顏先偉 招文華 張?zhí)锰?伍子賢 尚奇 周澤霖 沈耿楊 陳弘林 陳桂鋒陳星達 甘延池 張友 譚日威 張學來 梁德 任輝* 江曉兵*

1.廣州中醫(yī)藥大學,廣東 廣州 510405

2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

3.廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心,廣東 廣州 510405

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一類骨微結構的破壞,導致的骨量減少,骨強度降低的慢性全身性骨病[1],其基本的發(fā)病機制是骨形成-骨吸收的失衡,病理基礎與炎癥微環(huán)境中骨免疫失衡有關[2]。隨著人口老齡化的加劇,OP已成為我國常見的老年性疾病之一,由其引起的骨質疏松性骨折的患病率也在逐年升高[3]。巨噬細胞是機體內一類固有免疫效應細胞,可發(fā)揮著免疫調節(jié)、組織修復等重要作用。由于其具備較強的可塑性,在受到局部微環(huán)境影響時會做出適應性應答[4-6],進而發(fā)生極化。據既往相關文獻報告,M2型巨噬細胞[7]在炎癥后期可通過分泌大量促進骨形成的抗炎因子,如IL-10、TGF-β等,從而促進骨形成,抑制骨吸收,使骨量增加。

腎氣丸作為《金匱要略》中以少火生氣理論為基礎的代表方劑,其中桂枝溫陽化氣,附子補火助陽,在六味滋陰藥(干地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮)中共同發(fā)揮著少火生氣的作用?！饵S帝內經》:“腎主身之骨髓”、“骨傷則內動腎”,說明了腎與骨具有密切的生理病理聯(lián)系,因此骨病當以腎論治。腎氣丸已在臨床與動物實驗中被證實對腎陽虛骨質疏松的治療有積極意義[8-9]。并且據報告補腎相關中藥單體可通過促進巨噬細胞極化成功調控成破骨平衡[10-11]。然而,腎氣丸能否通過M2型巨噬細胞促進骨形成的機制仍未闡明。因此,本研究從少火生氣理論出發(fā),通過體外實驗探討腎氣丸對M2型巨噬細胞極化的影響及促成骨的機制,為以后運用少火生氣理論治療骨質疏松奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞:小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7(購于源井生物公司,批號YC-C020),傳至第三代用于本實驗。小鼠骨髓間充質干細胞(BMSC)來源8周齡野生型(WT) C57BL/6(B6)小鼠,購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心。本研究遵循廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會規(guī)定,倫理批件號:No.K【2019】129。

1.1.2試劑:胎牛血清(Cyagen公司,FBSAD-01011-500),α-MEM基礎培養(yǎng)基(Servicebio公司,G4219-100),青霉素/鏈霉素雙抗(Gibco公司,10378016),CCK-8 試劑盒(GLPBIO,GK1001),堿性磷酸酶染色試劑盒(ALP) (Beyotime公司,C3206),茜素紅染液(ARS)(Beyotime公司,CO138),IL-4(PEPROTECH公司,214-14)。腎氣丸[12]凍干粉(中藥原成分購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,主要成分包含:干地黃 240 g,山藥、山茱萸各 120 g,澤瀉、茯苓、牡丹皮各 90 g,桂枝、附子各 30 g。粉碎后,取1 L純水中加入100 g腎氣丸粉末,煮沸1 h,提取上清。然后在殘渣中加入800 mL純凈水,混懸液煮沸1 h;然后重復這個過程兩次。收集3次的上清液,在60 ℃的旋轉蒸發(fā)器中濃縮至500 mL,再次濃縮至無液滴殘留,得膏狀物,封口膜封好后放于-80 ℃冰箱冷凍,冷凍時間應大于48 h,取出后應用冷凍干燥 72 h,得腎氣丸凍干粉,即為腎氣丸有效成分。置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。溶解后可用于細胞干預,并根據體外細胞毒性試驗數(shù)據選擇腎氣丸濃度。腎氣丸去桂附(其有效成分來源購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,主要成分包含:干地黃 240 g,山藥、山茱萸各 120 g,澤瀉、茯苓、牡丹皮各 90 g。其有效成分制備方法同腎氣丸。)

