李豐鈺 黃 平 鄭勇奇, 李長(zhǎng)紅 張雨婷 薛克娜 宗亦臣 趙鴻杰

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院 青島 266109；2. 國(guó)家林業(yè)和草原局植物新品種分子測(cè)定實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091；3. 佛山市林業(yè)科學(xué)研究所 佛山 528234）

山茶屬（Camellia）為常綠灌木或者小喬木，約有280 種，原產(chǎn)于東南亞，從喜馬拉雅山到日本，從中國(guó)南部（廣西和云南）到爪哇島和蘇門(mén)答臘島均有自然分布（Liet al., 2021）。茶花（山茶花）是具有觀賞價(jià)值的山茶屬植物的統(tǒng)稱(chēng)，茶花主要包括山茶（Camellia japonica）、滇山茶（Camellia reticulata）、茶梅（Camellia sasanqua）、金花茶（Camellia nitidissima）等種及其品種，性狀類(lèi)型豐富，涵蓋生長(zhǎng)類(lèi)型、花色、花型等觀賞性狀和耐寒、耐熱、耐鹽堿等適應(yīng)性狀。茶花因其具有較高的園藝觀賞價(jià)值而在世界各地被廣泛栽培，目前全球有記錄的山茶屬品種名超過(guò)5.1 萬(wàn)個(gè)（https://camellia.iflora.cn），隨著植物育種的發(fā)展導(dǎo)致品種數(shù)量繁多，其中存在大量同物異名和同名異物的現(xiàn)象，部分品種間的性狀差異較小，遺傳背景相似，為品種的鑒別帶來(lái)很大困難，不利于品種管理與保護(hù)，影響山茶屬植物育種產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展（張亞利等, 2016，張旻桓等, 2018；潘麗芹等, 2019）。

由于山茶屬品種觀賞價(jià)值高，無(wú)性繁殖容易，可為育種者和生產(chǎn)者帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)利益，因此品種侵權(quán)時(shí)有發(fā)生，而品種鑒別和維權(quán)難度較大（陶乃奇等,2019）。目前山茶屬品種鑒別主要采用基于形態(tài)性狀的特異性、一致性、穩(wěn)定性（DUS）測(cè)試方法（張曉慶,2008），利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別山茶屬品種尚處于研究階段（申屠文月等, 2006；張景榮等, 2006）。DUS 測(cè)試存在成本高、周期長(zhǎng)且易受環(huán)境和人為因素影響等問(wèn)題，侵權(quán)證據(jù)難找、維權(quán)難度大，在處理品種侵權(quán)糾紛中的應(yīng)用十分受限（李汝玉等, 2007）。SSR（簡(jiǎn)單序列重復(fù)）分子標(biāo)記是國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）推薦的可用于輔助植物品種鑒別的分子標(biāo)記技術(shù)之一，SSR 分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、測(cè)試周期短、對(duì)DNA 質(zhì)量要求不嚴(yán)等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此在植物品種鑒別上的應(yīng)用日趨廣泛（王玲玲等, 2017）。

已公布的SSR 分子標(biāo)記位點(diǎn)在品種類(lèi)群通用性、擴(kuò)增結(jié)果重復(fù)性和位點(diǎn)多態(tài)性信息含量（polymorphism information content, PIC）等方面參差不齊并且差異較大，而多態(tài)性高、重復(fù)性好、通用性強(qiáng)等的SSR 位點(diǎn)是應(yīng)用分子標(biāo)記輔助植物品種鑒別的基礎(chǔ)，因此SSR 分子標(biāo)記位點(diǎn)的篩選尤為重要。前人對(duì)品種鑒別能力的分析評(píng)價(jià)往往是基于單個(gè)位點(diǎn)，而單個(gè)位點(diǎn)對(duì)品種的鑒別效率不高，多個(gè)位點(diǎn)組合可能會(huì)達(dá)到更好的品種鑒別效果，因此開(kāi)展SSR 位點(diǎn)組合品種鑒別能力的分析評(píng)價(jià)研究十分必要。

