薛姣姣 顧晶 張棋 周明生 姚陽(yáng) 蔡瑞平 徐茜 徐志華 賈輝 張璐

心肌梗死是全球發(fā)病率和死亡率的主要原因[1]。隨著藥物治療的應(yīng)用越來(lái)越多以及幾種冠狀動(dòng)脈再灌注策略的出現(xiàn)，急性心肌梗死的治療、護(hù)理和預(yù)防取得了顯著進(jìn)展。心肌梗死的病理生理機(jī)制包括心肌細(xì)胞凋亡、炎癥、鈣超載和活性氧（reactive oxygen species，ROS）相關(guān)損傷也逐漸被揭示，但很少闡明循證策略來(lái)預(yù)防心肌梗死損傷[2]。因此，需要深入探索心肌梗死發(fā)生機(jī)制，尋找診斷、預(yù)防、治療心肌梗死的新靶點(diǎn)。心肌梗死發(fā)生后引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，較短時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以對(duì)細(xì)胞起到一定的修復(fù)和緩解作用，而持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會(huì)引起不可逆的細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白的同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（glucoseregulated protein 94，GRP94）等均參與心肌梗死過(guò)程[3-4]。尋找抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度發(fā)生的方法可以作為心肌梗死治療的有效手段。緣區(qū)B 和B1 細(xì)胞特異性蛋白（marginal zone B and B1 cell specific protein，Mzb1）是一種B 細(xì)胞特異性編碼蛋白，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下作為底物特異性伴侶GRP94 的輔助伴侶發(fā)揮作用，并參與對(duì)整合素β1的激活[5-6]。此前，關(guān)于Mzb1 作用的研究主要集中在免疫性疾病、癌癥和慢性淋巴細(xì)胞白血病[7-8]。然而，Mzb1 是否在其他炎癥性疾病中發(fā)揮重要的作用一直受到質(zhì)疑。前期研究顯示，心肌梗死組織中Mzb1 的表達(dá)下降，沉默Mzb1 會(huì)加重心肌細(xì)胞損傷，過(guò)表達(dá)Mzb1 可以恢復(fù)線粒體功能改善心肌損傷[9]?；谇捌诘难芯?，本實(shí)驗(yàn)探索Mzb1 對(duì)過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子及凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人永生化心肌細(xì)胞（AC16）由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供。高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Cytiva 公司；牛血清白蛋白、青鏈霉素雙抗混合液、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二 苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT] 檢 測(cè) 試 劑 盒、luriabertani（LB）培養(yǎng)基與氨芐青霉素鈉（ampicillin）購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司；胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化液購(gòu)于天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；超敏化學(xué)發(fā)光底物（enhanced chemiluminescent，ECL）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Mzb1 一抗抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司；GRP94、CHOP、Caspase3 以及3- 磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗抗體購(gòu)于武漢Proteintech 公司；Mzb1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（氨芐霉素抗性）購(gòu)于武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine?3 000 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)愛(ài)思進(jìn)公司。

1.2 方法

此文的研究體現(xiàn)了《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[10]的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.1 AC16 細(xì)胞培養(yǎng)

AC16 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及1%青鏈霉素雙抗的高糖完全培養(yǎng)基中（dulbecco's modified eagle medium，DMEM），置于含有37℃、5%CO2和95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將混懸細(xì)胞分別接種于6 孔板及96 孔板，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。加入終濃度為200 μmol/L 的H2O2或等體積高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

1.2.2 Mzb1 質(zhì)粒擴(kuò)增

取10 μL 質(zhì)粒與100 μL 感受態(tài)細(xì)菌混勻后冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，立即置冰上放置2 min，加入預(yù)熱至室溫的400 μL LB 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)1 h，4 000 rpm 離心1 min，棄去400 μL 培養(yǎng)上清，剩余100 μL 用移液器混勻后均勻涂布于含100 μg/mL Ampicillin 抗性的LB 平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取3 個(gè)單菌落接種于含5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB 培養(yǎng)液中，250 rpm，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒按照步驟抽提質(zhì)粒，采用微量分光光度計(jì)測(cè)量濃度，稀釋質(zhì)粒濃度約500 ng/μL，-20℃保存。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將AC16 細(xì)胞按照1.0×105/ 孔的密度接種與6 孔板，培養(yǎng)12 h；待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～90%后，根據(jù)Lipofectamine?3 000 說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，制備質(zhì)粒DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物至細(xì)胞；放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞用于進(jìn)一步的檢測(cè)。

