盧清俠，王獻偉，馬強，陳俊峰，高彬文，邢寶松，張家慶*，任巧玲*

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調控重點實驗室，河南 鄭州 450002；2. 河南省畜牧技術推廣總站，河南 鄭州 450008)

在哺乳動物和人類，70.0%～99.9%的卵泡在發(fā)育的不同階段發(fā)生閉鎖[1]。研究表明，顆粒細胞凋亡是導致卵泡閉鎖的重要原因，并先后在多種動物中得到證實[2-3]。體內外各種刺激可誘發(fā)卵泡微環(huán)境產(chǎn)生活性氧簇物質(reactive oxygen species，ROS)。低濃度的ROS是重要的第二信使，可調控基因的表達；而高濃度的 ROS可導致重要細胞器和DNA的不可逆損傷，最終導致細胞凋亡[4]。大量研究表明，氧化應激誘導劑，如3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid，3-NP)、化療藥物、多環(huán)芳香烴等能夠有效誘導有腔卵泡閉鎖[5-6]，而在卵泡閉鎖前可首先檢測到ROS水平的顯著上升，并且這些因素誘導的凋亡均能為抗氧化劑所抑制[7]。葡萄籽提取物原花青素(grape seed procyanidins，GSP)是從葡萄籽中提取的一種機體內不能合成的新型高效天然抗氧化劑物質[8]。在人和動物研究發(fā)現(xiàn)，補充GSP能有效抑制卵巢氧化損傷，從而提高了顆粒細胞活性，但GSP保護顆粒細胞氧化損傷的作用機制尚不明確[9-10]。

微RNA (miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動物中參與轉錄后基因表達調控[11]。miRNA可通過調節(jié)線粒體代謝來影響細胞ROS水平[12]，也可通過調控細胞增殖和分化的關鍵因子[13]。miRNA表達異常也與多種生殖性疾病密切相關，如多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)等[14]。miR-181a是miR-181家族成員之一，已被證實是一種應激性miRNA[2，15]，可通過對相關基因的調節(jié)發(fā)揮抗氧化作用，如miR-181a可以間接調控叉頭框蛋白O1(forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)基因表達來減輕小鼠顆粒細胞氧化損傷[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是GSP的新靶標，GSP可調節(jié)肝、腎臟等相關疾病中致病性miRNA的表達[16]。卵泡的異常閉鎖與氧化應激密切相關，探討GSP是否可以通過對miRNA的調節(jié)來發(fā)揮抗氧化作用，具有理論和實際意義。本研究從體內和體外水平探究GSP對氧化應激誘導顆粒細胞損傷的作用及miR-181a表達的影響，以期揭示其作用機制，為新藥物研發(fā)和臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

3周齡KM雌性小鼠購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場；GSP購自天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；原花青素 B2(GSPB2)、熒光素酶報告載體、熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國 Sigma 公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國 GIBCO 公司；H2O2(30%，AR 級)購自上海國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液購自北京索萊寶科技有限公司；miR-181a模擬物(miR-181a mimics)、mimic陰性對照(mimics NC)、miR-181a 抑制劑(miR-181a inhibitor)、inhibitor陰性對照(inhibitor NC)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；miR-181a、U6引物序列由天根生化科技(北京)有限公司設計合成；miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；活化的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3，#9661)購自Cell Signaling Technology公司；TGF-β受體Ⅰ(TGFBR1，ab31013)購自Abcam公司；GAPDH(10494-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性檢測試劑盒、四甲基偶氮唑鹽 (methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自寧波第二激素廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組與處理

所有動物適應1周環(huán)境后隨機分成3組：對照(Control)組、3-NP組、GSP+3-NP組，每組10只。Control組小鼠每日8：00和20：00腹腔內注射0.1 mL生理鹽水，連續(xù)7 d；3-NP組小鼠每日同時間腹腔注射0.1 mL的3-NP(25 mg/kg)[6]，連續(xù)7 d；GSP+3-NP組提前1周飼喂含有GSP的飼料(在小鼠的基礎日糧中按照200 mg/kg比例添加GSP制成)，飼喂至試驗結束，試驗開始后每日同時間腹腔注射0.1 mL的3-NP，連續(xù)7 d。GSP的劑量和處理時間參照文獻[17]。試驗結束后，所有動物頸部脫臼處死，采集相應小鼠卵巢和卵泡顆粒細胞。

1.2.2 免疫組化分析

首先將收集的不同組別的小鼠卵巢用4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、蠟塊連續(xù)切片、常規(guī)脫蠟至水；高壓進行抗原修復15 min，PBS洗3次，每次5 min，進行抗原修復；用3% H2O2室溫孵育15 min，PBS清洗 3次，每次5 min，以阻斷內源性過氧化物酶；用吸水紙擦干載玻片，滴加正常山羊血清室溫封閉15 min；滴加cleaved caspase-3抗體，4 ℃過夜，PBS 洗 3 次后加入生物素標記的二抗，室溫孵育30 min，PBS清洗 3次，每次5 min，滴加新鮮配制的3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，室溫孵育3～5 min，光學顯微鏡下觀察染色結果。

