陳庭男, 齊沛沛, 華修德, 王鳴華, 何 吉,聞路紅, 章文天, 王新全*,

(1.南京農業(yè)大學 植物保護學院，南京 210095；2.浙江省農業(yè)科學院 農產(chǎn)品質量安全與營養(yǎng)研究所，杭州 310021；3.寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司，浙江 寧波 315100)

0 引言

因農藥超范圍、超量使用導致的農產(chǎn)品中農藥殘留超標，成為我國近年來面臨的較為突出的農產(chǎn)品安全問題。2021 年，農業(yè)農村部等七部委聯(lián)合頒布“三年行動”方案，明確指出要嚴格市場準入管理，并提出精準治理理念，蔬菜方面重點治理“三顆菜”——芹菜、韭菜、豇豆中易超標和禁限用農藥[1]。為了及時、有效地監(jiān)測農產(chǎn)品中農藥殘留，確保進入市場的農產(chǎn)品安全性，迫切需要研發(fā)現(xiàn)場、多農藥同時測定的定性/半定量快檢創(chuàng)新技術。

質譜以精準的定性能力成為近年來實驗室分析的強力支撐。隨著質譜微型化以及直接電離質譜等技術的飛速發(fā)展，如原位實時直接分析(DART)[2]、解吸電噴霧離子源 (DESI)[3]、介質阻擋放電 (DBDI)[4-5]和脈沖式電噴霧離子化技術[6]，推動了便攜式質譜技術走向現(xiàn)場快速檢測中，在公共安全、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、生物科學等領域均有應用[7-13]。

然而，樣品不經(jīng)色譜分離，直接電離進入質譜，極易導致樣品中雜質離子共流出，引起顯著的離子抑制或增強，嚴重影響檢測結果的正確度和靈敏度。因此，亟需建立快捷、高效、可以匹配于便攜質譜儀分析的前處理技術。磁固相萃取技術 (MSPE) 是以磁性功能材料為吸附劑，兼具固相萃取高效富集功能和磁材料傳質效率高、分離速度快的優(yōu)勢，且無需輔助設備，非常適于現(xiàn)場快速預處理。Liu 等[14]以親脂性二乙烯基苯和親水性吡咯烷酮為功能單體，在Fe3O4顆粒表面聚合，研制出親疏水平衡型磁材料磁性聚(二乙烯基苯-吡咯烷酮，PLS)，建立了可同時富集海水中96 種農藥多殘留的分析方法。Lin 等[15]將單體2,5-二羥基對苯二甲醛和1,3,5-三 (4-氨基苯基) 苯接枝到磁性納米顆粒表面上，制備磁性共價有機框架 (COF)，建立了高效MSPE方法，用于水果中有機磷農藥的測定。Wang 等[16]以L-丙氨酸修飾的MIL-88B 為原料，制備了磁性金屬有機框架(MOF)，建立了MSPE 方法用于蔬菜中新煙堿類農藥的測定。這些研究為快速樣品前處理技術提供了新材料和選擇，然而目前仍主要與色譜-質譜聯(lián)用分析多農藥殘留，尚未見與便攜式離子阱質譜儀聯(lián)用進行農藥殘留分析的研究報道。

綜上，本研究擬以“三顆菜”中易超標農藥啶蟲脒、吡蟲啉和禁限用農藥克百威為研究對象，以普適性PLS 磁珠為吸附劑，開展快速樣品前處理，結合直接電離-便攜式離子阱質譜儀，建立“三顆菜”中多農藥殘留、現(xiàn)場快速檢測技術，為蔬菜中多農藥殘留的同時、準確、快速篩查分析提供新的技術，旨在為區(qū)縣監(jiān)管機構的市場抽檢、大型商超及批發(fā)市場的產(chǎn)品質控等提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CRAIV-110 便攜式質譜儀 (寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司)；毛細管探針 (武漢微探生物科技有限公司)；LC-8050 液相色譜儀 (LC，日本Shimadzu 公司)；SCIEX 4500 三重四極桿質譜聯(lián)用儀 (美國Sciex 公司)；Biofuge Primo R 臺式離心機 (美國Thermo 公司)；Filter Unit 濾膜 (0.22 μm，天津Agela Technologies公司)。