1.2.4 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力

將AC16 細(xì)胞按照3.0×103/孔接種于96 孔板，培養(yǎng)12 h；按照細(xì)胞分組處理細(xì)胞；設(shè)置分組：對(duì)照組、H2O2組、Mzb1+H2O2組；用5 mg/mL MTT（20 μL/孔）處理細(xì)胞4 h。小心地吸出DMEM 保留結(jié)晶，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（150 μL/孔），室溫狀態(tài)下放置水平搖床10 min；使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)的吸光度值。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Mzb1、GRP94、CHOP、Cleaved-caspase3 蛋白水平的變化情況

將細(xì)胞接種于6 孔板培養(yǎng)12 h；按照細(xì)胞分組處理細(xì)胞；設(shè)置分組：對(duì)照組、H2O2組、Mzb1+H2O2組；采用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，超聲離心后，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）法檢測(cè)蛋白濃度，將樣品標(biāo)準(zhǔn)化濃度后，100℃變性7 min。配制SDS-PAGE 凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5% BSA 室溫?fù)u床封閉1 h。加入Mzb1（1 ∶500）、GRP94（1 ∶500）、CHOP（1 ∶500）、Caspase3（1 ∶500）、GAPDH（1 ∶2 000）一抗，于4℃孵育過(guò)夜。次日TBST 洗膜后用二抗（1 ∶4 000）孵育1 h，再次洗膜后用ECL 顯影，并采用ImageJ 軟件進(jìn)行分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量＝目的蛋白灰度值/ 內(nèi)參灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Prism 8.4.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2 損傷心肌細(xì)胞的活力

當(dāng)AC16 細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右，分別給予各組細(xì)胞200 μmol/L H2O2或體積高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，采用MTT 檢測(cè)各組的細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞活力為（100.000±8.767）%，H2O2組細(xì)胞活力為（33.250±4.956）%；與對(duì)照組相比，H2O2處理的AC16 心肌細(xì)胞活力明顯降低（t＝3.896，P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 H2O2 處理后對(duì)AC16 細(xì)胞活力的影響

2.2 H2O2 引起心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

接下來(lái)，檢測(cè)H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平變化。采用WB 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP94 以及CHOP的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在對(duì)照組細(xì)胞中，GRP94 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.000±0.000），在H2O2組中，GRP94 的蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.713±0.046）；在對(duì)照組細(xì)胞中，CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.000±0.000），在H2O2組中CHOP 的蛋白相對(duì)表達(dá)量為（2.512±0.553）；與對(duì)照相比，H2O2處理后引起細(xì)胞內(nèi)GRP94（t＝15.660，P＜0.05）以及CHOP（t＝2.736，P＜0.05）蛋白表達(dá)量明顯升高。見(jiàn)圖2。

圖2 H2O2 引起AC16 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生

2.3 H2O2 引起AC16 心肌細(xì)胞Mzb1 表達(dá)下調(diào)

WB 檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組內(nèi)Mzb1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.000±0.000），H2O2處理的AC16 細(xì)胞中Mzb1 的蛋白相對(duì)表達(dá)水平為（0.455±0.066）。H2O2處理后引起細(xì)胞內(nèi)Mzb1 的表達(dá)顯著下降（t＝16.490，P＜0.05）。Mzb1 可能在H2O2引起的氧化應(yīng)激過(guò)程中扮演重要角色。見(jiàn)圖3。

圖3 H2O2 對(duì)AC16 細(xì)胞內(nèi)Mzb1 表達(dá)的影響

2.4 過(guò)表達(dá)Mzb1 改善AC16 細(xì)胞活力

MTT 檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示，對(duì)照組相對(duì)細(xì)胞活 力 為（100.000±3.420）%，H2O2組 細(xì) 胞 相 對(duì) 活 力為（29.870±4.129）%，Mzb1+H2O2組相對(duì)細(xì)胞活力為（73.000±12.860）%；與對(duì)照組相比，H2O2引起細(xì)胞活力下降（t＝12.380，P＜0.01），與H2O2處理組相比，Mzb1過(guò)表達(dá)顯著改善由H2O2處理后的細(xì)胞活力（t＝3.193，P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 Mzb1 對(duì)AC16 細(xì)胞活力的影響

2.5 過(guò)表達(dá)Mzb1 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

WB 結(jié)果顯示，對(duì)照組內(nèi)GRP94 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.000±0.000），H2O2組GRP94 相對(duì)表達(dá)量對(duì)為（1.647±0.086），Mzb1+H2O2組GRP94 相對(duì)表達(dá)量對(duì)為（1.056±0.050）；對(duì)照組內(nèi)CHOP 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.000±0.000），H2O2組CHOP 相對(duì)表達(dá)量對(duì)為（3.648±0.725），Mzb1+H2O2組CHOP相對(duì)表達(dá)量對(duì)為（2.484±0.273）；與對(duì)照組相比，H2O2處理的細(xì)胞中GRP94及CHOP表達(dá)顯著升高（t＝7.486，P＜0.05；t＝3.654，P＜0.01）；與H2O2組相比，Mzb1 過(guò)表達(dá)降低了GRP94 及CHOP 的表達(dá)水平（t＝7.635，P＜0.05；t＝2.577，P＜0.05）。Mzb1 過(guò)表達(dá)可以抑制H2O2引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。見(jiàn)圖5。