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng):①小鼠骨髓來源的間充質干細胞(BMSC):來源于8周齡的C57BL/6小鼠,從股骨和脛骨中分離出骨髓間充質細胞。用1 mL注射器反復沖洗骨髓腔至骨髓腔發(fā)白,P0～P1代骨髓間充質干細胞選用20 % 胎牛血清、1 % 雙抗(含有青鏈霉素和鏈霉素)的 MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。P2代及以后代數(shù)的骨髓間充質干細胞在添加有10 % 胎牛血清、1 % 雙抗(含有青鏈霉素和鏈霉素)的 MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)和增殖。②RAW264.7細胞:用含10 % 胎牛血清、1 % 雙抗(含有青鏈霉素和鏈霉素)的MEM培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分數(shù) 5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。待細胞生長融合至80 % 時用槍頭輕輕吹落細胞,于室溫下1 000 r/min離心5 min,棄上清,重懸細胞后進行傳代于培養(yǎng)皿。調整細胞數(shù)至 6×106/皿,向培養(yǎng)皿中分別加入質量濃度為20 ng/mL的IL-4,誘導3 d極化成M2型巨噬細胞。

1.2.2CCK8檢測細胞增殖情況:將RAW264.7細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中,待細胞貼壁后,分別于孔板中加入腎氣丸或腎氣丸去桂附等藥物進行干預,根據不同藥物濃度進行分組:0、0.1、1、5、10、50、100 μg/mL,共7個濃度,每組6個副孔。分別培養(yǎng)0、1、2 d及3 d后運用CCK8法檢測RAW264.7細胞的增殖情況,從而篩選出同時滿足腎氣丸以及腎氣丸去桂附藥物干預對RAW264.7細胞增殖無影響的濃度。由上述實驗得出極化的適宜濃度(10、50 μg/mL)等條件后,將RAW細胞分為CON組、IL-4組、IL-4+腎氣丸組、IL-4+腎氣丸去桂附組,共4組用于后續(xù)實驗。

1.2.3藥物上清液的提取,并制成條件培養(yǎng)基:各組藥物干預3 d后,棄去原液,用PBS輕柔緩慢洗滌2～3次,再加入含有10 %胎牛血清的α-MEM,培養(yǎng)3 d,提取并過濾各組藥物的上清液。將各組上清液濃度稀釋為原本的1/3,分別制成相應的CON組條件培養(yǎng)基、IL-4組條件培養(yǎng)基、IL-4+腎氣丸組條件培養(yǎng)基、IL-4+腎氣丸去桂附組條件培養(yǎng)基。具體稀釋方法如下:1/3上清液+2/3成骨誘導培養(yǎng)基(含有10 %胎牛血清的α-MEM+地塞米松+抗壞血酸+β-磷酸甘油)?？?80 ℃保存或者進行后續(xù)實驗。

1.2.4條件培養(yǎng)基與BMSC培育:我們建立了用IL-4、IL-4+腎氣丸、IL-4+腎氣丸去桂附等藥物誘導RAW264.7細胞的上清液作為條件培養(yǎng)基與BMSC培育的方式,并觀察BMSC成骨的變化。將BMSC種于48孔板,密度為1.0×104個/孔。待BMSC貼壁后,分別于各組中加入相對應的條件培養(yǎng)基,置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃,5 % CO2)中,培養(yǎng)7 d用于堿性磷酸酶(ALP)染色,培養(yǎng)7～14 d用于茜素紅(ARS)染色。顯微鏡下觀察及拍照細胞顏色、密度變化以及鈣結節(jié)的形態(tài)。

1.2.5免疫熒光檢測不同藥物組的條件培養(yǎng)基誘導的BMSC成骨的相關蛋白的表達和分布:將BMSC接種于12孔板,用不同藥物組干預后的上清液作為相應的條件培養(yǎng)基干預處理后,PBS 清洗3次再加入1 mL/孔4 %多聚甲醛室溫固定 30 min。棄去甲醛液,PBS 清洗,加入 1 mL/孔 0.3 % Triton室溫通透處理10 min。1 mL免疫熒光封閉液,37 ℃封閉 1 h,吸干回收,PBS洗滌3遍。分別加入1∶200的熒光一抗,4 ℃冰箱靜置過夜。回收一抗,4 ℃ PBS清洗3次,每次靜置5 min。避光加入1 mL/孔的熒光二抗,室溫孵育1.5 h,回收二抗。PBS洗滌3次。用DAPI復染核,避光靜置20 min,最后用抗熒光淬滅劑封片。最后于熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.6Western blot檢測各藥物組誘導的M2型巨噬細胞極化的相關蛋白以及不同藥物組的條件培養(yǎng)基誘導的BMSC成骨的相關蛋白的表達:① 檢測M2型巨噬細胞極化相關蛋白的表達:按“1.2.1.1”項方法培養(yǎng)細胞、分組及各藥物組給藥干預后,棄去原液,用PBS清洗1～2次,加入RIPA細胞裂解液后用刮刀刮下細胞,移至1.5 mL離心管中,冰上裂解30 min,12 000 r/min 離心15 min。取其上清,并用BCA法測定各組的蛋白濃度,加入loading buffer充分混勻后,用沸水煮沸使之變性。使用一定條件的電泳及轉膜后,得到含有Marker的蛋白條帶的PVDF膜,5 %脫脂奶粉常溫封閉1 h,TBST洗膜后加入配制好的一抗4 ℃孵育過夜,回收一抗,TBST充分洗膜后,于室溫搖床孵育二抗1.5 h,最后用TBST洗膜后,即可使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并用Image J測定相應條帶灰度值,通過以GAPDH 作為內參來計算各目的蛋白的相對表達量。②檢測BMSC成骨相關蛋白的表達:按“1.2.1”項方法培養(yǎng)細胞、分組及各藥物組干預后的上清液制成的相應條件培養(yǎng)基孵育后,棄去原液,蛋白提取和WB檢測方法同“1.2.6”項。同樣最后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并用image J測定和比較相應條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