親疏水平衡型磁材料PLS 為實驗室自制[14]。試驗用水為超純水 (Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司)；甲醇和乙腈 (色譜純 美國Merck公司)；甲酸 (美國ACS 公司)。啶蟲脒 (acetamiprid)、吡蟲啉 (imidacloprid) 和克百威 (carbofuran) 標準品，均購于農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。蔬菜樣品購于杭州各大農貿市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 溶劑萃取過程 (水萃取過程)：稱取勻漿后的蔬菜樣品 (2.00 ± 0.02) g 于50 mL 離心管中，加入20 mL 水，渦旋5 min，于5000 r/min 下離心1 min，取上清液，備用。

磁固相萃取過程：準確稱取30 mg PLS 磁珠于2 mL 離心管中，加入2 mL 甲醇，活化1 min后棄甲醇，加入上清液中，超聲萃取 (磁珠萃取)15 min，用磁力槍將磁性材料取出；加入到4 mL體積分數(shù)為0.1%的甲酸乙腈中，渦旋洗脫3 min，在外加磁場作用下取上清液，過0.22 μm 濾膜；用探針蘸取濾液，蘸取時間不少于3 s，待便攜式質譜儀分析。

1.2.2 儀器檢測條件 探針為石英玻璃毛細管：外徑為1.5 mm，內徑為1.1 mm，長度為5 cm；探針針尖口徑：50 μm；探針針尖到質譜儀入口距離：10 mm。便攜式質譜儀采樣毛細管：內徑為0.37 mm，長度為100 mm，直流電壓90 V；探針式離子源離子源極性：正離子模式 (ESI+)；打拿極電壓-5500 V；倍增器電壓-1050 V；線性離子阱：共振交流電的電壓為1～4 V，射頻幅值電壓為120～1500 V；MS2分析質譜參數(shù)見表1。

表1 各農藥的MS2 分析參數(shù)Table 1 MS2 analysis parameters for each pesticide

1.2.3 標準溶液的配制及標準曲線繪制

儲備液的制備：用甲醇溶解各農藥標準品，配制成質量濃度為16 mg/L 的單一標準儲備液。

混合標準品溶液：分別準確移取定量儲備液于25 mL 容量瓶中，混勻，用甲醇稀釋，配制成質量濃度為2 mg/L 的混合標準品溶液。

基質匹配標準品溶液：用空白樣品提取液稀釋混合標準品溶液，配制成0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25 和0.5 mg/L 系列質量濃度的基質匹配標準品溶液。根據(jù)需要，現(xiàn)配現(xiàn)用。

配制0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25 和0.5 mg/L 系列質量濃度的標準溶液和基質匹配標準溶液，每個水平重復5 次，每次檢測更換不同的探針，以化合物質量濃度為橫坐標 (x)，便攜式質譜儀中目標物的離子強度響應值為縱坐標 (y) 繪制標準曲線。

1.2.4 方法對比驗證 將本研究所建立的方法和傳統(tǒng)實驗室分析方法液相色譜-串聯(lián)質譜 (LC-MS/MS)[17]進行結果比對，驗證該方法的可行性。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法建立

前處理方法優(yōu)化過程中，以芹菜作為代表基質，各農藥的混配質量分數(shù)均為0.2 mg/kg，采用單因素評價方法，重點考察萃取溶劑、磁固相萃取中磁吸附劑用量、吸附時間、解吸溶劑及體積等主要因素對各農藥離子信號強度的影響，篩選最佳優(yōu)化參數(shù)。樣品前處理流程示意圖如圖1所示。

