盧清俠，王獻偉，馬強，陳俊峰，高彬文，邢寶松，張家慶*，任巧玲*

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002；2. 河南省畜牧技術(shù)推廣總站，河南 鄭州 450008)

在哺乳動物和人類，70.0%～99.9%的卵泡在發(fā)育的不同階段發(fā)生閉鎖[1]。研究表明，顆粒細胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要原因，并先后在多種動物中得到證實[2-3]。體內(nèi)外各種刺激可誘發(fā)卵泡微環(huán)境產(chǎn)生活性氧簇物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)。低濃度的ROS是重要的第二信使，可調(diào)控基因的表達；而高濃度的 ROS可導(dǎo)致重要細胞器和DNA的不可逆損傷，最終導(dǎo)致細胞凋亡[4]。大量研究表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，如3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid，3-NP)、化療藥物、多環(huán)芳香烴等能夠有效誘導(dǎo)有腔卵泡閉鎖[5-6]，而在卵泡閉鎖前可首先檢測到ROS水平的顯著上升，并且這些因素誘導(dǎo)的凋亡均能為抗氧化劑所抑制[7]。葡萄籽提取物原花青素(grape seed procyanidins，GSP)是從葡萄籽中提取的一種機體內(nèi)不能合成的新型高效天然抗氧化劑物質(zhì)[8]。在人和動物研究發(fā)現(xiàn)，補充GSP能有效抑制卵巢氧化損傷，從而提高了顆粒細胞活性，但GSP保護顆粒細胞氧化損傷的作用機制尚不明確[9-10]。

微RNA (miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控[11]。miRNA可通過調(diào)節(jié)線粒體代謝來影響細胞ROS水平[12]，也可通過調(diào)控細胞增殖和分化的關(guān)鍵因子[13]。miRNA表達異常也與多種生殖性疾病密切相關(guān)，如多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)等[14]。miR-181a是miR-181家族成員之一，已被證實是一種應(yīng)激性miRNA[2，15]，可通過對相關(guān)基因的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗氧化作用，如miR-181a可以間接調(diào)控叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)基因表達來減輕小鼠顆粒細胞氧化損傷[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是GSP的新靶標，GSP可調(diào)節(jié)肝、腎臟等相關(guān)疾病中致病性miRNA的表達[16]。卵泡的異常閉鎖與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，探討GSP是否可以通過對miRNA的調(diào)節(jié)來發(fā)揮抗氧化作用，具有理論和實際意義。本研究從體內(nèi)和體外水平探究GSP對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)顆粒細胞損傷的作用及miR-181a表達的影響，以期揭示其作用機制，為新藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

3周齡KM雌性小鼠購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場；GSP購自天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；原花青素 B2(GSPB2)、熒光素酶報告載體、熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國 Sigma 公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國 GIBCO 公司；H2O2(30%，AR 級)購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液購自北京索萊寶科技有限公司；miR-181a模擬物(miR-181a mimics)、mimic陰性對照(mimics NC)、miR-181a 抑制劑(miR-181a inhibitor)、inhibitor陰性對照(inhibitor NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；miR-181a、U6引物序列由天根生化科技(北京)有限公司設(shè)計合成；miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；活化的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3，#9661)購自Cell Signaling Technology公司；TGF-β受體Ⅰ(TGFBR1，ab31013)購自Abcam公司；GAPDH(10494-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性檢測試劑盒、四甲基偶氮唑鹽 (methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自寧波第二激素廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組與處理

所有動物適應(yīng)1周環(huán)境后隨機分成3組：對照(Control)組、3-NP組、GSP+3-NP組，每組10只。Control組小鼠每日8：00和20：00腹腔內(nèi)注射0.1 mL生理鹽水，連續(xù)7 d；3-NP組小鼠每日同時間腹腔注射0.1 mL的3-NP(25 mg/kg)[6]，連續(xù)7 d；GSP+3-NP組提前1周飼喂含有GSP的飼料(在小鼠的基礎(chǔ)日糧中按照200 mg/kg比例添加GSP制成)，飼喂至試驗結(jié)束，試驗開始后每日同時間腹腔注射0.1 mL的3-NP，連續(xù)7 d。GSP的劑量和處理時間參照文獻[17]。試驗結(jié)束后，所有動物頸部脫臼處死，采集相應(yīng)小鼠卵巢和卵泡顆粒細胞。

1.2.2 免疫組化分析

首先將收集的不同組別的小鼠卵巢用4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、蠟塊連續(xù)切片、常規(guī)脫蠟至水；高壓進行抗原修復(fù)15 min，PBS洗3次，每次5 min，進行抗原修復(fù)；用3% H2O2室溫孵育15 min，PBS清洗 3次，每次5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；用吸水紙擦干載玻片，滴加正常山羊血清室溫封閉15 min；滴加cleaved caspase-3抗體，4 ℃過夜，PBS 洗 3 次后加入生物素標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS清洗 3次，每次5 min，滴加新鮮配制的3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，室溫孵育3～5 min，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.3 細胞分離與培養(yǎng)

