高圣風(fēng), 付華菲, 海 龍, 茍亞峰, 孫世偉,劉世超, 薛 超, 田 甜, 溫思為

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 香料飲料研究所 海南 萬寧 571533；2.海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點實驗室海南 萬寧 571533；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 熱帶作物學(xué)院 云南 普洱 665000)

1 材料與方法

胡椒Piper nigrumL.屬胡椒科Piperaceae 胡椒屬Piper多年生常綠藤本植物，是世界上使用最廣泛的香料之一，被譽為“香料之王”[1]。胡椒瘟病具有極強的毀滅性和傳播性，于20 世紀70 年代曾在海南省爆發(fā)流行，導(dǎo)致種植面積縮減20%[1]，是危害胡椒生產(chǎn)的首要病害。但是胡椒瘟病的病原菌物種分類尚存爭議，這不利于其機理研究和防控工作的開展。

胡椒瘟病是世界性病害。在國外，胡椒瘟病菌最初因為其玫瑰花瓣狀菌落形態(tài)被認為是棕櫚疫霉Phytophthora palmivora[2]，后來發(fā)現(xiàn)，馬來西亞胡椒瘟病菌游動孢子囊形態(tài)更接近于當(dāng)?shù)氐睦苯芬呙筆.capsici[3]。在國內(nèi)，張開明等[4]根據(jù)孢子囊特征認為中國華南地區(qū)胡椒瘟病的病原菌有2 種，辣椒疫霉和寄生疫霉P.parasitica；桑利偉等[5]調(diào)研海南省胡椒病害時發(fā)現(xiàn)，胡椒瘟病菌孢子囊形態(tài)特征與辣椒疫霉一致，且內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列與辣椒疫霉菌株同源性最高。

辣椒疫霉寄主范圍非常廣泛，已知寄主多達50 余種作物，包括：辣椒、番茄、茄子等茄科植物，黃瓜、南瓜、西瓜等葫蘆科植物，白菜、菜花、胡蘿卜等十字花科植物，菜豆、豇豆等豆科植物，以及胡椒、橡膠樹、木瓜、可可等熱帶經(jīng)濟作物，等等[6-8]。目前關(guān)于辣椒疫霉致病研究主要集中在辣椒、南瓜等溫帶瓜菜類作物上，在熱帶香料作物胡椒上報道極少。而且有研究表明，分離自胡椒上的辣椒疫霉菌在遺傳學(xué)系統(tǒng)發(fā)育樹上與溫帶茄科、葫蘆科等作物上的辣椒疫霉菌分屬不同的分類亞群[9]。海南島地處獨特的熱帶島嶼環(huán)境，其病原菌普遍存在地域特異性。分析卵菌殺菌劑對胡椒瘟病菌的室內(nèi)毒力，對認識和針對性地防控海南島辣椒疫霉病害具有指導(dǎo)意義。

本研究采用生物形態(tài)鑒定和分子鑒定相結(jié)合方法，對我國胡椒主產(chǎn)區(qū)海南省萬寧市興隆鎮(zhèn)和南橋鎮(zhèn)的胡椒瘟病樣本進行分離鑒定，并分析我國當(dāng)前在農(nóng)作物疫病上登記使用的20 種卵菌殺菌劑原藥對胡椒瘟病菌的室內(nèi)毒力，以期明確當(dāng)前主產(chǎn)區(qū)胡椒瘟病病原菌種類及其藥劑敏感性，為胡椒生產(chǎn)上殺菌劑針對性使用奠定基礎(chǔ)。

1.1 供試材料

1.1.1 病原菌培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基[10]：馬鈴薯200g 洗凈切成邊長約1cm 的方塊，放入1000mL 去離子水中煮沸15min，雙層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖和瓊脂粉各20g，溶解后用去離子水定容至1000mL，分裝至三角瓶中，50mL/瓶，封口后用121℃高壓蒸汽滅菌20min，于4℃保存。

10%V8 蔬菜汁(V8)培養(yǎng)基[11]：離心去渣的V8蔬菜汁100mL、CaCO31g、瓊脂粉20g，用去離子水定容至1000mL，121℃滅菌20min，于4℃保存。

