毛元鵬, 魏紅山

(北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院消化科, 北京 100015)

1984年,人們第一次認(rèn)識(shí)到了O-連接-N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)修飾[1]。在細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白質(zhì)的O-GlcNAc修飾是由O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase, OGT)所催化的[2]。長(zhǎng)期以來(lái),人們對(duì)O-GlcNAc修飾的認(rèn)識(shí)只局限于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾[3]。直到2008年,細(xì)胞外蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾(指該修飾過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞內(nèi),但被修飾的蛋白質(zhì)均為存在于細(xì)胞外的分泌蛋白質(zhì)或膜(跨膜)蛋白質(zhì),故細(xì)胞外蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾)的存在得到證實(shí)[4]。細(xì)胞外蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾是一種少見的修飾方式,僅在含有EGF結(jié)構(gòu)域的糖蛋白質(zhì)上發(fā)生。這種細(xì)胞外蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾,由表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)結(jié)構(gòu)域特異性O(shè)-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(EGF domain-specificO-linked-N-acetylglucosamine transferase, EOGT)催化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)腔中進(jìn)行。包括Notch受體[5]在內(nèi)的多種分泌或膜(跨膜)蛋白質(zhì)擁有EGF結(jié)構(gòu)域。EOGT通過(guò)對(duì)這類蛋白質(zhì)的EGF結(jié)構(gòu)域進(jìn)行O-GlcNAc修飾,從而在各種細(xì)胞生物活動(dòng)以及疾病中發(fā)揮作用。

1 表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域特異性O(shè)-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的O-連接-N-乙酰氨基葡萄糖修飾

EOGT介導(dǎo)的細(xì)胞外蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾,首先在果蠅S2細(xì)胞Notch受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 (Notch extracellular domain, NECD)的第20個(gè)EGF重復(fù)序列上被發(fā)現(xiàn)[4]。單個(gè)EGF序列約為40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度,依賴3個(gè)二硫鍵(Cys1-Cys3、Cys2-Cys4、Cys5-Cys6)維持其穩(wěn)定性[6]。從果蠅到哺乳動(dòng)物,EOGT基因高度保守,與OGT僅有12%相似性[7]。而在人類染色體中,該基因的細(xì)胞學(xué)遺傳定位為染色體3p14.1部分[8]。EOGT編碼的蛋白質(zhì)含有524～527個(gè)氨基酸,包括氨基末端的1個(gè)信號(hào)肽和羧基末端的1個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列[9]。雖然EOGT和OGT的亞細(xì)胞分布不同,但它們均以己糖胺生物合成途徑(hexosamine biosynthetic pathway, HBP)來(lái)源的尿苷5′-二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)為底物[10]。胞質(zhì)中的UDP-GlcNAc分別被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中以供使用[11,12]。由此可知,細(xì)胞糖代謝途徑的變化或多或少會(huì)影響含有EGF結(jié)構(gòu)域的分泌或膜(跨膜)蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾水平。

正常情況下,EOGT編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)[13],并與OGT分隔開來(lái)。EOGT對(duì)UDP-GlcNAc的親和力(Km= 5 mmol/L)低于OGT。在氨基酸序列 C5XXGX(T/S)GX2-3C6和 C5XXG(Y/F)(T/S)GX2-3C6中,EOGT催化GlcNAc轉(zhuǎn)移到EGF重復(fù)序列的第5個(gè)和第6個(gè)半胱氨酸殘基之間的絲氨酸或蘇氨酸殘基上(Fig.1A)[9]。在果蠅中,Dumpy(決定果蠅長(zhǎng)翅或短翅表型)是一種包含308個(gè)EGF重復(fù)序列的膜錨定蛋白質(zhì),其EGF結(jié)構(gòu)域上發(fā)生O-GlcNAc修飾由EOGT介導(dǎo),EOGT對(duì)于Dumpy依賴性細(xì)胞-基質(zhì)相互作用所必需[14]。此外,EOGT及其編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)影響不同糖蛋白(Table 1)的O-GlcNAc修飾,進(jìn)而在多種人類疾病中發(fā)揮作用。