基于累積鑒別力（TDP）是較為常用的評(píng)價(jià)分子標(biāo)記位點(diǎn)組合的鑒別能力的統(tǒng)計(jì)方法（Jones, 1972），品種鑒別力（VDP）是新提出的可用于分析評(píng)價(jià)分子標(biāo)記位點(diǎn)組合的品種鑒別能力的統(tǒng)計(jì)方法，具有無(wú)群體偏好，敏感度高等特點(diǎn)，其包括3 種評(píng)價(jià)植物品種鑒別力的統(tǒng)計(jì)方法：基于概率的品種鑒別力（P-VDP）、基于比較的品種鑒別力（C-VDP）和基于比率的品種鑒別力（R-VDP）。目前，該統(tǒng)計(jì)方法已在高粱（Sorghum bicolor）、 玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）等農(nóng)作物品種的分子標(biāo)記位點(diǎn)組合品種鑒別能力分析評(píng)價(jià)工作中有初步應(yīng)用（Yanget al., 2021）。

為了獲得可用于山茶屬品種鑒別和位點(diǎn)組合品種鑒別能力分析評(píng)價(jià)的SSR 分子標(biāo)記位點(diǎn)，本研究搜集、整理了已公布的76 個(gè)山茶屬SSR 分子標(biāo)記位點(diǎn)，以山茶屬品種為實(shí)驗(yàn)材料，包括紅山茶組（Sect．Camellia）品種（84 個(gè)）、金花茶組（Sect．Chrysantha）無(wú)性系（27 個(gè)），其中紅山茶組品種主要包含山茶和滇山茶，金花茶組無(wú)性系包含金花茶。結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性分析和位點(diǎn)組合VDP 分析的方法，篩選SSR 位點(diǎn)并對(duì)SSR 位點(diǎn)組合的品種鑒別能力進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，旨在建立一套適用于山茶屬品種分子鑒別的SSR 位點(diǎn)以及位點(diǎn)組合品種鑒別能力評(píng)價(jià)的體系，為品種鑒別及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用山茶屬品種樣品均取樣于佛山植物園，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、健康無(wú)病蟲(chóng)害的植株，共采取111 份山茶屬品種新鮮嫩芽，置于裝有硅膠的密封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室徹底干燥后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取及檢測(cè) 采用高效植物基因組DNA提取試劑盒（型號(hào)：CW0531M，北京康為世紀(jì)）提取基因組DNA， 使用多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax i3,Molecular Device, Austria）檢測(cè)DNA 的濃度和質(zhì)量，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA 的完整性，檢測(cè)合格的DNA 稀釋至濃度為50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR 位點(diǎn)篩選 通過(guò)查閱文獻(xiàn)，收集到山茶屬已公布的76 個(gè)SSR 位點(diǎn)，選擇55 個(gè)位點(diǎn)（PIC>0.5）進(jìn)行初篩和復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。初篩實(shí)驗(yàn)：以隨機(jī)選取的8 個(gè)山茶屬品種的DNA 作為模板，對(duì)55 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，選取條帶清晰的位點(diǎn)進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳，保留峰型正常、重復(fù)性好且多態(tài)性高的位點(diǎn)；復(fù)篩實(shí)驗(yàn)：利用初篩得到的SSR 位點(diǎn)側(cè)翼引物對(duì)111 份茶花品種的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，對(duì)其PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳，篩選通用性高的位點(diǎn)（黃平等, 2012；任小平等, 2016；張曉寧等, 2016；趙瑞娟等, 2017；胡文斌等, 2020；劉超凡等, 2021）；最后，對(duì)111 份茶花品種的基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選擇觀測(cè)等位基因數(shù)≥3 或PIC≥0.65 的位點(diǎn)（趙久然等, 2009）。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增和熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè) 在SSR 位點(diǎn)側(cè)翼正向引物5′端加M13（TGTAAAACGACGGCC AGT）接頭，構(gòu)建TPM13-SSR 引物，M13 引物采用3種熒光（FAM、HEX 和ROX）標(biāo)記。SSR 引物及M13熒光標(biāo)記由北京美級(jí)思諾生物科技有限公司和北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。PCR 采用20 μL 體系：2×Taq MasterMix（10μL）；正向引物（0.5 μL）；反向引物（0.5 μL）； M13 引物（0.5 μL）； DNA（1 μL）；ddH2O（7.5 μL）。

PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（溫度見(jiàn)表1），72 ℃延伸30 s，20 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，15個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保溫。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小采用ABI 3730XL 測(cè)序儀檢測(cè)。

表1 山茶屬17 個(gè)SSR 位點(diǎn)多態(tài)性信息Tab. 1 Polymorphic information of 17 SSR loci in Camellia

1.2.4 SSR 位點(diǎn)組合品種鑒別能力分析評(píng)價(jià) 比較品種鑒別能力分析工具VDPTools（https://github.com/caurwx1/VDPtools.git）中4 種統(tǒng)計(jì)方法（TDP, P-VDP, CVDP, R-VDP）的敏感度，基于敏感度最高的統(tǒng)計(jì)方法分析評(píng)價(jià)篩選所得SSR 位點(diǎn)組合的品種鑒別能力（Yanget al., 2021），考慮到品種鑒別能力受組合的位點(diǎn)數(shù)和差異位點(diǎn)數(shù)等因素影響，進(jìn)一步基于敏感度最高的統(tǒng)計(jì)方法，設(shè)置不同差異位點(diǎn)數(shù)，分析評(píng)價(jià)SSR位點(diǎn)組合分別對(duì)全部品種（系）、紅山茶組品種、金花茶組無(wú)性系的品種鑒別能力，確定品種鑒別所需的最少SSR 位點(diǎn)數(shù)量的組合。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用GeneMarker V2.2.0 進(jìn)行基因分型（王蕊等, 2012），通過(guò)GenALEx 6.503 和Datatrans 2003 進(jìn)行數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換（蓋紅梅, 2011；Peakallet al., 2012）；使用Cervus 3.0.7 計(jì)算PIC 值（Zhouet al., 2022）；使用Popgen V1.31 計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)目（Na）（黃少勇等, 2013）；使用Excel 計(jì)算單位點(diǎn)基因型數(shù)和數(shù)據(jù)缺失率；使用Ntsyspc 2.10e 估算成對(duì)品種間的遺傳相似系數(shù)（genetic similarity, GS），采用非加權(quán)類(lèi)平均法（unweighted pair group method arithmetic averages, UPGMA）進(jìn)行遺傳聚類(lèi)分析（Rohlf,1993）；使用VDPtools V1.0 評(píng)價(jià)SSR 位點(diǎn)組合的品種鑒別能力（Yanget al., 2021）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 位點(diǎn)篩選

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和熒光毛細(xì)管電泳篩選，初篩得到20 個(gè)帶型正常、重復(fù)性好且多態(tài)性高的SSR位點(diǎn)，占篩選位點(diǎn)總數(shù)的36.4%；復(fù)篩得到17 個(gè)通用性強(qiáng)的SSR 位點(diǎn)，占篩選位點(diǎn)總數(shù)的30.9%，復(fù)篩得到的17 個(gè)SSR 位點(diǎn)對(duì)111 份茶花品種的基因分型結(jié)果顯示峰型正常（部分基因分型結(jié)果見(jiàn)圖1）。

圖1 部分山茶屬品種在p1 位點(diǎn)的基因分型Fig. 1 Genotyping of some Camellia varieties at p1 locus