1.1.2 卵菌殺菌劑原藥 在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.chinapesticide.org.cn)查詢當(dāng)前農(nóng)作物卵菌病害上登記使用的農(nóng)藥種類并統(tǒng)計其有效成分，購置分析純或更高純度的原藥20 種，藥劑名稱及CAS 號見表1。按說明書進行保藏和使用。

表1 供試卵菌殺菌劑及系列稀釋質(zhì)量濃度Table 1 Series dilution concentrations of the fungicides tested in this study

1.2 研究方法

1.2.1 胡椒瘟病菌的分離純化 分離純化：胡椒瘟病感病葉片樣本采集自海南省萬寧市興隆鎮(zhèn)(18°44′0″N；110°11′40″E)和南橋鎮(zhèn)(18°41′43″N；110°10′26″E)。在超凈工作臺中剪取病斑病健交界處放入75% 酒精中浸泡30s，用無菌水清洗3 次，晾干后剪成邊長約0.5cm 的小塊，放置在PDA 平板上，26℃恒溫培養(yǎng)24h；從長出的菌落邊緣挑取菌絲塊轉(zhuǎn)接至新PDA 平板上并繼續(xù)培養(yǎng)24h，重復(fù)轉(zhuǎn)接純化3 次。

回接驗證：用無菌打孔器將純化好的菌落打成直徑約0.5cm 的菌絲塊。在離體胡椒葉片中央用無菌大頭針刺3 個小孔，并將菌絲塊覆蓋在針孔上，菌絲面與葉片接觸，26℃恒溫培養(yǎng)72h 后觀察發(fā)病情況。

菌種保存：將通過驗證的病原菌轉(zhuǎn)接至PDA 試管斜面，14℃恒溫保存。

1.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察 將活化好的胡椒瘟病菌接種至V8 培養(yǎng)基上，用錫紙包裹避光，26℃黑暗培養(yǎng)5 d。于超凈工作臺中用無菌玻璃棒輕輕抹壓，使氣生菌絲貼附在培養(yǎng)基表面，在26 ℃、5000 lx 恒溫光照條件下培養(yǎng)36 h，誘導(dǎo)孢子囊形成。向平板中加入10 mL 無菌水，先于4 ℃冷藏1 h，再于30 ℃恒溫放置30 min，促使游動孢子釋放。吸取孢子懸浮液，制作臨時裝片，用光學(xué)顯微鏡觀察游動孢子[10-11]。

1.2.3 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析 提取病原菌DNA并采用核糖體DNA 的ITS擴增通用引物(ITS1 和ITS4)進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司測序。以GenBank下載的已鑒定菌株序列為參考，通過CLUSTALX2.1軟件進行序列兩兩多重比較分析，通過MEGA7軟件采用Neighbor-joining計算方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap(1000 次重復(fù))檢驗聚類分支自舉支持率[12]。

1.2.4 供試卵菌殺菌劑對胡椒瘟病菌的室內(nèi)活性分析 采用菌絲生長速率法[13]測定供試20 種卵菌殺菌劑原藥對胡椒瘟病菌的室內(nèi)毒力。在無菌條件下，用二甲基亞砜將供試藥劑溶解，稀釋成系列質(zhì)量濃度的藥液供試。藥液的每一步操作均須在渦旋20s 后立即用移液槍吸取添加。將50mLPDA 培養(yǎng)基融化后冷卻至50 ℃左右，加入藥液混勻后等量倒入3 個直徑9 cm 的平板中，制成系列質(zhì)量濃度的PDA 含藥平板，濃度梯度見表1。用無菌打孔器將培養(yǎng)5 d 的菌落打成直徑約0.5 cm的菌絲塊，菌絲面朝下接種至PDA 平板中央，于26 ℃下培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測量菌落直徑。以不含藥PDA 平板為對照，每處理3 個重復(fù)。按公式 (1) 計算各濃度殺菌劑對胡椒瘟病菌菌絲生長的抑制率。