3周齡KM雌性小鼠每只腹腔內(nèi)注射10 U的PMSG，48 h后頸椎脫臼處死，在無菌條件下使用眼科鑷子和剪刀迅速取出雙側(cè)卵巢，用預(yù)熱的PBS(37 ℃)清洗3次，在體視顯微鏡下使用1 mL注射器針頭去除其周圍脂肪和被膜，再用新的1 mL注射器針頭刺破卵泡使顆粒細胞和卵母細胞釋放出來，加入預(yù)熱(37 ℃)平衡好的培養(yǎng)基 (DMEM/F12培養(yǎng)基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+10% FBS)重懸，調(diào)整細胞密度后接種于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染

將分離后重懸的小鼠顆粒細胞接種于12孔板或96孔板中，分為5組：對照(Control)組，進行正常培養(yǎng)；miR-181a mimics轉(zhuǎn)染組，加入 miR-181a mimic；mimics NC組，加入mimic NC；miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染組，加入miR-181a inhibitor；inhibitor NC組，加入inhibitor NC。參照 Lipofectamine 3000 說明書進行轉(zhuǎn)染，當(dāng)細胞生長密度為70%～80%時，棄去孔中的培養(yǎng)基，加入相對應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染48 h后，部分顆粒細胞用于檢測miR-181a和TGFBR1表達水平，部分細胞用于細胞活力檢測。上述序列均由上海吉瑪公司合成，其序列分別為miR-181a mimics：5′-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3′，5′-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUUU-3′；mimic NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-181a inhibitor：5′-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU-3′；inhibitor NC：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.2.5 雙熒光素酶活性檢測

根據(jù)TargetScan和miRanda 數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，miR-181a與TGFBR1存在靶向關(guān)系，TGFBR1是 miR-181a 的靶基因，二者存在結(jié)合序列區(qū)域，分別構(gòu)建野生型(wild type，WT)TGFBR1-3′UTR-WT和突變型(mutant type，MUT)TGFBR1-3′UTR-MUT質(zhì)粒，取人胚胎腎上皮細胞系(HEK 293T)細胞種入24 孔板中，取構(gòu)建質(zhì)粒與miR-181a mimics、miR-181a NC共轉(zhuǎn)染 HEK 293T 細胞48 h，按照說明書要求制備顆粒細胞提取物，測定各組熒光素酶活性。

1.2.6 GSPB2干預(yù)處理

用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的顆粒細胞，用含血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔2 500個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底。具體分組為：對照(Control)組，添加新的DMEM/F12+5% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；GSPB2組，更換新培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L GSPB2繼續(xù)培養(yǎng)12 h；H2O2組，更換新培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為 150 μmol/L H2O2培養(yǎng)12 h；GSPB2+H2O2組，在新的培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μmol/L GSPB2培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為150 μmol/L H2O2培養(yǎng)12 h。上述藥物使用濃度和處理時間參照已發(fā)表文獻[8-9]，試驗結(jié)束后收集細胞樣品，部分樣品用于檢測miR-181a和TGFBR1表達水平，部分用于檢測caspase-3活性和細胞活力。

1.2.7 細胞活力測定

將細胞接種于96 孔板中，密度為每孔2 500個細胞，每組設(shè)置6個平行孔，置37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～48 h。在每個孔中加入 20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，利用酶標儀測定570 nm波長處各孔的吸光度(OD)值。

1.2.8 Caspase-3活性分析

將細胞懸液全部收集到1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，PBS清洗1次，吸取上清液后，按照每200萬細胞加入50 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min，期間渦旋振蕩3～4次，每次10 s。在4 ℃環(huán)境下，12 000 r/min離心10 min，小心地吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，測定caspase-3 酶活性。

1.2.9 細胞凋亡檢測

使用原位末端標記法 (TUNEL)染色檢測顆粒細胞凋亡情況。操作步驟和方法按照羅氏公司TUNLE試劑盒操作說明書進行。

1.2.10 熒光定量PCR

miRNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒(DP501)。反轉(zhuǎn)錄使用該公司生產(chǎn)的miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR211)，熒光定量PCR檢測使用該公司的miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(FP411)。miR-181a-5p 定量PCR 引物(CD202-0117)和內(nèi)參基因U6引物(CD201-0145)由天根生化科技(北京)有限公司合成。按照TRIzol說明書操作步驟提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A，TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR PremixExTaqⅡ染料法熒光定量試劑盒(RR820A，TaKaRa)進行定量PCR檢測。TGFBR1引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列參考已發(fā)表文獻[18]。熒光定量體系及相關(guān)參數(shù)均參照試劑盒說明書，所得Ct值均通過2-△△Ct法計算其相對表達量。