1.2.3 細胞分離與培養(yǎng)

3周齡KM雌性小鼠每只腹腔內注射10 U的PMSG，48 h后頸椎脫臼處死，在無菌條件下使用眼科鑷子和剪刀迅速取出雙側卵巢，用預熱的PBS(37 ℃)清洗3次，在體視顯微鏡下使用1 mL注射器針頭去除其周圍脂肪和被膜，再用新的1 mL注射器針頭刺破卵泡使顆粒細胞和卵母細胞釋放出來，加入預熱(37 ℃)平衡好的培養(yǎng)基 (DMEM/F12培養(yǎng)基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+10% FBS)重懸，調整細胞密度后接種于培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.4 細胞轉染

將分離后重懸的小鼠顆粒細胞接種于12孔板或96孔板中，分為5組：對照(Control)組，進行正常培養(yǎng)；miR-181a mimics轉染組，加入 miR-181a mimic；mimics NC組，加入mimic NC；miR-181a inhibitor轉染組，加入miR-181a inhibitor；inhibitor NC組，加入inhibitor NC。參照 Lipofectamine 3000 說明書進行轉染，當細胞生長密度為70%～80%時，棄去孔中的培養(yǎng)基，加入相對應的轉染試劑。轉染48 h后，部分顆粒細胞用于檢測miR-181a和TGFBR1表達水平，部分細胞用于細胞活力檢測。上述序列均由上海吉瑪公司合成，其序列分別為miR-181a mimics：5′-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3′，5′-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUUU-3′；mimic NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-181a inhibitor：5′-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU-3′；inhibitor NC：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.2.5 雙熒光素酶活性檢測

根據(jù)TargetScan和miRanda 數(shù)據(jù)庫預測顯示，miR-181a與TGFBR1存在靶向關系，TGFBR1是 miR-181a 的靶基因，二者存在結合序列區(qū)域，分別構建野生型(wild type，WT)TGFBR1-3′UTR-WT和突變型(mutant type，MUT)TGFBR1-3′UTR-MUT質粒，取人胚胎腎上皮細胞系(HEK 293T)細胞種入24 孔板中，取構建質粒與miR-181a mimics、miR-181a NC共轉染 HEK 293T 細胞48 h，按照說明書要求制備顆粒細胞提取物，測定各組熒光素酶活性。

1.2.6 GSPB2干預處理

用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)的顆粒細胞，用含血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔2 500個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，至細胞單層鋪滿孔底。具體分組為：對照(Control)組，添加新的DMEM/F12+5% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；GSPB2組，更換新培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L GSPB2繼續(xù)培養(yǎng)12 h；H2O2組，更換新培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為 150 μmol/L H2O2培養(yǎng)12 h；GSPB2+H2O2組，在新的培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μmol/L GSPB2培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為150 μmol/L H2O2培養(yǎng)12 h。上述藥物使用濃度和處理時間參照已發(fā)表文獻[8-9]，試驗結束后收集細胞樣品，部分樣品用于檢測miR-181a和TGFBR1表達水平，部分用于檢測caspase-3活性和細胞活力。

1.2.7 細胞活力測定

將細胞接種于96 孔板中，密度為每孔2 500個細胞，每組設置6個平行孔，置37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～48 h。在每個孔中加入 20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，棄上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，利用酶標儀測定570 nm波長處各孔的吸光度(OD)值。

1.2.8 Caspase-3活性分析

將細胞懸液全部收集到1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，PBS清洗1次，吸取上清液后，按照每200萬細胞加入50 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解30 min，期間渦旋振蕩3～4次，每次10 s。在4 ℃環(huán)境下，12 000 r/min離心10 min，小心地吸取上清液轉移至新的離心管中，測定caspase-3 酶活性。

1.2.9 細胞凋亡檢測

使用原位末端標記法 (TUNEL)染色檢測顆粒細胞凋亡情況。操作步驟和方法按照羅氏公司TUNLE試劑盒操作說明書進行。

1.2.10 熒光定量PCR

miRNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute miRNA提取分離試劑盒(DP501)。反轉錄使用該公司生產(chǎn)的miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR211)，熒光定量PCR檢測使用該公司的miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(FP411)。miR-181a-5p 定量PCR 引物(CD202-0117)和內參基因U6引物(CD201-0145)由天根生化科技(北京)有限公司合成。按照TRIzol說明書操作步驟提取RNA，用逆轉錄試劑盒(RR047A，TaKaRa)進行反轉錄，使用SYBR PremixExTaqⅡ染料法熒光定量試劑盒(RR820A，TaKaRa)進行定量PCR檢測。TGFBR1引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列參考已發(fā)表文獻[18]。熒光定量體系及相關參數(shù)均參照試劑盒說明書，所得Ct值均通過2-△△Ct法計算其相對表達量。