2.2 SSR 位點(diǎn)多態(tài)性分析

以復(fù)篩得到的17 個(gè)SSR 位點(diǎn)對(duì)111 個(gè)山茶屬品種的基因分型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行多態(tài)性分析，分析結(jié)果顯示，在17 個(gè)SSR 位點(diǎn)上共檢測(cè)到166 個(gè)等位基因，觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）范圍為3～15，均值為9.765，其中位點(diǎn)P06 的觀測(cè)等位基因數(shù)最多（15 個(gè)），位點(diǎn)p41的觀測(cè)等位基因數(shù)最少（3 個(gè)）；單位點(diǎn)基因型數(shù)量范圍為6～35，均值為23.353 個(gè)，其中位點(diǎn)TUGM78 的基因型數(shù)最多（35 個(gè)），位點(diǎn)p41 的基因型數(shù)最少（6 個(gè)）；位點(diǎn)缺失率的范圍為0～4.50%，均值為0.90%，其中位點(diǎn)p85 數(shù)據(jù)缺失率最高（4.50%）；多態(tài)性信息含量（PIC）的范圍為0.447～0.835，均值為0.696，其中位點(diǎn)CSSR35 的多態(tài)性最低（0.447），位點(diǎn)p1 的多態(tài)性最高（0.835）（表1）。17 個(gè)SSR 位點(diǎn)均符合觀測(cè)等位基因數(shù)≥3 或PIC≥0.65 的篩選要求，SSR 位點(diǎn)側(cè)翼引物信息見(jiàn)表2。

2.3 山茶屬品種（系）聚類(lèi)分析

以最終確定的17 個(gè)SSR 位點(diǎn)對(duì)111 個(gè)山茶屬品種的基因分型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，進(jìn)行UPGMA 聚類(lèi)分析，得到111 份茶花品種的聚類(lèi)圖（圖2）。聚類(lèi)結(jié)果顯示，各品種間遺傳相似系數(shù)在0.24～0.98 之間，111 個(gè)山茶屬測(cè)試品種（系）在遺傳相似系數(shù)為0.24 時(shí)，分為兩類(lèi)，一類(lèi)是金花茶組無(wú)性系（27 個(gè)），另一類(lèi)為紅山茶組品種（84 個(gè)），結(jié)果表明SSR 位點(diǎn)可有效鑒別紅山茶組品種和金花茶組無(wú)性系。

圖2 基于遺傳相似系數(shù)的111 個(gè)山茶屬品種的UPMGA 聚類(lèi)Fig. 2 UPMGA cluster of 111 Camellia varieties based on genetic similarity coefficient

2.4 四種統(tǒng)計(jì)方法的品種鑒別敏感度分析

差異位點(diǎn)數(shù)的設(shè)置和組合的位點(diǎn)數(shù)會(huì)影響品種鑒別能力，因此將4 種統(tǒng)計(jì)方法的差異位點(diǎn)數(shù)分別設(shè)置為1、2、3，比較不同統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算的值對(duì)于組合中位點(diǎn)數(shù)量變化的品種鑒別敏感性。結(jié)果如圖3 所示，總體上，不同差異位點(diǎn)數(shù)設(shè)置下，不同統(tǒng)計(jì)方法下的品種鑒別能力隨著組合中SSR 位點(diǎn)數(shù)量的減少呈下降的趨勢(shì)。其中，當(dāng)差異位點(diǎn)數(shù)設(shè)置為1 時(shí)，R-VDP值顯著降低（圖3a）；當(dāng)差異位點(diǎn)數(shù)設(shè)置為2 和3 時(shí)，RVDP 值和C-VDP 值顯著降低，R-VDP 值降低更明顯（圖3b、3c），這表明隨著差異位點(diǎn)數(shù)量的增加，RVDP 和C-VDP 均表現(xiàn)出了對(duì)組合位點(diǎn)數(shù)量變化的敏感性。而在4 種統(tǒng)計(jì)方法中，R-VDP 對(duì)于組合的位點(diǎn)數(shù)和差異位點(diǎn)數(shù)的變化最為敏感，與前人的研究結(jié)果一致（Yanget al., 2021），因此選擇R-VDP 對(duì)SSR 位點(diǎn)組合的品種鑒別能力進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