Fig.1 The O-GlcNAc modification found on Notch1 EGF repeats in mammalian cells[9,24-27] (A) EOGT transfers GlcNAc to the residues of Ser or Thr in the lumen of the ER; (B) The O-GlcNAcylation sites on EGF repeats in the extracellular domain of Notch1 receptor expressed in HEK293T cells are shown by red hexagons

Table 1 Major protein substrates for EOGT-mediated O-GlcNAc modification

2 細(xì)胞外蛋白質(zhì)O-連接-N-乙酰氨基葡萄糖修飾對(duì)Notch信號(hào)通路的調(diào)控

NOTCH基因最初在果蠅相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)[15],該基因編碼一類高度保守的細(xì)胞表面受體。Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體,以及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子3部分組成,參與多種不同細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),例如細(xì)胞凋亡、分化、增殖和遷移等[16,17]。尤為重要的是,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,Notch信號(hào)通常發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[18,19]。該信號(hào)途徑的一個(gè)顯著特征在于,信號(hào)分子被高度糖基化修飾[20,21]。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)4種不同的Notch受體(Notch1～4,每一種都由不同的基因編碼)以及5種配體[Delta-like(DLL)1, 3, 4,Jagged 1和Jagged 2]。Notch1受體的研究最為深入,在此以Notch1受體為例進(jìn)行介紹。Notch1受體在核糖體翻譯完成后運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),由EOGT進(jìn)行O-GlcNAc修飾。然后,糖基化的Notch1受體到達(dá)反式高爾基體(trans-Golgi),被Furin蛋白酶切割(S1 cleavage),形成異二聚體。之后Notch1受體到達(dá)細(xì)胞膜,在這里與相鄰細(xì)胞表面的配體進(jìn)行結(jié)合。受體-配體結(jié)合使得配體內(nèi)吞作用激活,產(chǎn)生的拉力作用導(dǎo)致Notch1受體負(fù)調(diào)控區(qū)展開,暴露出可被細(xì)胞表面的去整合素金屬蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinase , ADAM)切割的位點(diǎn)(S2 cleavage)。Notch1受體經(jīng)過(guò)S2切割,形成Notch受體胞外截短(Notch extracellular truncation, NEXT),NEXT最終通過(guò):(1)被γ分泌酶(γ-secreatase)剪切(S3 cleavage)后形成Notch受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain, NICD),NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體以調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄;(2)經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入內(nèi)體(endosome),進(jìn)入內(nèi)體的NEXT既可再循環(huán)到細(xì)胞膜,也可在內(nèi)體中被剪切成NICD,繼而轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中降解[22,23]。

NECD含有 29～36 個(gè)EGF樣串聯(lián)重復(fù)序列,這些位點(diǎn)直接參與Notch受體-配體結(jié)合過(guò)程,且大部分具有O-連接聚糖修飾,包括O-GlcNAc[24-26]。糖蛋白組學(xué)分析揭示了HEK293 T細(xì)胞來(lái)源的Notch1受體NECD EGF重復(fù)序列中的O-GlcNAc修飾位點(diǎn)(Fig.1B)[27]。研究發(fā)現(xiàn),敲除EOGT基因會(huì)導(dǎo)致Notch1與配體DLL1和DLL4的結(jié)合減少,并且配體誘導(dǎo)的Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減少;EOGT敲除小鼠表現(xiàn)出輕度類似于視網(wǎng)膜中Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減少引起的視網(wǎng)膜血管生成缺陷[28]。此外,Notch1受體中O-GlcNAc修飾位點(diǎn)突變能與相鄰EGF重復(fù)序列上O-巖藻糖或O-葡萄糖位點(diǎn)的突變共同作用,導(dǎo)致Notch1受體蛋白質(zhì)向細(xì)胞表面的運(yùn)輸減少;而當(dāng)去除Notch1受體EGF重復(fù)序列中的O-巖藻糖和O-葡萄糖時(shí),O-GlcNAc能夠促進(jìn)Notch1受體蛋白質(zhì)運(yùn)輸至細(xì)胞表面[29]。提示EOGT介導(dǎo)的O-GlcNAc糖基化修飾對(duì)Notch信號(hào)通路具有重要調(diào)節(jié)作用(Fig.2)[30-32]。