式中：I為菌絲生長抑制率，%；D0為對照菌落直徑，cm；Dt為處理菌落直徑，cm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過IBM SPSS statistics 22 軟件采用Probit 回歸模型分析抑菌率與藥劑濃度 (以10 為底的對數(shù))的線性關(guān)系，計算毒力回歸方程并進行皮爾遜擬合優(yōu)度卡方檢驗，同時計算出EC50值及其95%置信區(qū)間 (confidence interval, CI)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將從田間樣本分離的7 個菌株回接至胡椒葉片，發(fā)現(xiàn)3 株可引起胡椒瘟病典型癥狀，葉斑黑色，近圓形，直徑約1.5～3.5 cm，邊緣不光滑、有布料線頭狀毛邊 (圖1A、1B)。3 個菌株的菌落形態(tài)十分相似，均在PDA 培養(yǎng)基上產(chǎn)生帶有放射狀紋理的圓形菌落，氣生菌絲較短、白色 (圖1C)。在光學(xué)顯微鏡下，3 株病原菌的形態(tài)也無明顯差異，均能在V8 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生洋梨形孢子囊，并釋放出圓形游動孢子；但是不同培養(yǎng)批次的孢子囊的長寬比存在差異 (圖1D、1E)。其菌落和微觀形態(tài)與前人報道的中國溫帶地區(qū)的辣椒疫霉P.capsici一致[1,5]；但是不同于印度尼西亞的胡椒瘟病菌[2]。

圖1 胡椒瘟病癥狀及其病原菌形態(tài)Fig.1 Disease symptom and pathogen morphology of black pepper foot rot disease

2.2 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

對3 株病原菌的ITS 測序結(jié)果比對分析，發(fā)現(xiàn)3 個菌株的ITS 片段序列片完全一致，擇一上傳至GenBank，登錄號為OQ608808。通過BLAST 比對分析，發(fā)現(xiàn)其ITS 基因序列與辣椒疫霉的同源性為100%。從GenBank 下載3 株辣椒疫霉和9 種其他疫霉菌的ITS 序列：P.capsica(MH842159.1、KY575676.1、MT678677.1)、P.c i t r o p h t h o r a(K U 9 3 4 2 1 0.1)、P.m e a d i i(JX155793.1)、P.megasperma(KJ405942.1)、P.sojae(AY590272.1)、P.palmivora(JX155791.1)、P.cactorum(KM085441.1)、P.parasitica(GU111674.1)、P.i n f e s t a n s(G U 2 5 8 1 5 1.1)、P.h e v e a e(EU045747.1)。以煙草霜霉菌 (Peronosporatabacina，DQ067899.1) 為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)本研究菌株與分離自國內(nèi)外的3 株辣椒疫霉菌聚類在同一分支，自舉支持率為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，判定本研究從胡椒上分離的菌株為辣椒疫霉(圖2)。

圖2 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建辣椒疫霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Phytophthora capsica based on rDNA-ITS sequences

2.3 供試卵菌殺菌劑對胡椒瘟病菌的室內(nèi)殺菌活性分析

通過菌絲生長速率法計算出20 種供試卵菌殺菌劑對胡椒瘟病菌的毒力回歸方程和EC50值 (表2)，其中多抗霉素因抑菌很差未進行毒力分析。通過皮爾遜卡方檢驗零假設(shè)模型分析發(fā)現(xiàn)，顯著性Sig 值均大于0.150，說明毒力回歸模型對數(shù)據(jù)的擬合度較好。按EC50值升序排列，吡唑醚菌酯、氟啶胺、福美雙、烯酰嗎啉、氰霜唑、甲霜靈等6 種藥劑的EC50< 1 μg/mL，抑制菌絲生長效果最好；喹啉銅、百菌清、代森錳鋅、代森鋅、氫氧化銅等6 種藥劑的EC50值處于1～10 μg/mL 之間，抑菌效果較好；氧化亞銅、王銅、嘧菌酯、香芹酚、霜脲氰、小檗堿等6 種藥劑的EC50值處于10～50 μg/mL 之間，抑菌效果一般；幾丁聚糖、三乙膦酸鋁的EC50> 300 μg/mL，抑菌效果較差。

表2 供試20 種卵菌殺菌劑對胡椒瘟病菌的殺菌活性Table 2 Inhibitory activity of 20 oomycete fungicides against P.capsici causing black pepper foot rot disease