圖3 差異位點(diǎn)數(shù)=1, 2, 3 時(shí)SSR 位點(diǎn)組合對(duì)全部品種（系）的鑒別力Fig. 3 When the number of differential loci=1, 2, 3,The discrimination of combination of SSR Loci to all varieties (lines)

2.5 不同差異位點(diǎn)數(shù)下SSR 位點(diǎn)組合品種鑒別力比較

如圖4 所示，基于概率的品種鑒別力的值（RVDP 值）隨著位點(diǎn)組合中SSR 位點(diǎn)數(shù)量的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)位點(diǎn)增加到一定程度時(shí)，R-VDP 值也會(huì)達(dá)到最大值。如表3 所示，差異位點(diǎn)數(shù)=1 時(shí)，鑒別全部品種（系），最少需要11 個(gè)SSR 位點(diǎn)，占篩選所得SSR 位點(diǎn)總數(shù)的64.7%；鑒別紅山茶組品種，至少需要10 個(gè)SSR 位點(diǎn)，占篩選所得SSR 位點(diǎn)總數(shù)的58.8%；鑒別金花茶組無(wú)性系，至少需要5 個(gè)SSR 位點(diǎn)，占篩選所得SSR 位點(diǎn)總數(shù)的29.4%（圖4a）。差異位點(diǎn)數(shù)=2 時(shí)，17 個(gè)SSR 位點(diǎn)組合能夠鑒別96.4%的全部品種（系），達(dá)到R-VDP 最大值最少需要12 個(gè)位點(diǎn)，占篩選所得位點(diǎn)總數(shù)的70.6%； 17 個(gè)SSR 位點(diǎn)組合能夠鑒別95.2%的紅山茶組品種，達(dá)到R-VDP 最大值最少需要12 個(gè)位點(diǎn)，占篩選所得位點(diǎn)總數(shù)的70.6%； 鑒別金花茶組無(wú)性系最少需要7 個(gè)位點(diǎn)，占篩選所得位點(diǎn)總數(shù)的41.2%（圖4b）。差異位點(diǎn)數(shù)=3 時(shí)，17 個(gè)SSR 位點(diǎn)組合能夠鑒別94.6%的全部品種（系），達(dá)到R-VDP 最大值最少需要8 個(gè)位點(diǎn)，占篩選所得位點(diǎn)總數(shù)的47.1%；17 個(gè)SSR 位點(diǎn)能夠鑒別92.9%的紅山茶組品種，達(dá)到R-VDP 最大值最少需要7 個(gè)位點(diǎn)，占篩選所得位點(diǎn)總數(shù)的41.2%，鑒別金花茶組無(wú)性系最少需要8 個(gè)位點(diǎn)，占篩選所得位點(diǎn)總數(shù)的47.1%（圖4c）。如圖5 所示，總體上R-VDP 值隨著差異位點(diǎn)數(shù)的增加呈下降的趨勢(shì)，當(dāng)差異位點(diǎn)數(shù)≤6 時(shí)，17 個(gè)SSR 位點(diǎn)的組合對(duì)山茶屬測(cè)試品種（系）群的R-VDP 最大值可保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖4 差異位點(diǎn)數(shù)=1, 2, 3 時(shí)SSR 位點(diǎn)組合在山茶屬品種（系）群種的品種鑒別力Fig. 4 When the number of differential loci=1, 2, 3, variety discrimination power of combination of SSR Loci in Camellia variety (clones) groups

圖5 17 個(gè)SSR 位點(diǎn)組合在不同差異位點(diǎn)數(shù)下對(duì)山茶屬品種（系）群的品種鑒別力比較Fig. 5 Comparison of variety discrimination power of combination of SSR Loci under different number of differential loci in Camellia variety (clones) groups

表3 SSR 位點(diǎn)組合在不同山茶屬測(cè)試品種（系）群中的品種鑒別力分析評(píng)價(jià)Tab. 3 Analysis and evaluation of variety discrimination power of combination of SSR loci in different variety (clone) groups of Camellia