圖1 樣品前處理流程圖Fig.1 Sample pre-treatment flow chart

2.1.1 萃取溶劑及體積對農藥回收率的影響 對比了純水、乙腈和緩沖鹽溶液作為萃取溶劑的萃取效率差異 (添加的目標農藥均經(jīng)過24 h 隔天處理)。將萃取液直接采用LC-MS/MS 分析[17]，結果(表2) 顯示，純水作為提取溶劑對目標農藥提取率均高于90%，效果優(yōu)于緩沖鹽溶液 (組成成分為磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉和水)。同時發(fā)現(xiàn)緩沖鹽溶液會明顯抑制離子信號，故選擇純水進行勻漿蔬菜樣品中農藥殘留的萃取。在此基礎上考察了純水用量 (10、20 和30 mL) 對農藥提取效果的影響，結果如圖2 所示。當純水用量從10 mL到20 mL 時，目標農藥的離子信號強度呈上升趨勢，分別在130～230 和240～280 之間。當繼續(xù)增加到30 mL 時，農藥的離子信號強度為245～280，與20 mL 處理相比，提取效果提升并不顯著。因此，選用20 mL 純水作為萃取溶劑。

圖2 純水用量對3 種農藥離子信號強度的影響Fig.2 Eeffect of amount of pure water on the ions signal of three pesticides

表2 萃取溶劑對3 種農藥提取效果的影響Table 2 Eeffect on extraction of target pesticides with different extraction reagents

2.1.2 磁固相萃取方法建立

2.1.2.1 PLS 用量 首先，考察了磁固相吸附劑PLS 用量 (10、20、30、40 mg) 對各農藥提取效果的影響。結果 (圖3) 發(fā)現(xiàn)，當PLS 用量在10～30 mg 之間時，目標農藥的信號強度總體呈上升趨勢，分別為210～302、212～320 和255～345。當繼續(xù)增加磁材料用量到40 mg 時，信號強度為240～335，相較于30 mg 無明顯提升。綜合考慮，吸附材料PLS 的用量為30 mg。

圖3 不同磁性材料PLS 用量條件下各3 種農藥的離子信號強度Fig.3 The ions signal of three pesticides using different amounts of magnetic material PLS

2.1.2.2 PLS 吸附時間 在確定了PLS 用量為30 mg的基礎上，采用超聲輔助吸附，考察了吸附時間(10、15、20 min) 對農藥提取效果的影響，如圖4所示，當吸附時間為10、15、20 min 時，目標農藥的信號強度分別為195～236、266～295 和269～291。在10～15 min 范圍內，農藥的離子信號強度呈上升趨勢，繼續(xù)增加時間至20 min，趨于穩(wěn)定。因此，選擇超聲吸附時間為15 min。

圖4 吸附時間對3 種農藥離子信號強度的影響Fig.4 Effect of adsorption time on the ions signal of threepesticides

2.1.2.3 解吸附溶劑 合適的解吸附溶劑是影響洗脫的一個重要因素。在本研究中，選擇8 種解吸附劑，考察其對3 種農藥的洗脫能力，包括甲醇溶液、乙腈溶液、體積分數(shù) (下同) 為0.1%的甲酸乙腈(ACN-0.1%FA)、0.1%甲酸甲醇(ME-0.1%FA)、0.2%甲酸乙腈(ACN-0.2%FA)、0.2%甲酸甲醇(ME-0.2%FA)、0.5%甲酸乙腈(ACN-0.5%FA)和0.5%甲酸甲醇(ME-0.5%FA)。如圖5 所示，乙腈的洗脫效果優(yōu)于甲醇，且用體積分數(shù)0.1%甲酸酸化的乙腈效果更好，0.1%甲酸的加入進一步提高了解吸附劑的洗脫能力。因此，選用0.1%甲酸乙腈作為解吸附溶劑。

圖5 解吸附溶劑對3 種農藥離子信號強度的影響Fig.5 The ions signal of three pesticides using different kinds of desorption solvents