1.2.11 Western blot 分析

收集顆粒細胞，每孔加100 μL的蛋白裂解液，置冰上裂解20 min，收集至1.5 mL 離心管中，4 ℃下，12 000 r/min，離心10 min。每孔加入20 μg蛋白進行電泳，結束后將目的蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的BSA封閉2 h，分別加入cleaved caspase-3(1∶1 500)、TGFBR1(1∶1 500)和GAPDH(1∶2 000)抗體，4 ℃環(huán)境下過夜，第2天洗膜后加入HRP標記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，CEL顯色液顯影蛋白，使用ImageJ 軟件對檢測結果進行分析。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 GSP對體內顆粒細胞增殖和miR-181a表達水平的影響

與對照組相比，免疫組化結果發(fā)現(xiàn)在3-NP組顆粒細胞中cleaved caspase-3陽性信號較強(圖1)，cleaved caspase-3蛋白表達水平(圖2C)、caspase-3活性(圖2D)均顯著升高(P<0.05)；同時，3-NP組顆粒細胞活力顯著降低(P<0.01，圖2A)，miR-181a表達水平顯著升高(P<0.01，圖2E)。與3-NP組比較，3-NP+GSP組的cleaved caspase-3陽性表達信號(圖1)、cleaved caspase-3蛋白表達水平(圖2C)、caspase-3活性(圖2D)均顯著降低(P<0.05)；同時，3-NP+GSP組的細胞活力顯著升高(P<0.05，圖2A)，miR-181a表達水平顯著降低(P<0.05，圖2E)。這些結果表明，體內補充GSP對卵泡顆粒細胞氧化損傷具有顯著抑制作用，其機制可能與下調miR-181a表達有關。

A. Control；B. 3-NP；C. 3-NP+GSP。圖1 Cleaved caspase-3的免疫組化檢測(標尺=100 μm)

A.細胞活力的MTT分析；B、C. Cleaved caspase-3蛋白表達水平及量化分析；D. Caspase-3活性檢測；E. miR-181a的表達變化。與對照組相比，*表示差異顯著(P<0. 05)，**表示差異極顯著(P<0. 01)；與模型組相比，#表示差異顯著(P<0. 05)。下同。圖2 GSP對小鼠卵巢顆粒細胞活力和miR-181a表達水平的影響

2.2 miR-181a對TGFBR1的靶向作用

TGFBR1 3′ UTR序列上存在與 miR-181a互補結合的位點(圖3A)。與對照組和轉染mimics NC組相比，轉染miR-181a mimics極顯著提高了miR-181a的表達水平(P<0.01，圖3B)。與對照組和轉染inhibitor NC組相比，轉染miR-181a inhibitor極顯著抑制了miR-181a的表達水平(P<0.01，圖3C)。與mimics-NC組相比，TGFBR1-WT與miR-181a共轉染HEK-293T細胞48 h后，相對熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)；TGFBR1-MUT與miR-181a共轉染HEK-293T細胞組的相對熒光素酶活性無顯著變化(圖3D)。與轉染NC相比，轉染miR-181a mimics顯著抑制了TGFBR1蛋白表達(P<0.05)，而轉染miR-181a inhibitor顯著提高了TGFBR1蛋白表達(P<0.05，圖3F)。與對照組相比，H2O2組顆粒細胞活力顯著降低；與H2O2組相比，在H2O2+miR-181a inhibitor組中顆粒細胞活力明顯升高(P<0.05，圖3G)。與對照組相比，H2O2組顆粒細胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)；與H2O2組相比，在H2O2+miR-181a inhibitor組中顆粒凋亡率顯著降低(P<0.05，圖3H、3I)。上述結果表明，miR-181a與TGFBR1存在靶向關系，氧化應激條件下抑制miR-181a表達可顯著改善顆粒細胞活力。

A. 靶向關系結合位點預測；B. 過表達miR-181a對其表達的變化；C. 抑制miR-181a對其表達的變化；D.雙熒光素酶活性分析；E、F. 過表達或抑制miR-181a后，TGFBR1蛋白表達水平；G.抑制miR-181a后，顆粒細胞活力分析；H. 抑制miR-181a后，顆粒細胞凋亡分析(標尺=50 μm)；I. 顆粒細胞凋亡的量化分析。圖3 miR-181a 與TGFBR1靶向作用關系