3 討論

3.1 SSR 位點(diǎn)篩選及評(píng)價(jià)

本研究篩選驗(yàn)證獲得了17 個(gè)SSR 位點(diǎn)，約占篩選位點(diǎn)總數(shù)的30.9%。通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn)，SSR 標(biāo)記單位點(diǎn)PIC 范圍介于0.447~0.835 之間，與玉米較為接近（0.463~0.852）， 高于水稻（0.370~0.810）、 小麥（Triticum aestivum）（0.240~0.829），單位點(diǎn)的等位基因數(shù)量也與玉米較為接近，略高于水稻，低于小麥（田大剛等, 2013；鄭永勝等, 2014；趙文明等, 2018），多態(tài)性信息含量、等位基因數(shù)量等指標(biāo)都是反映群體遺傳變異大小的指標(biāo)，與位點(diǎn)遺傳特征，測(cè)試群體大小、群體遺傳背景等因素有關(guān)，比較分析結(jié)果也表明本研究篩選獲得的山茶屬SSR 標(biāo)記在單位點(diǎn)水平具有良好的多態(tài)性，可作為品種鑒別的遺傳分析工具?；赟SR分子標(biāo)記的聚類(lèi)分析結(jié)果表明利用這些標(biāo)記可較好的區(qū)分山茶屬不同類(lèi)群的品種（系），可作為植物品種分組管理的有效工具。

3.2 統(tǒng)計(jì)方法的選擇

統(tǒng)計(jì)方法的敏感性分析是分子標(biāo)記位點(diǎn)組合品種鑒別力分析評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，在山茶屬SSR 分子標(biāo)記組合分析評(píng)價(jià)中，我們發(fā)現(xiàn)在不同差異位點(diǎn)數(shù)設(shè)置下，R-VDP 值對(duì)組合位點(diǎn)數(shù)的變化均表現(xiàn)出較好的敏感性，其次是C-VDP，當(dāng)差異位點(diǎn)數(shù)≥2 時(shí)，C-VDP 對(duì)組合位點(diǎn)數(shù)的變化也有表現(xiàn)出一定的敏感性，但RVDP 對(duì)組合位點(diǎn)數(shù)變化和差異位點(diǎn)數(shù)變化的敏感性均優(yōu)于C-VDP，更有利于組合位點(diǎn)品種鑒別力的分析評(píng)價(jià)，盡管如此，R-VDP 對(duì)于缺失數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性比CVDP 差（Yanget al., 2021），因此R-VDP 應(yīng)用的前提條件是篩選所得位點(diǎn)具有較低的數(shù)據(jù)缺失率，本研究中篩選獲得的SSR 位點(diǎn)在測(cè)試品種中的數(shù)據(jù)缺失率均小于0.05，因此選擇了R-VDP 對(duì)位點(diǎn)組合進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。在品種鑒別實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)篩選所得位點(diǎn)的數(shù)據(jù)缺失率較高、品種鑒別靈敏度不重要且鑒別標(biāo)準(zhǔn)為差異位點(diǎn)數(shù)≥2 時(shí)，也可選擇C-VDP 對(duì)位點(diǎn)組合品種鑒別能力進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