圖1 實驗流程圖

2 結果

2.1 RAW264.7(M0)及M2型巨噬細胞形態(tài)觀察

復蘇后的RAW264.7培養(yǎng)24 h后轉為貼壁細胞,細胞形態(tài)為圓形。而用藥物IL-4誘導RAW264.7極化為M2型巨噬細胞,其形態(tài)為細長形或橢圓形。如圖2。

注:A:箭頭所指為20×物鏡下M0型巨噬細胞形態(tài);B:箭頭所指為20×物鏡下M2型巨噬細胞形態(tài)。

2.2 腎氣丸促進RAW264.7細胞極化為M2型巨噬細胞,去桂附后極化促進效果減退

通過CCK8檢測細胞增殖情況(如圖3),最終篩選出50 ng/mL為腎氣丸及腎氣丸去桂附共同干預濃度。在誘導RAW264.7細胞極化藥物IL-4中加腎氣丸藥物后,M2型巨噬細胞極化效果明顯,而對于腎氣丸去桂附的加入,M2極化效果則減弱。我們采用了WB實驗,并通過WB條帶(如圖4)結果顯示:與單純用IL-4誘導極化成的M2型巨噬細胞相比,加入腎氣丸后,其上調了M2型巨噬細胞標志蛋白(ARG1及IL-10)的表達。相比于加入腎氣丸,加入腎氣丸去桂附的組別,其下調了ARG1及IL-10(P<0.01)的表達。上述結果表明腎氣丸中“少火生氣”的作用可增強RAW264.7細胞極化為M2型巨噬細胞。

注:A:腎氣丸干預RAW264.7的CCK8;B:腎氣丸去桂附干預RAW264.7的CCK8。

注:A、B:分別是M2型巨噬細胞極化的標志蛋白ARG1、IL-10的WB條帶結果;C、D:分別是ARG1、IL-10的蛋白量化結果。

2.3 IL-4+腎氣丸組誘導M2型巨噬細胞極化的條件培養(yǎng)基促進BMSC細胞成骨。

IL-4+腎氣丸去桂附組誘導的條件培養(yǎng)基促進BMSC細胞成骨效果減退

采用藥物誘導后的條件培養(yǎng)基與BMSC培育的方式,通過ALP、ARS成骨相關染色結果(如圖5),以及WB條帶(如圖6)和免疫熒光(如圖7)結果,提示IL-4+腎氣丸組相比于IL-4組、IL-4+腎氣丸去桂附組明顯增強促BMSC成骨分化的效果。

注:A:BMP4;B:RUNX2;C、D:BMP4、RUNX2的蛋白量化結果。

注:A:BMP4;B:OPG。

3 討論

大量研究表明,OP與骨免疫失衡密切相關,其中免疫細胞尤其是M2型巨噬細胞大量存在于OP的炎癥微環(huán)境中,參與骨形成-骨吸收的調控,維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài),從而促進骨再生[13-16]。Martinis等[17]認為骨微環(huán)境中炎癥因子增高是骨吸收大于骨形成的重要原因,促炎因子的增多可誘導破骨細胞的募集和分化,造成局部骨微環(huán)境改變,骨穩(wěn)態(tài)的失衡,從而局部骨吸收的增加。