2.1.2.4 解吸附溶劑體積 解吸附溶劑體積也是獲得準確和穩(wěn)定結果的關鍵因素。本研究中，考察了不同體積的0.1%甲酸乙腈 (3、4、5 mL) 對3種農藥提取效果的影響，如圖6 所示，當0.1%甲酸乙腈體積為4 mL 時，3 種農藥的離子信號最強。綜合考慮，選擇4 mL 0.1%甲酸乙腈作為解吸附溶劑。

圖6 0.1%甲酸乙腈體積對3 種農藥離子信號強度的影響Fig.6 The ions signal of three pesticides using different volumes of acetonitrile with 0.1% (V/V) formic acid

2.1.2.5 0.1%甲酸乙腈解吸時間 研究了解吸時間 (1、3 和5 min) 對3 種農藥提取效果的影響，如圖7 所示，解吸時間為3 min時目標農藥的離子信號強度較解吸時間為1 min有顯著提高，整體呈上升趨勢。當解吸時間繼續(xù)增加到5 min 時，離子信號強度趨于穩(wěn)定。考慮到時間越長，雜質伴隨目標物洗脫的可能性越大，因此解吸時間以3 min 最佳。

圖7 解吸附時間對3 種農藥離子信號強度的影響Fig.7 Effect of desorption times on the ions signal of three pesticides

2.2 方法驗證

通過評估其線性、靈敏度、回收率、精密度，驗證所開發(fā)方法的性能及適用性。

2.2.1 線性范圍及靈敏度 結果如表3 所示，3 種農藥在芹菜、韭菜、豇豆中均具有較好的線性關系，線性范圍隨基質的差異略有不同。除啶蟲脒的相關系數(shù) (r=0.9880) 外，其余各農藥的r均大于0.99。然而，便攜質譜儀缺少色譜的分離功能，樣品中雜質離子的共流出帶來了嚴重的離子競爭抑制，因此存在普遍的基質效應，需采用基質匹配標準溶液進行定量分析。質譜的定性能力強、準確性好，作為定性/半定量的檢測方法，能夠滿足日常工作中的快速篩選。

表3 三種農藥的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限Table 3 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, LODs and mLOQs for three pesticides

3 種農藥在芹菜、韭菜、豇豆基質中的的檢出限 (LOD) 在0.001～0.035 mg/L 之間，方法定量限(mLOQ) 在0.02～0.05 mg/kg 之間，均低于GB 2763—2021 中規(guī)定的最大殘留限量 (MRL)[18]，表明該前處理方法與儀器檢測平臺聯(lián)用具有優(yōu)良的檢測能力和合規(guī)性。

2.2.2 正確度及精密度 使用空白樣品進行添加回收試驗，添加水平為0.02、0.05、0.2 mg/kg，每個水平重復5 次，采用定量離子響應強度計算回收率和RSD，結果見表4。在0.02～0.2 mg/kg添加水平下，各目標農藥的回收率在50%～71%，相對標準偏差為4.2%～22%。表明該前處理方法聯(lián)用便攜質譜形成的農殘快檢技術，具有較好的靈敏度和準確性，適用于芹菜、韭菜、豇豆中的農藥殘留快速檢測。

表4 3 種農藥在芹菜、韭菜、豇豆中的添加回收率及相對標準偏差Table 4 Recoveries and RSDs of the three pesticides in celery, Chinese chives and cowpea samples

2.3 實際樣品分析

利用本研究建立的分析方法，對購自杭州各大農貿市場的100 個蔬菜樣品 (芹菜、韭菜和豇豆) 進行農藥殘留分析，并與傳統(tǒng)的實驗室分析結果進行比對，驗證該方法在農藥殘留檢測中的穩(wěn)定性與可行性，結果如表5 所示。100 份樣品中有6 份檢出目標農藥，檢出量為0.021～0.58 mg/kg，且本方法分析結果與傳統(tǒng)實驗室分析結果一致性較高，滿足國家標準中對最大殘留限量分析的要求，未出現(xiàn)假陽性或假陰性情況，表明本方法具有較強的定性準確度，且本方法可以對目標物進行半定量分析，檢測結果更加準確。與傳統(tǒng)分析方法不同的是，1) 便攜式質譜儀器的分析時間僅需20 s，極大縮短了檢測過程所需的時間。2) 具有可現(xiàn)場操作的便捷性。3) 具有更強的抗干擾能力，能夠適用多種復雜基質，滿足目標物的多基質檢測。綜上，該方法能夠滿足芹菜、韭菜、豇豆中多種農藥殘留的現(xiàn)場、快速同時檢測。

