張卓 劉鵬* 買若鵬 苗磊 陸釗罡 董夢(mèng)婷

1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院脊柱與骨腫瘤外科,寧夏 銀川 750000

2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室,寧夏 銀川 750000

3.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)質(zhì)量管理辦公室,寧夏 銀川 750000

糖皮質(zhì)激素具有抗炎和免疫抑制活性,已廣泛應(yīng)用于自身免疫和炎性疾病的治療。長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素會(huì)對(duì)骨骼產(chǎn)生多種不良影響,包括骨質(zhì)疏松癥。研究顯示,糖皮質(zhì)激素抑制成骨細(xì)胞的增殖與分化,是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨量丟失的重要機(jī)制[1-2]。目前,尚缺乏緩解糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的方法。地塞米松為臨床使用較多的糖皮質(zhì)激素之一,可通過抑制成骨細(xì)胞的Wnt信號(hào)通路,從而抑制成骨細(xì)胞的增殖與成骨分化并促進(jìn)其凋亡,誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松[3-5]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨正常生長(zhǎng)和代謝中發(fā)揮重要作用,激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,促進(jìn)骨折愈合[6-7]。小白菊內(nèi)酯(parthenolide,PTL)是從草本類植物艾菊中提取的活性物質(zhì),具有抗炎、抑制破骨細(xì)胞活性、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用[8]。研究顯示,PTL可抑制地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)糖皮質(zhì)激素受體從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn),是糖皮質(zhì)激素受體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑之一[9]。此外,PTL是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑,在炎癥環(huán)境中PTL可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[10]。然而,小白菊內(nèi)酯是否通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨分化尚未見報(bào)道。因此,本研究旨在探索小白菊內(nèi)酯對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑

小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1購(gòu)自美國(guó)ATCC;小白菊內(nèi)酯(純度≥99 %)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;β-磷酸甘油鈉(G9422)、維生素C(A7631)、地塞米松(D1576)購(gòu)自Sigma公司;Wnt抑制劑(DKK1)(HZ0241)購(gòu)自上海滬震生物科技有限公司;CCK-8試劑盒(C0038)、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(C3206)、ALP檢測(cè)試劑盒(P0321 S)、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(P0012)、茜素紅S(ST1078)、BMP2抗體(AF0075)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;RUNX2(sc-390715)、OCN(sc-390877)、Cyclin D1(sc-8396)、Wnt3a(sc-136163)、β-catenin(sc-7963)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):將MC3T3-E1細(xì)胞接種至MEM培養(yǎng)基(含10 % FBS+1 %青霉素鏈霉素)培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí),以每孔4×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,使用1 μmol/L地塞米松[11]處理細(xì)胞,使用DMSO作為對(duì)照組(Control組),使用終濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80 μmol/L小白菊內(nèi)酯與1 μmol/L地塞米松共同處理細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.2.2細(xì)胞分組及誘導(dǎo)培養(yǎng):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC3T3-E1接種于6孔板中,分為Control組、地塞米松組(Dex組)、小白菊內(nèi)酯低、中、高濃度組(PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組)、小白菊內(nèi)酯高濃度+Wnt抑制劑組(PTL-H+DKK1組),其中Dex組使用1 μmol/L地塞米松處理細(xì)胞24 h,小白菊內(nèi)酯低、中、高濃度組分別使用5.0、10.0、20.0 μmol/L的PTL與1 μmol/L地塞米松共同處理MC3T3-E1細(xì)胞24 h,PTL-H+DKK1組使用20.0 μmol/L的PTL與200 ng/mL DKK1[12]共同處理MC3T3-E1 細(xì)胞24 h后,使用成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(10 μmol/L β-磷酸甘油+10 % FBS+50 μmol/L維生素C+10 μmol/L地塞米松)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),每隔3 d換液培養(yǎng)。

1.2.3ALP染色及活性檢測(cè):成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后,收集各組細(xì)胞,加入0.1 %的TritonX-100裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白濃度,使用ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性。

另收集各組細(xì)胞,PBS洗滌后,4 %多聚甲醛固定,加入BCIP/NBT ALP試劑避光染色30 min,PBS洗滌,觀察各組染色情況。

1.2.4茜素紅S染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié):成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后,各組細(xì)胞加入4 %多聚甲醛固定15 min,再加入1 %茜素紅S染色 20 min,顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)并拍照,每孔加入10 %氯化十六烷基吡啶(CPC)洗去茜素紅后,測(cè)定562 nm處吸光度值(OD)。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后,收集各組MC3T3-E1細(xì)胞,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜,分別加入RUNX2(1∶1 000稀釋)、OCN(1∶1 000稀釋)、BMP2(1∶1 000稀釋)、Cyclin D1(1∶1 500稀釋)、Wnt3a(1∶1 500稀釋)、β-catenin(1∶1 500稀釋)抗體稀釋液,4 ℃孵育過夜,再加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 500稀釋),室溫孵育1 h,加入ECL試劑顯色后,采用Image J軟件,以β-actin為內(nèi)參,分析各蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小白菊內(nèi)酯對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性顯著降低,使用濃度為2.5～80 μmol/L的小白菊內(nèi)酯與地塞米松共同處理MC3T3-E1細(xì)胞48 h后,濃度在5.0 μmol/L以上時(shí),MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性明顯升高,選擇小白菊內(nèi)酯濃度為5.0、10.0、20.0 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 小白菊內(nèi)酯對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