3.3 SSR 位點(diǎn)組合品種鑒別力分析評(píng)價(jià)

在品種鑒別實(shí)踐工作中，通常會(huì)使用SSR 位點(diǎn)組合對(duì)測(cè)試品種進(jìn)行鑒別，因此，篩選鑒別能力較好的位點(diǎn)組合是建立植物品種鑒別標(biāo)準(zhǔn)方法的重要工作之一。之前的很多研究都是基于單位點(diǎn)水平的品種鑒別能力篩選標(biāo)記位點(diǎn)，VDP 方法不僅可分析評(píng)價(jià)位點(diǎn)組合的品種鑒別能力，還可用于確定達(dá)到最高品種鑒別力所需的最少位點(diǎn)的組合，可達(dá)到縮減位點(diǎn)檢測(cè)數(shù)量與保持鑒別能力的平衡。在本研究中，使用了RVDP 的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)山茶屬SSR 位點(diǎn)組合進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，在不同差異位點(diǎn)數(shù)的設(shè)置下，山茶屬SSR 位點(diǎn)組合在不同山茶屬測(cè)試品種（系）群中均表現(xiàn)出較好的品種鑒別能力。以差異位點(diǎn)數(shù)=2 為例，山茶屬品種的R-VDP 最大值要高于高粱、玉米，且使用了更少的SSR 位點(diǎn)數(shù)量，這也表明篩選獲得的SSR 標(biāo)記組合具有較強(qiáng)的品種鑒別能力（Yanget al., 2021）。SSR 位點(diǎn)組合的鑒別能力也與物種育種進(jìn)程、技術(shù)方法，品種遺傳近似程度等因素有著密切的聯(lián)系，盡管山茶屬的品種育種歷史悠久，品種數(shù)量巨大，但木本植物雜合度高，遺傳背景復(fù)雜的特點(diǎn)，也一定程度的提升了品種鑒別的效率。在品種鑒別工作中，鑒別能力往往與位點(diǎn)組合的數(shù)量成正相關(guān)，一般認(rèn)為，檢測(cè)位點(diǎn)越多，鑒別能力越強(qiáng)，鑒別結(jié)果越可靠，但在品種鑒別實(shí)踐中還需要考慮與測(cè)試成本間的平衡。本研究基于已有的測(cè)試品種群，通過(guò)計(jì)算不同數(shù)量位點(diǎn)組合的品種鑒別力，確定了品種鑒別所需的最少位點(diǎn)數(shù)量，獲得了具有高效鑒別能力的位點(diǎn)組合。例如，差異位點(diǎn)數(shù)=2 時(shí)，對(duì)于所有測(cè)試品種，17 個(gè)SSR 位點(diǎn)組合RVDP 最大值為0.964，達(dá)到R-VDP 最大值最少需要12個(gè)位點(diǎn)的組合，占篩選所得位點(diǎn)總數(shù)的70.6%。

3.4 SSR 位點(diǎn)組合品種鑒別力分析評(píng)價(jià)的實(shí)際應(yīng)用——品種鑒別

分析評(píng)價(jià)SSR 位點(diǎn)組合品種鑒別力，不僅能有效評(píng)估SSR 位點(diǎn)的組合的品種鑒別能力，還可提高品種鑒別效率，為品種鑒別及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定等奠定基礎(chǔ)。提高品種鑒別效率意味著利用較少的SSR 位點(diǎn)、較短的測(cè)試時(shí)間和較低的經(jīng)濟(jì)成本達(dá)到較高的品種鑒別能力。為了提高品種鑒別效率，達(dá)到縮減位點(diǎn)數(shù)量和保持鑒別能力的平衡。在品種鑒別實(shí)踐中，理論上應(yīng)優(yōu)先選用具有較強(qiáng)鑒別能力的位點(diǎn)組合。在已發(fā)布的基于SSR 分子標(biāo)記的品種鑒別的系列標(biāo)準(zhǔn)中，通常認(rèn)為差異位點(diǎn)數(shù)≥2 可判定為不同品種，在紅山茶組品種中，12 個(gè)SSR 位點(diǎn)的組合和17 個(gè)SSR 位點(diǎn)的組合具有相同的品種鑒別效果，因此當(dāng)被侵權(quán)品種為紅山茶組品種時(shí)，建議優(yōu)先選擇12 個(gè)位點(diǎn)的組合進(jìn)行鑒別侵權(quán)與被侵權(quán)品種，其余位點(diǎn)可作為備選檢測(cè)位點(diǎn)。在金花茶組無(wú)性系中，7 個(gè)SSR 位點(diǎn)的組合和17 個(gè)SSR 位點(diǎn)的組合具有相同的品種鑒別效果，因此當(dāng)被侵權(quán)品種為金花茶組無(wú)性系時(shí)，建議優(yōu)先選擇7 個(gè)位點(diǎn)的組合進(jìn)行鑒別工作，其余位點(diǎn)可作為備選檢測(cè)位點(diǎn)。