表5 實際樣品中3 種農藥殘留的測定結果Table 5 The pesticide residues of three pesticides in real samples

綜上所示，本研究所建立的農藥殘留速測技術具有較強的定性、半定量能力，與實驗室精準分析儀器一致性較高，在實際樣品的檢測中未出現(xiàn)假陽性及假陰性情況，且能夠滿足多種基質中多目標物的同時檢測，檢測時間短，檢測成本低。

2.4 基質適用性評價

基質適用性是評價方法適用性的一個重要指標。本研究以豇豆為例，分別選取了3 個不同品種的豇豆樣品 (豇豆1、豇豆2、豇豆3) 進行了基質適用性評價。分別配制0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5 mg/L 系列質量濃度的標準溶液和基質匹配標準溶液，每個水平重復5 次，且每次更換不同的探針，以化合物質量濃度為橫坐標 (x)，對應目標物的離子強度響應值為縱坐標 (y) 繪制標準曲線，結果如表6 所示。從結果來看，豇豆基質中3 種目標農藥的基質效應在0.085～0.16 之間，主要原因為儀器缺乏色譜的分離功能，雜質對目標農藥干擾嚴重，導致實際離子信號強度偏弱，但3 種農藥基質效應的相對標準偏差均低于15%，表明同類蔬菜所造成的基質效應相似。在檢測過程無法獲得空白基質的情況下，可提前準備同類蔬菜樣品，以滿足日常檢測，進一步提升該方法的適用性。

表6 不同品種豇豆的基質效應評價Table 6 Matrix effects of different kinds of cowpea

3 結論與展望

本研究優(yōu)化了溶劑萃取-磁性固相萃取凈化前處理技術，結合直接電離-便攜式離子阱質譜儀，構建了芹菜、韭菜和豇豆中啶蟲脒、吡蟲啉、克百威殘留的快速檢測技術。3 種目標農藥在芹菜、韭菜、豇豆中均具有較好的線性關系，相關系數(shù)(r) 除啶蟲脒 (r=0.9880) 外均大于0.99。檢出限為0.001～0.035 mg/L，定量限為0.02～0.05 mg/kg，均低于GB 2763—2021 中規(guī)定的最大殘留限量，表明該前處理方法與儀器檢測平臺聯(lián)用具有優(yōu)良的檢測能力。實際樣品分析結果表明，本方法未出現(xiàn)假陽性或假陰性情況，展現(xiàn)出較強的定性準確度。本方法能夠同時適用于多種復雜基質中多個目標物的同時檢測，檢測時間短、操作簡便。綜上所述，該技術準確性較好、定性/半定量能力強、可現(xiàn)場快速篩查，實現(xiàn)現(xiàn)場多目標定性檢測，為區(qū)縣監(jiān)管機構的市場抽檢、大型商超及批發(fā)市場的產(chǎn)品質控等提供技術支撐。

目前，基于便攜式質譜展開的農藥殘留現(xiàn)場速測技術尚處于起步研究階段，由于儀器端缺乏色譜的分離功能，導致雜質與目標農藥共流出，基質干擾十分嚴重，目標農藥回收率無法達到70%～120%的分析要求。后續(xù)需要進一步提高儀器的檢測靈敏度，提高對目標物的檢出能力。同時要進一步優(yōu)化樣品前處理技術，后續(xù)仍需進一步探究凈化除雜的可行性，深入研究不同樣品前處理技術的凈化能力和操作效率，構建出更適合于現(xiàn)場快速檢測的新技術與產(chǎn)品。