3 結(jié)論與討論

本研究將海南萬寧胡椒主產(chǎn)區(qū)的胡椒瘟病病原菌鑒定為辣椒疫霉P.capsici，發(fā)現(xiàn)菌落及孢子囊等形態(tài)特征受菌株特異性和環(huán)境因素影響較大，僅能作為物種判定的參考[15]，ITS 序列等分子鑒定手段更容易區(qū)分形態(tài)相近的辣椒疫霉、棕櫚疫霉及寄生疫霉[1,5]。同時評價了20 種我國當(dāng)前在農(nóng)作物疫病上登記使用的卵菌殺菌劑原藥對胡椒瘟病菌菌絲生長的抑制效果，發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯、氟啶胺、福美雙、烯酰嗎啉、氰霜唑及甲霜靈的室內(nèi)毒力最高，其中吡唑醚菌酯、甲霜靈和嘧菌酯等藥劑的抑菌結(jié)果不同于其對溫帶辣椒疫霉上的報道[13,16-18]，推測與海南島胡椒瘟病菌的地域特異性有關(guān)。

本研究中，胡椒瘟病菌在PDA 平板上的菌落紋理為放射狀 (圖1C)，與桑利偉等[5]報道的胡椒瘟病菌一致，但不同于Muller[2]報道的印度尼西亞胡椒瘟病菌，有著與棕櫚疫霉一致的玫瑰花瓣狀紋理。Truong 等[15]將越南全境的204 株胡椒瘟病菌鑒定為辣椒疫霉，但是發(fā)現(xiàn)其在PDA 上的菌落紋理存在放射狀、玫瑰花瓣狀、棉絨狀等眾多形態(tài)，因此推測胡椒瘟病菌的菌落紋理可能存在地域性差異。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，同一株胡椒瘟病菌不同觀察批次孢子囊的長寬比差別很大，孢子囊形狀有時較為狹長、有時略顯粗短 (圖1D、1E)，推測顯微視野中的孢子囊長寬比可能與其生長狀態(tài)或觀察角度有關(guān)。由此推測，張開明等[4]以孢子囊長寬比為主要參考依據(jù)，將胡椒瘟病菌鑒定分為辣椒疫霉和寄生疫霉兩類，可能不夠精準。通過ITS 序列分析，本研究中的胡椒瘟病菌與國內(nèi)外辣椒疫霉菌聚類到同一分支，自舉支持率達100%，這與桑利偉等[5]和Truong 等[15]的報道一致，說明形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS 序列，能夠有效區(qū)分胡椒瘟病菌與棕櫚疫霉、寄生疫霉等形態(tài)相近的病原菌。

嘧菌酯在國際殺菌劑市場中占據(jù)巨大份額，何烈干等[13]發(fā)現(xiàn)，江西省58 株番茄綿疫病菌P.capsici對嘧菌酯 (96%純度，先正達 (蘇州) 作物保護有限公司) 的EC50值介于0.1867～1.6239 μg/mL之間，抗藥性風(fēng)險中等；但在本研究中，嘧菌酯(98%純度，上海源葉生物科技有限公司) 對海南胡椒瘟病的EC50值高達28.23 μg/mL；而同屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的吡唑醚菌酯的抑菌活性最高，EC50值僅為0.02 μg/mL，甚至低于烯酰嗎啉 (0.12 μg/mL)。不同于孫平平等[16]、苗建強等[17]報道的烯酰嗎啉對溫帶辣椒疫霉菌絲抑制活性比吡唑醚菌酯高10 倍左右。而氟啶胺在本研究中的抑菌活性 (EC50值為0.07 μg/mL) 高于氰霜唑(EC50值為0.36 μg/mL)，與楊叔青等[18]報道的氟啶胺對溫帶辣椒疫霉的測定結(jié)果一致，并未表現(xiàn)出地域性差異。

甲霜靈是當(dāng)前防控辣椒疫霉病害的主要農(nóng)藥之一，其抗藥性問題一直是研究的熱點之一。王藝燁[19]在遼寧、甘肅、內(nèi)蒙古等地發(fā)現(xiàn)了8 株辣椒疫霉抗藥性菌株；戚仁德等[20]發(fā)現(xiàn)，安徽省16 個市 (縣) 的125 株辣椒疫霉中敏感菌株、中間菌株和抗性菌株分別占總體的63.2%、30.4%和6.4%，其中最高抗性倍數(shù)達90 倍；但是本研究中的3 株辣椒疫霉均是敏感菌株，推測與萬寧地區(qū)甲霜靈農(nóng)藥使用較少有關(guān)。