1.2.11 Western blot 分析

收集顆粒細胞，每孔加100 μL的蛋白裂解液，置冰上裂解20 min，收集至1.5 mL 離心管中，4 ℃下，12 000 r/min，離心10 min。每孔加入20 μg蛋白進行電泳，結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的BSA封閉2 h，分別加入cleaved caspase-3(1∶1 500)、TGFBR1(1∶1 500)和GAPDH(1∶2 000)抗體，4 ℃環(huán)境下過夜，第2天洗膜后加入HRP標記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，CEL顯色液顯影蛋白，使用ImageJ 軟件對檢測結(jié)果進行分析。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSP對體內(nèi)顆粒細胞增殖和miR-181a表達水平的影響

與對照組相比，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3-NP組顆粒細胞中cleaved caspase-3陽性信號較強(圖1)，cleaved caspase-3蛋白表達水平(圖2C)、caspase-3活性(圖2D)均顯著升高(P<0.05)；同時，3-NP組顆粒細胞活力顯著降低(P<0.01，圖2A)，miR-181a表達水平顯著升高(P<0.01，圖2E)。與3-NP組比較，3-NP+GSP組的cleaved caspase-3陽性表達信號(圖1)、cleaved caspase-3蛋白表達水平(圖2C)、caspase-3活性(圖2D)均顯著降低(P<0.05)；同時，3-NP+GSP組的細胞活力顯著升高(P<0.05，圖2A)，miR-181a表達水平顯著降低(P<0.05，圖2E)。這些結(jié)果表明，體內(nèi)補充GSP對卵泡顆粒細胞氧化損傷具有顯著抑制作用，其機制可能與下調(diào)miR-181a表達有關(guān)。

A. Control；B. 3-NP；C. 3-NP+GSP。圖1 Cleaved caspase-3的免疫組化檢測(標尺=100 μm)

A.細胞活力的MTT分析；B、C. Cleaved caspase-3蛋白表達水平及量化分析；D. Caspase-3活性檢測；E. miR-181a的表達變化。與對照組相比，*表示差異顯著(P<0. 05)，**表示差異極顯著(P<0. 01)；與模型組相比，#表示差異顯著(P<0. 05)。下同。圖2 GSP對小鼠卵巢顆粒細胞活力和miR-181a表達水平的影響

2.2 miR-181a對TGFBR1的靶向作用

TGFBR1 3′ UTR序列上存在與 miR-181a互補結(jié)合的位點(圖3A)。與對照組和轉(zhuǎn)染mimics NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-181a mimics極顯著提高了miR-181a的表達水平(P<0.01，圖3B)。與對照組和轉(zhuǎn)染inhibitor NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor極顯著抑制了miR-181a的表達水平(P<0.01，圖3C)。與mimics-NC組相比，TGFBR1-WT與miR-181a共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞48 h后，相對熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；TGFBR1-MUT與miR-181a共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞組的相對熒光素酶活性無顯著變化(圖3D)。與轉(zhuǎn)染NC相比，轉(zhuǎn)染miR-181a mimics顯著抑制了TGFBR1蛋白表達(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor顯著提高了TGFBR1蛋白表達(P<0.05，圖3F)。與對照組相比，H2O2組顆粒細胞活力顯著降低；與H2O2組相比，在H2O2+miR-181a inhibitor組中顆粒細胞活力明顯升高(P<0.05，圖3G)。與對照組相比，H2O2組顆粒細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)；與H2O2組相比，在H2O2+miR-181a inhibitor組中顆粒凋亡率顯著降低(P<0.05，圖3H、3I)。上述結(jié)果表明，miR-181a與TGFBR1存在靶向關(guān)系，氧化應(yīng)激條件下抑制miR-181a表達可顯著改善顆粒細胞活力。

A. 靶向關(guān)系結(jié)合位點預(yù)測；B. 過表達miR-181a對其表達的變化；C. 抑制miR-181a對其表達的變化；D.雙熒光素酶活性分析；E、F. 過表達或抑制miR-181a后，TGFBR1蛋白表達水平；G.抑制miR-181a后，顆粒細胞活力分析；H. 抑制miR-181a后，顆粒細胞凋亡分析(標尺=50 μm)；I. 顆粒細胞凋亡的量化分析。圖3 miR-181a 與TGFBR1靶向作用關(guān)系

