)。
菌株KC1723 生長的適宜pH 值在6.0 ~8.0之間,最適pH 為7.0。 隨培養(yǎng)基pH 值升高或降低,菌落生長速度明顯減慢(圖3)。
圖3 不同pH 值對菌株KC1723 生長的影響
由圖4 可知,40 ℃處理20 min 后,細胞數(shù)量為1.07×109cfu/mL,隨著溫度提高,細胞數(shù)量逐漸降低。 100 ℃時仍有398 cfu/mL 細胞存活,表明菌株可以很好地耐高溫。
圖4 不同溫度對菌株KC1723 的影響
平板對峙試驗表明,KC1723 對供試3 種病原菌都有較好的抑菌作用,抑菌率分別為68.3%、66.7%、48.9%,其中對暹羅炭疽菌抑菌效果最好(表2)。
表2 菌株KC1723 對3 種病原菌的拮抗效果
通過細菌形態(tài)特征、革蘭氏染色鏡檢結(jié)果以及生理生化鑒定,菌株KC1723 與枯草芽孢桿菌的形態(tài)及生化特征極為相似;測序及系統(tǒng)進化樹結(jié)果進一步確定菌株KC1723 為枯草芽孢桿菌。KC1723 生長適宜pH 值為6.0~8.0,最適pH 值為7.0;在10% NaCl 培養(yǎng)液中可以生長;100 ℃處理20 min 仍有 KC1723 菌株存活。 表明菌株KC1723 具有很強的環(huán)境適應(yīng)能力,能夠在惡劣的生態(tài)環(huán)境下存活并繁殖,有利于生防菌開發(fā)。
利用微生物防治植物病害具有重要的研究價值和應(yīng)用前景。 篩選和鑒定有生防潛力的微生物極為關(guān)鍵[9]。 前人研究表明,利用枯草芽孢桿菌防治植物病害具有巨大研究價值和應(yīng)用潛力[18]。經(jīng)枯草芽孢桿菌處理后,尖孢鐮刀菌古巴?;?、灰葡萄孢、茄病鐮刀菌、大麗輪枝菌、麥根腐平臍蠕孢、尖孢鐮刀菌的菌絲生長受到顯著抑制,PDA培養(yǎng)基上均形成明顯的抑菌圈[7]。 本試驗通過平板對峙培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)菌株KC1723 對暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌有較好的抑菌效果,特別對暹羅炭疽菌抑菌率達到68.3%,表明菌株KC1723 對由暹羅炭疽菌、平頭炭疽菌和鏈格孢菌引起的花生炭疽病、大白菜炭疽病和辣椒灰葉斑病具有很好的生防潛力。
本試驗分離、篩選并鑒定了一株枯草芽孢桿菌KC1723,并對其培養(yǎng)條件和抑菌效果進行了研究。 為了更好地應(yīng)用生防菌KC1723,下一步將提取其抗菌活性產(chǎn)物,解析抑菌機理以及開展田間防效研究和評估。