3.5 SSR 位點(diǎn)組合品種鑒別力分析評(píng)價(jià)的實(shí)際應(yīng)用——品種鑒別標(biāo)準(zhǔn)制定

品種鑒別標(biāo)準(zhǔn)是判定兩個(gè)品種相同或者不同的標(biāo)準(zhǔn)，例如差異位點(diǎn)數(shù)量、差異位點(diǎn)比率或者遺傳距離等，設(shè)定品種鑒別標(biāo)準(zhǔn)要綜合考慮物種或者品種的遺傳背景、育種現(xiàn)狀等因素（Heckenbergeret al., 2002；Achardet al., 2020）。本研究以差異位點(diǎn)數(shù)為例，分析不同鑒別標(biāo)準(zhǔn)下山茶屬SSR 位點(diǎn)組合對(duì)于3 個(gè)山茶屬品種群的品種鑒別力的影響。理論上差異位點(diǎn)數(shù)越多，則兩個(gè)品種間遺傳差異越大，判定為不同品種的可能性也就越大。在現(xiàn)行品種SSR 分子鑒別的國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，一般將差異位點(diǎn)數(shù)設(shè)置為1、2 或者3，例如白蠟屬（Fraxinus）、油茶（Camellia oleifera）等標(biāo)準(zhǔn)中認(rèn)為當(dāng)兩個(gè)品種的差異位點(diǎn)數(shù)為1 時(shí)，即可判定為不同品種（國(guó)家林業(yè)局, 2014；國(guó)家林業(yè)和草原局,2019）；而在高粱、玉米、水稻、棗（Ziziphus jujuba）、花生（Arachis hypogaea）等標(biāo)準(zhǔn)中認(rèn)為當(dāng)兩個(gè)品種間的差異位點(diǎn)數(shù)≥2 時(shí)，才能判定為不同品種，兩個(gè)測(cè)試品種之間如果差異位點(diǎn)數(shù)=1 時(shí)，則認(rèn)為是相近品種，當(dāng)差異位點(diǎn)數(shù)=0 時(shí)，認(rèn)為是極為近似品種或者相同品種（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部, 2013a；中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部, 2014a; 2014b；國(guó)家林業(yè)局, 2015；山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局, 2019）；在小麥、紫蘇等標(biāo)準(zhǔn)中認(rèn)為兩個(gè)品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥3 時(shí),判定為不同品種，品種間差異位點(diǎn)數(shù)=1 或2 時(shí),判定為相近品種，品種間差異位點(diǎn)數(shù)=0 時(shí),判定為極近似品種（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2013b；貴州省市場(chǎng)監(jiān)督管理局, 2020）。因此本研究將差異位點(diǎn)數(shù)分別設(shè)置為1、2、3，分析不同差異位點(diǎn)數(shù)設(shè)置下山茶屬SSR 位點(diǎn)組合對(duì)于全部品種（系）、紅山茶組品種、金花茶組無(wú)性系鑒別力的影響。結(jié)果表明：將差異位點(diǎn)數(shù)分別設(shè)置為1、2、3 時(shí)，17 個(gè)位點(diǎn)的組合對(duì)山茶屬品種（系）群均具有良好的品種鑒別能力（見(jiàn)圖4a–c），當(dāng)差異位點(diǎn)數(shù)≤6 時(shí)，17 個(gè)SSR 位點(diǎn)的組合對(duì)山茶屬品種（系）群的品種鑒別力最大值可保持相對(duì)穩(wěn)定的水平，表明篩選所得SSR 位點(diǎn)用于山茶屬品種鑒別的差異位點(diǎn)數(shù)最大可設(shè)置為6（見(jiàn)圖5），這也可為研制基于SSR 分子標(biāo)記法的山茶屬品種鑒別標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)置提供重要的參考依據(jù)。