烯酰嗎啉在辣椒疫霉病害防控上廣受關(guān)注，在本研究中，其對胡椒瘟病菌的EC50值為0.12 μg/mL，該數(shù)值與國內(nèi)外各地辣椒疫霉上的檢測結(jié)果一致，比如：張世才等[21]檢測了重慶地區(qū)的102 株辣椒疫霉菌，崔曉嵐等[22]檢測了125 株分別采自河北、內(nèi)蒙古、陜西、安徽和北京等地區(qū)的辣椒疫霉病菌，馬輝剛等[23]調(diào)研了江西各地區(qū)的辣椒疫霉菌對烯酰嗎啉的敏感性，均未發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體；Jackson 等[24]報道，美國喬治亞州的甜椒和葫蘆上辣椒疫霉對烯酰嗎啉均具有良好的敏感性，表明烯酰嗎啉在辣椒疫霉防控具有地域普適的應(yīng)用潛力。

一百多年來，銅制劑一直是防控植物疫病的重要藥劑，在本研究中喹啉銅、氫氧化銅、氧化亞銅、王銅等銅制劑的EC50值在2.33～10.90 μg/mL之間，對胡椒瘟病菌具有較好的抑制活性。雖然，Torre 等[25]報道，大量使用銅制劑可能影響植物新陳代謝和營養(yǎng)吸收，但是通過與其他藥劑復(fù)配或輪換使用，可以提高防治效果和大幅降低銅制劑使用量[26]，其應(yīng)用前景依然十分廣闊。

植物源農(nóng)藥香芹酚和小檗堿被廣泛應(yīng)用于人類及動物醫(yī)學(xué)上。在農(nóng)業(yè)上，魏敏等[27]發(fā)現(xiàn)，使用5%香芹酚水劑在2250 mL/hm2劑量下噴霧，其對馬鈴薯晚疫病的防效可達83.13%；李寶燕等[28]發(fā)現(xiàn)，0.5%小檗堿水劑對葡萄霜霉病菌的EC50值為11.85 μg/mL，以有效成分25 μg/mL 的質(zhì)量濃度噴霧施用，其田間防效達80%以上。在本研究中，兩種藥劑的EC50值分別為27.34 和45.68 μg/mL，綜合其綠色環(huán)保特點，依然具有較好的應(yīng)用潛力。

幾丁聚糖通常作為誘抗劑被大眾認知，但其直接抑菌效果也常見報道。賈瑞秀等[29]發(fā)現(xiàn)，殼聚糖能夠誘導(dǎo)鐮孢菌細胞壁中幾丁質(zhì)的酶活，增加細胞膜的通透性，達到抑制菌絲生長效果。本研究結(jié)果也表明，幾丁聚糖具有一定的抑制辣椒疫霉菌絲生長作用 (EC50值為312.29 μg/mL)，其作用機制尚待進一步研究。

但是，三乙膦酸鋁——當(dāng)前我國唯一登記防控胡椒瘟病的藥劑，其EC50值高達659.89 μg/mL。尹敬芳等[30]也發(fā)現(xiàn)，三乙膦酸鋁對辣椒疫霉菌菌絲生長、孢子囊形成、休止孢萌發(fā)和孢子囊直接萌發(fā)等4 個發(fā)育階段的抑制效果均較弱。同樣，多抗霉素是已被多次登記為防控黃瓜霜霉病Pseudopeonospora cubensis、馬鈴薯和番茄晚疫病P.infestans的藥劑，但是在本研究中未檢測到其對胡椒瘟病菌有抑制效果。需要注意的是，本研究僅分析了供試藥劑對胡椒瘟病菌菌絲生長的抑制活性，評價殺菌劑效果時還需綜合考慮其他眾多因素，比如對病原菌產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)等方面的效果，以及藥劑的內(nèi)吸性、傳導(dǎo)性等理化性質(zhì)，等等。此外，還需考慮農(nóng)藥使用限制，比如，福美雙、代森錳鋅、百菌清等殺菌劑已經(jīng)逐步在歐盟等國家和地區(qū)被限制使用。