2.3 GSPB2對體外顆粒細胞增殖和miR-181a表達的影響

與對照組相比，H2O2氧化損傷組中顆粒細胞miR-181a表達水平和caspase-3活性極顯著升高(P<0.01，圖4A、4B)。同時，TGFBR1的mRNA表達水平明顯下調(diào)(P<0.05，圖4C)，顆粒細胞的活力極顯著降低(P<0.01，圖4D)。與H2O2氧化損傷組比較，H2O2+GSPB2組中miR-181a的表達水平和caspase-3活性顯著降低(P<0.05，圖4A、4B)，且TGFBR1的mRNA表達水平和細胞活力明顯上升(P<0.05，圖4C、4D)。與對照組相比，H2O2組中顆粒細胞凋亡率極顯著增加(P<0.01)；與H2O2組相比，在H2O2+GSPB2組中顆粒凋亡率顯著降低(P<0.05，圖4E、4F)。 上述結(jié)果表明，氧化應(yīng)激條件補充GSPB2可通過抑制miR-181a 調(diào)控TGFBR1表達從而改善顆粒細胞活力。

A. 不同處理中miR-181a表達水平分析；B. 不同處理中caspase-3活性分析；C. 不同處理中TGFBR1 表達分析；D. 不同處理中細胞活力分析；E. 不同處理中顆粒細胞凋亡分析(標尺=50 μm)；F. 凋亡細胞的量化分析。圖4 GSPB2對顆粒細胞活力和miR-181a表達水平的影響

3 討論

在雌性生殖系統(tǒng)中，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)顆粒細胞凋亡，進而導(dǎo)致卵巢功能受損[19]。補充抗氧化劑被認為是通過控制氧化應(yīng)激治療生殖疾病和不育癥的一種可能策略[20]。GSP是葡萄籽原花青素提取物的主要成分，已被證明是一種強有效的自由基清除劑[8]。研究報道，補充GSP可減輕因氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠肝臟細胞損傷[21]，提高人和動物顆粒細胞活性并延緩卵巢衰老[9-10]。Caspase家族在細胞凋亡過程中起著重要作用[22]。本研究利用3-NP誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠卵泡氧化損傷模型[6]，發(fā)現(xiàn)3-NP組顆粒細胞活力顯著低于對照組，同時免疫組化和Western blot檢測cleaved caspase-3蛋白水平，提示卵泡顆粒細胞氧化損傷。當(dāng)體內(nèi)補充GSP進行干預(yù)處理時，顆粒細胞活力明顯上升，caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低，卵泡顆粒細胞氧化損傷明顯減輕，這表明GSP能夠緩解卵泡顆粒細胞氧化損傷，從而提高卵泡發(fā)育質(zhì)量，改善卵巢內(nèi)分泌功能。

miRNA是一類具有負調(diào)控功能的非編碼微小RNA，在各種生理過程或病理過程中具有非常重要的調(diào)控作用[23]。miR-181a是一種存在于人類、小鼠和豬等多種物種中的高度保守的miRNA[13，15]，參與多種細胞的增殖以及凋亡過程，并在細胞的生長代謝中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。miR-181a已被證實對多種細胞的增殖過程起到抑制作用，如Liu等[24]研究表明miR-181a可抑制間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的增殖；Zhang等[2]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可抑制人和小鼠顆粒細胞的增殖。因此下調(diào)miR-181a很可能是一個潛在的細胞氧化損傷的治療策略。本研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)3-NP處理，體外H2O2處理，均可使顆粒細胞中miR-181a表達水平較對照組顯著上調(diào)；而經(jīng)GSP和GSPB2干預(yù)分別能有效對抗3-NP和H2O2處理引起顆粒細胞中miR-181a的上調(diào)，這表明GSP對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)顆粒細胞凋亡的保護作用很可能是通過降低miR-181a的表達來實現(xiàn)的。

TGFBR1是TGF-β/Smad信號通路中的重要成員，在哺乳動物卵泡發(fā)育和排卵過程中發(fā)揮重要作用[13]。Zhou等[25]研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞中TGFBR1表達量與豬卵泡發(fā)育大小呈正相關(guān)；Li等[26]研究表明，多羔湖羊卵巢中TGFBR1的表達水平極顯著高于單羔湖羊，且與排卵數(shù)呈顯著正相關(guān)。我們利用在線軟件TargetScan和miRanda查詢發(fā)現(xiàn)miR-181a與TGFBR1 mRNA 3′UTR存在互補結(jié)合，同時雙熒光素酶報告基因結(jié)果分析顯示，miR-181a與TGFBR1存在靶向關(guān)系；并且進一步證實，轉(zhuǎn)染miR-181a mimics顯著抑制了TGFBR1蛋白的表達，轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor顆粒細胞活力較H2O2組明顯升高，以上結(jié)果表明miR-181a通過靶向抑制TGFBR1表達，進而影響了顆粒細胞增殖活性。

綜上所述，氧化應(yīng)激條件下GSP可能下調(diào)miR-181a表達，從而激活miR-181a的靶蛋白TGFBR1及其介導(dǎo)的下游相關(guān)信號通路分子，發(fā)揮對顆粒細胞氧化損傷的保護作用。