作為骨免疫反應的效應細胞,巨噬細胞具有有效吞噬抗原,將抗原呈遞以激活并調節(jié)特異性免疫反應的功能。在不同炎癥微環(huán)境的信號刺激下,巨噬細胞極化為不同表型的亞群M1、M2型。周玲等[18]發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)OP狀態(tài)下的大鼠骨髓巨噬細胞更傾向于向M1極化,與此同時降低M2型相關抗炎因子及表面標志物的表達。劉文濤等[19]也同樣通過M2型巨噬細胞來源的外泌體與BMSC共培養(yǎng)的體外實驗,發(fā)現(xiàn)該外泌體具有誘導BMSC成骨分化的作用。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)M2-Exos可通過將外泌體IL-10 mRNA直接呈遞至細胞,通過激活細胞IL-10/IL-10R通路,來調節(jié)BMSCs和BMDM的細胞分化和促進成骨分化。

在M2型巨噬細胞極化刺激因子中,IL-4扮演著重要的角色。孫林沖等[21]發(fā)現(xiàn)IL-4/IL-4R可引起AKT、Erk1/2和mTOR激活,從而引發(fā)細胞凋亡。彭培軒等[22]通過研究將 IL-4負載至二氧化硅納米粒子上,發(fā)現(xiàn)其能促進RAW 264.7巨噬細胞增殖,以及促進M2型巨噬細胞極化。本文亦將IL-4作為M2型巨噬細胞極化的誘導劑,參考既往文獻[23]報告的20 ng/mL的濃度進行給藥干預。文中的條件培養(yǎng)基的濃度選擇參考了既往相關文獻[24-25]。本文中的上清液是來源不同藥物組誘導巨噬細胞M2型極化后分泌的細胞上清液。而IL-4+SQW組與IL-4+SQQ組相比藥物組成中多了兩味中藥(桂枝、附子),其相應上清液則具備更強的促進BMSC成骨分化能力。目前尚未研究上清液的具體成分,后續(xù)實驗需要進一步研究并對比兩組上清液所含成分的種類及含量,進一步分析“少火生氣”的機理。通過本研究進一步證實M2型巨噬細胞極化與BMSC成骨具有密切聯(lián)系。

現(xiàn)代醫(yī)學認為OP患者因骨量減少,骨強度減低從而更容易導致骨折、變形等臨床表現(xiàn),與中醫(yī)所說的“骨痿”、“骨枯”等癥狀高度相似?！饵S帝內經》曰:“腎者,主蟄封藏之……其華在發(fā),其充在骨?！敝嗅t(yī)學認為OP患者大多數(shù)是腎精虧虛,久則骨骼失養(yǎng)、骨枯骨朽。因此腎病當從骨論治,應以補腎益氣壯骨為治療原則。本研究選用的金匱腎氣丸,是《金匱要略》中治療腎虛型“血痹虛勞”、“痰飲咳嗽”的主方,是在六味滋陰藥的基礎上加入桂枝、附子等兩藥而成,故該方亦是以少火生氣理論為基礎的代表方劑?！端貑枴り庩枒蟠笳摗诽岬降摹吧倩鹕鷼狻痹x是藥食氣味的基本屬性,少火即是藥食氣味溫和的含義。后世醫(yī)家如張景岳則認為“少火”是人體生理正常的陽氣,陽氣溫和,則呈現(xiàn)陰陽兩氣相互平衡的生理狀態(tài)。歷代不少醫(yī)家認為“桂枝和附子”是“少火生氣”的點睛之筆,正如《醫(yī)宗金鑒》所說的那樣:“此腎氣丸納桂附于滋潤中十倍之一,意不在補火,而在生微火,即生腎氣也[26-27]。故本研究將“少火生氣”在體外實驗中所起到的作用看作“桂枝與附子”在腎氣丸中起到的作用,通過不同藥物分組探究對M2型巨噬細胞極化影響及相應條件培養(yǎng)基對BMSC成骨的作用效果比較,研究結果證實腎氣丸組對M2型巨噬細胞極化的效果及相應條件培養(yǎng)基作用于BMSC的成骨效果均比腎氣丸去桂附組好,論證了少火生氣配伍對M2型巨噬細胞極化和BMSC成骨均有促進作用。不過本研究僅僅從成骨方向來研究,而骨質疏松的治療需要從成骨和破骨相關性進行研究,后續(xù)研究可從M2型巨噬細胞對破骨細胞的影響進行進一步探討。

綜上所述,腎氣丸較腎氣丸去桂附更能促進M2型巨噬細胞極化,其干預后的條件培養(yǎng)基能夠促進BMSC成骨分化,創(chuàng)新性地從巨噬細胞極化-成骨分化相關理論出發(fā)探討了少火生氣配伍治療骨質疏松的作用,為少火生氣理論提供了一定的實驗依據。