圖5 Mzb1 對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6 過(guò)表達(dá)Mzb1 抑制H2O2 引起的細(xì)胞凋亡

WB 結(jié)果顯示，對(duì)照組內(nèi)活化型的Caspsase3（Cleaved-Caspase3）蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.000±0.000），H2O2組Cleaved-Caspase3 相對(duì)表達(dá)量為（2.196±0.237），Mzb1+H2O2組Cleaved-Caspase3 相對(duì)表達(dá)量為（1.197±0.165）；與對(duì)照組相比，在H2O2處理的細(xì)胞中，Cleaved-Caspase3 水平升高（t＝5.042，P＜0.05）；過(guò)表達(dá)Mzb1 后，Cleaved-Caspase3 水平降低（t＝6.886，P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 過(guò)表達(dá)Mzb1 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

前期研究表明，在急性心肌梗死損傷的組織和心肌細(xì)胞中，Mzb1 的表達(dá)異常降低，恢復(fù)其表達(dá)可以降低心肌細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，增加腺嘌呤核苷三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）含量，恢復(fù)線粒體膜電位，增加細(xì)胞耗氧量進(jìn)而恢復(fù)線粒體功能；同時(shí)減輕心肌梗死損傷心肌細(xì)胞內(nèi)炎癥，改善心臟功能表明Mzb1 在心肌損傷過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)[9]。有研究報(bào)道，Mzb1 調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答與抗體產(chǎn)生的過(guò)程，Mzb1 與底物特異性伴侶GRP94 直接作用，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的免疫球蛋白重鏈（immunoglobulin μ heavy chains，μHCs）生物合成，這表明Mzb1 是GRP94的底物特異性伴侶蛋白，可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中發(fā)揮重要作用[5，11]。因此推斷，Mzb1 可能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑影響細(xì)胞功能。

氧化應(yīng)激和缺血會(huì)擾亂鈣穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白積累，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。以往的研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡與心肌梗死損傷密切相關(guān)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路。此外，細(xì)胞凋亡的特征是染色質(zhì)濃縮和分離，細(xì)胞皺縮，碎裂成凋亡小體，可被巨噬細(xì)胞清除[12]。雖然凋亡和壞死的信號(hào)通路不同，但它們涉及相同的步驟，如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）的激活[13]。在調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路中，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡信號(hào)已被認(rèn)為是心肌梗死損傷的重要機(jī)制之一[14]。已有文獻(xiàn)表明，在缺血或缺血再灌注后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被激活，持續(xù)發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP94 是熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）的同源蛋白，在生理?xiàng)l件下主要介導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。它們的表達(dá)水平與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管理未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的能力相關(guān)[16-17]。因此，GRP94 被廣泛認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物。嚴(yán)重的缺血缺氧可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加，心肌梗死后GRP94 表達(dá)增加[18]。這些發(fā)現(xiàn)是與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致，結(jié)果顯示H2O2誘導(dǎo)的損傷細(xì)胞模型中GRP94 表達(dá)增高，而在過(guò)表達(dá)Mzb1 后GRP94 的表達(dá)水平有下降。因此，結(jié)果表明Mzb1 的基因表達(dá)上調(diào)有助于抑制心肌細(xì)胞損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平。

此外，Caspase12 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜中，它作為一種主酶發(fā)揮著特殊的作用，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡通路。與Caspase9 共同作用，反過(guò)來(lái)激活Caspase3，細(xì)胞凋亡執(zhí)行者Caspsase3 屬于半胱氨酸蛋白水解酶家族，其被激活后經(jīng)剪切分離成活化型的Caspsase3（Cleaved-Caspase3），引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，心肌細(xì)胞損傷后CHOP 的表達(dá)也明顯升高[19]。CHOP 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。CHOP 還可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，激活Caspase3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。有報(bào)道指出，沉默CHOP基因可以減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)的損傷細(xì)胞模型CHOP 的表達(dá)上調(diào)，而在過(guò)表達(dá)Mzb1 后CHOP 的表達(dá)水平有下降。這表明Mzb1 過(guò)表達(dá)可以抑制心肌細(xì)胞損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Mzb1 能改善H2O2引起的心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少Cleaved-caspase3 的激活，減少心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)。