3 EOGT-NOTCH軸在人類疾病中的作用

3.1 Adams-Oliver綜合征

Adams-Oliver綜合征(Adams-Oliver Syndrome, AOS)是一種罕見的人類遺傳性畸形綜合征,以橫向末端肢體缺陷(terminal transverse limb defect, TTLD)和頭皮先天性皮膚發(fā)育不全(aplasia cutis congenita, ACC)為特征[33]。目前已經(jīng)鑒定出6個(gè)AOS致病基因:ARHGAP31、DOCK6、EOGT、RBPJ、NOTCH1和DLL4[34]。

AOS有著不同的遺傳模式。若突變基因?yàn)锳RHGAP31、DLL4、NOTCH1或RBPJ,該病癥以常染色體顯性模式遺傳;若突變基因?yàn)镈OCK6或EOGT,則為常染色體隱性遺傳[35]。在AOS患者中,NOTCH1基因突變是最常見發(fā)病原因[36]。來(lái)自一項(xiàng)歐洲大型隊(duì)列研究的數(shù)據(jù)表明,NOTCH1是AOS/ACC/TTLD 病例的主要致病突變基因[37]。目前,關(guān)于EOGT基因突變引起AOS的具體機(jī)制知之甚少。通過(guò)全基因組測(cè)序分析,在AOS4型患者中鑒定出5種EOGT突變:p.W207 S、p.R377Q、p.G359DfsTer*28、p.Cys135Tyr和c.311+1 G>T[8,38]。分析表明,p.W207 S和p.G359DfsTer*28突變使EOGT編碼的酶不穩(wěn)定,而p.R377Q突變使得EOGT編碼的酶活性非常低,這些都使得Notch1的O-GlcNAc修飾減少,最終導(dǎo)致AOS的發(fā)生。臨床研究發(fā)現(xiàn),具有NOTCH1突變的AOS患者有一半出現(xiàn)肝細(xì)胞溶解,而具有EOGT突變的患者則保持持續(xù)的TLLD表現(xiàn)。此外,由EOGT突變導(dǎo)致的AOS患者以ACC為主要表現(xiàn),其他缺陷少見;而有NOTCH1雜合突變的AOS患者除有ACC和TTLD表現(xiàn)外,所有患者均有先天性心血管病表現(xiàn)[39]。

3.2 肝細(xì)胞癌

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是發(fā)生于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤,是原發(fā)性肝癌最常見的病理類型,已經(jīng)成為全球癌癥相關(guān)死亡的第4大常見原因[40]。近年來(lái),關(guān)于糖基化修飾在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用的研究逐漸成為熱點(diǎn)[41-43]。

Notch信號(hào)對(duì)肝的生理和病理生理過(guò)程都有著重要作用。Notch信號(hào)能夠抑制成肝細(xì)胞(hepatoblasts)分化為肝細(xì)胞,并激活其向膽管細(xì)胞分化[44]。Notch信號(hào)也能影響HCC的發(fā)生發(fā)展,并且不同的Notch受體和配體在HCC發(fā)展過(guò)程中功能也不同[45-48]。早期有報(bào)道稱,在小鼠肝母細(xì)胞、肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞中組成性激活NICD后,小鼠100%發(fā)生了HCC[49]。有研究發(fā)現(xiàn),Notch配體Jagged1的DNA拷貝數(shù)在幾種HCC細(xì)胞中擴(kuò)增,且其mRNA水平與甲胎蛋白水平上調(diào)相關(guān);在沉默Jagged1基因時(shí),分泌甲胎蛋白的細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制[50]。此外,Zhang等[51]也發(fā)現(xiàn),在71.8%HCC患者腫瘤中,Notch3基因mRNA水平顯著高于正常肝組織水平;而在沉默Notch3基因后,腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑敏感性增強(qiáng),存活率降低。近期1項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用ADAM-17抑制劑ZLDI-8后,Notch信號(hào)被阻斷,HCC細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型得到逆轉(zhuǎn),并且腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移受到抑制[52]。

本項(xiàng)目組近期研究也發(fā)現(xiàn),在EOGT基因敲除的自身免疫性肝炎大鼠中,由于Notch信號(hào)缺失而導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)分化受損,引起T細(xì)胞在肝中異常浸潤(rùn)[53]。通過(guò)生物信息學(xué)分析結(jié)果提示,EOGT在HCC患者中表達(dá)顯著上調(diào),并且EOGT的高表達(dá)與HCC的進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)[54]。結(jié)果也提示,EOGT可能是一種新的HCC預(yù)后生物標(biāo)志物。