2.3 GSPB2對體外顆粒細胞增殖和miR-181a表達的影響

與對照組相比，H2O2氧化損傷組中顆粒細胞miR-181a表達水平和caspase-3活性極顯著升高(P<0.01，圖4A、4B)。同時，TGFBR1的mRNA表達水平明顯下調(P<0.05，圖4C)，顆粒細胞的活力極顯著降低(P<0.01，圖4D)。與H2O2氧化損傷組比較，H2O2+GSPB2組中miR-181a的表達水平和caspase-3活性顯著降低(P<0.05，圖4A、4B)，且TGFBR1的mRNA表達水平和細胞活力明顯上升(P<0.05，圖4C、4D)。與對照組相比，H2O2組中顆粒細胞凋亡率極顯著增加(P<0.01)；與H2O2組相比，在H2O2+GSPB2組中顆粒凋亡率顯著降低(P<0.05，圖4E、4F)。 上述結果表明，氧化應激條件補充GSPB2可通過抑制miR-181a 調控TGFBR1表達從而改善顆粒細胞活力。

A. 不同處理中miR-181a表達水平分析；B. 不同處理中caspase-3活性分析；C. 不同處理中TGFBR1 表達分析；D. 不同處理中細胞活力分析；E. 不同處理中顆粒細胞凋亡分析(標尺=50 μm)；F. 凋亡細胞的量化分析。圖4 GSPB2對顆粒細胞活力和miR-181a表達水平的影響

3 討論

在雌性生殖系統(tǒng)中，氧化應激可誘導顆粒細胞凋亡，進而導致卵巢功能受損[19]。補充抗氧化劑被認為是通過控制氧化應激治療生殖疾病和不育癥的一種可能策略[20]。GSP是葡萄籽原花青素提取物的主要成分，已被證明是一種強有效的自由基清除劑[8]。研究報道，補充GSP可減輕因氧化應激誘導的小鼠肝臟細胞損傷[21]，提高人和動物顆粒細胞活性并延緩卵巢衰老[9-10]。Caspase家族在細胞凋亡過程中起著重要作用[22]。本研究利用3-NP誘導構建小鼠卵泡氧化損傷模型[6]，發(fā)現(xiàn)3-NP組顆粒細胞活力顯著低于對照組，同時免疫組化和Western blot檢測cleaved caspase-3蛋白水平，提示卵泡顆粒細胞氧化損傷。當體內補充GSP進行干預處理時，顆粒細胞活力明顯上升，caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低，卵泡顆粒細胞氧化損傷明顯減輕，這表明GSP能夠緩解卵泡顆粒細胞氧化損傷，從而提高卵泡發(fā)育質量，改善卵巢內分泌功能。

miRNA是一類具有負調控功能的非編碼微小RNA，在各種生理過程或病理過程中具有非常重要的調控作用[23]。miR-181a是一種存在于人類、小鼠和豬等多種物種中的高度保守的miRNA[13，15]，參與多種細胞的增殖以及凋亡過程，并在細胞的生長代謝中發(fā)揮關鍵的調控作用。miR-181a已被證實對多種細胞的增殖過程起到抑制作用，如Liu等[24]研究表明miR-181a可抑制間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的增殖；Zhang等[2]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可抑制人和小鼠顆粒細胞的增殖。因此下調miR-181a很可能是一個潛在的細胞氧化損傷的治療策略。本研究發(fā)現(xiàn)，體內3-NP處理，體外H2O2處理，均可使顆粒細胞中miR-181a表達水平較對照組顯著上調；而經(jīng)GSP和GSPB2干預分別能有效對抗3-NP和H2O2處理引起顆粒細胞中miR-181a的上調，這表明GSP對氧化應激誘導顆粒細胞凋亡的保護作用很可能是通過降低miR-181a的表達來實現(xiàn)的。

TGFBR1是TGF-β/Smad信號通路中的重要成員，在哺乳動物卵泡發(fā)育和排卵過程中發(fā)揮重要作用[13]。Zhou等[25]研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞中TGFBR1表達量與豬卵泡發(fā)育大小呈正相關；Li等[26]研究表明，多羔湖羊卵巢中TGFBR1的表達水平極顯著高于單羔湖羊，且與排卵數(shù)呈顯著正相關。我們利用在線軟件TargetScan和miRanda查詢發(fā)現(xiàn)miR-181a與TGFBR1 mRNA 3′UTR存在互補結合，同時雙熒光素酶報告基因結果分析顯示，miR-181a與TGFBR1存在靶向關系；并且進一步證實，轉染miR-181a mimics顯著抑制了TGFBR1蛋白的表達，轉染miR-181a inhibitor顆粒細胞活力較H2O2組明顯升高，以上結果表明miR-181a通過靶向抑制TGFBR1表達，進而影響了顆粒細胞增殖活性。

綜上所述，氧化應激條件下GSP可能下調miR-181a表達，從而激活miR-181a的靶蛋白TGFBR1及其介導的下游相關信號通路分子，發(fā)揮對顆粒細胞氧化損傷的保護作用。