3.3 胰腺癌

胰腺癌(pancreatic cancer)是一種惡性程度很高的消化道腫瘤,約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)。2021年,美國(guó)預(yù)計(jì)有約60 4300人被診斷患有PDAC[55]。PDAC的發(fā)病率以每年0.5%～1.0%的速度增長(zhǎng),預(yù)計(jì)至2030年將成為癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[56]。

既往研究證實(shí),Notch信號(hào)通路在PDAC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中十分重要[57,58]。在胰腺癌細(xì)胞中,通常能夠檢測(cè)到Notch1受體和配體以及Notch1靶基因過(guò)度表達(dá)[59,60]。此外,在體外研究中,抑制Notch1受體會(huì)顯著降低胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[61]。這些提示,能夠?qū)otch1受體進(jìn)行O-GlcNAc修飾的EOGT也與PDAC有著緊密關(guān)聯(lián)。研究人員通過(guò)對(duì)來(lái)自30例晚期PDAC患者的癌組織樣本進(jìn)行高通量測(cè)序和免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),EOGT的表達(dá)與PDAC的TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)[62]。并且,該研究還發(fā)現(xiàn),EOGT是PDAC發(fā)生過(guò)程中的原癌基因,其蛋白質(zhì)產(chǎn)物能通過(guò)與銜接蛋白Shc SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1(Shc SH2-domain binding protein 1, SHCBP1)形成復(fù)合體,從而調(diào)節(jié)Notch1受體的O-GlcNAc糖基化,促進(jìn)Notch1受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域核定位和癌細(xì)胞內(nèi)E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)基因、p21基因轉(zhuǎn)錄[62]。有研究表明,人PDAC細(xì)胞系中內(nèi)源性EOGT表達(dá)明顯高于正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞,而敲除EOGT的PDAC細(xì)胞遷移速度明顯慢于對(duì)照組細(xì)胞[63]。這些證據(jù)提示,EOGT對(duì)于PDAC的發(fā)生發(fā)展有著重要作用(Fig. 3)。

4 問(wèn)題與展望

細(xì)胞外蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾是一種較為少見的翻譯后修飾,EOGT通過(guò)介導(dǎo)這種修飾方式來(lái)調(diào)節(jié)包括Notch受體在內(nèi)的多種具有EGF結(jié)構(gòu)域的分泌或膜(跨膜)蛋白質(zhì),從而調(diào)節(jié)諸多細(xì)胞生物過(guò)程。循環(huán)血清蛋白質(zhì)水平變化通常是某些疾病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)之一,EOGT對(duì)分泌蛋白質(zhì)的修飾特性使得開發(fā)相關(guān)臨床診斷試劑盒成為可能。在未來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域,關(guān)于EOGT對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在作用,仍需要深入探討幾個(gè)問(wèn)題:

(1)EOGT與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移前生態(tài)位(pre-metastatic niche)的形成是否相關(guān)?

(2)EOGT是否能夠影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)糖代謝途徑?

(3)EOGT與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment)的形成有何聯(lián)系?

(4)EOGT基因突變?cè)谀承┠[瘤發(fā)病機(jī)制中是否關(guān)鍵?

EOGT在疾病研究應(yīng)用中的難題之一在于其修飾的蛋白質(zhì)均為分泌/膜(跨膜)蛋白質(zhì),如何更為精準(zhǔn)、全面的捕獲這些蛋白質(zhì),并進(jìn)行結(jié)構(gòu)和序列分析,對(duì)于深入了解EOGT在疾病中的作用至關(guān)重要。凝集素(lectins)作為一類特別的糖蛋白質(zhì),已經(jīng)在糖生物學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。然而,目前尚缺乏真正意義上能與EOGT特異性結(jié)合的凝集素,這需要更為廣泛的研究以開發(fā)多種類凝集素。通過(guò)研究EOGT介導(dǎo)的O-GlcNAc修飾與Notch信號(hào)通路之間的聯(lián)系,我們能夠更加深入地了解糖基化修飾在各種人類腫瘤等疾病中的作用,并為該類疾病的治療,提供全新的干預(yù)靶點(diǎn)。