2.2 小白菊內(nèi)酯對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞ALP活性的影響

與Control組相比,Dex組ALP活性顯著降低,ALP染色變淺;與Dex組比較,PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組ALP活性依次升高,ALP染色逐漸加深;與PTL-H組比較,PTL-H+DKK1組ALP活性顯著降低,ALP染色變淺,見圖1與表2。

圖1 各組MC3T3-E1細(xì)胞ALP染色

表2 各組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性比較

2.3 小白菊內(nèi)酯對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的影響

成骨誘導(dǎo)21 d后,Control組可見橘紅色礦化結(jié)節(jié),Dex組礦化結(jié)節(jié)較Control組減少,與Dex組比較,PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組礦化結(jié)節(jié)加深,結(jié)節(jié)數(shù)增多(P<0.05);與PTL-H組比較,PTL-H+DKK1組礦化結(jié)節(jié)數(shù)減少,見圖2與表3。

圖2 各組MC3T3-E1細(xì)胞茜素紅S染色

表3 各組MC3T3-E1細(xì)胞礦化檢測(cè)結(jié)果

2.4 小白菊內(nèi)酯對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化相關(guān)蛋白的影響

與Control組比較,Dex組RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與Dex組比較,PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組MC3T3-E1細(xì)胞RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平依次升高(P<0.05);與PTL-H組比較,PTL-H+DKK1組RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖3與表4。

注:A:Control組;B:Dex組;C:PTL-L組;D:PTL-M組;E:PTL-H組;F:PTL-H+DKK1組。

表4 各組RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達(dá)比較

2.5 小白菊內(nèi)酯對(duì)Wnt/β-catenin通路蛋白的影響

與Control組比較,Dex組Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與Dex組比較,PTL-L組、PTL-M組、PTL-H組MC3T3-E1細(xì)胞Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平依次升高(P<0.05);與PTL-H組比較,PTL-H+DKK1組Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖4與表5。

注:A:Control組;B:C:PTL-L組;D:PTL-M組;E:PTL-H組;F:PTL-H+DKK1組。

表5 各組MC3T3-E1 細(xì)胞Wnt/β-catenin相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

在不同的病理?xiàng)l件下,骨形成減少和骨吸收增加會(huì)導(dǎo)致全身性骨質(zhì)流失,糖皮質(zhì)激素引起的骨代謝紊亂,如地塞米松引起的骨質(zhì)疏松癥,最近備受關(guān)注。地塞米松的使用是骨質(zhì)疏松癥的常見危險(xiǎn)因素,地塞米松可抑制成骨細(xì)胞的增殖與成骨分化,促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松[13-14];抑制成骨細(xì)胞凋亡,促進(jìn)其增殖,有助于改善糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥[15]。

小白菊內(nèi)酯具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖、凋亡的作用[16]。李愛國(guó)等[17]研究顯示,在TNF-α誘導(dǎo)的人肌腱干細(xì)胞中,小白菊內(nèi)酯可抑制的炎性反應(yīng)并可能通過β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)肌腱干細(xì)胞的成骨分化。另有研究顯示,小白菊內(nèi)酯抑制過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞活力,并增加RUNX2、OCN、collagen 1表達(dá)水平[18]。小白菊內(nèi)酯對(duì)地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞的作用尚不清楚,本研究使用濃度為2.5～80 μmol/L的小白菊內(nèi)酯處理地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞,結(jié)果顯示,小白菊內(nèi)酯濃度大于5.0 μmol/L以上可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖,選擇濃度為5.0、10.0、20.0 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。研究顯示,小白菊內(nèi)酯通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,增加ALP活性、礦化結(jié)節(jié)形成和成骨相關(guān)基因/蛋白表達(dá),促進(jìn)成骨細(xì)胞從人牙槽骨分化[10]。ALP是參與骨形成的酶類,是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物;Runx2基因參與成骨細(xì)胞分化過程,并調(diào)控OCN、OPN等基因轉(zhuǎn)錄;BMP-2是誘導(dǎo)成骨的因子[19-20]。本研究結(jié)果顯示,使用小白菊內(nèi)酯與地塞米松共同處理MC3T3-E1 細(xì)胞后,ALP活性、礦化結(jié)節(jié)呈濃度依賴性升高,RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴性升高,表明小白菊內(nèi)酯可促進(jìn)地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化,但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

本研究還顯示,Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能在小白菊內(nèi)酯促進(jìn)地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖與分化過程中起調(diào)節(jié)作用。Wnt/β-catenin是調(diào)節(jié)骨生長(zhǎng)與代謝的重要通路,促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與成熟[21]。Wnt3a是Wnt/β-catenin通路的重要分子,通過調(diào)控β-catenin表達(dá)參與成骨分化過程[22]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥中具有重要意義,研究顯示,在接受糖皮質(zhì)激素治療的全身性自身免疫性疾病患者中,Wnt抑制劑DKK1的血清水平在糖皮質(zhì)激素治療1周后顯著增加,血清Wnt3a水平呈下降趨勢(shì);且地塞米松可增加正常人成骨細(xì)胞(NHOst)中DKK1的mRNA和蛋白表達(dá)[23]。Wnt/β-catenin信號(hào)激活可促進(jìn)地塞米松處理的MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化和礦化,并提高成骨相關(guān)因子的水平,表明Wnt/β-catenin信號(hào)可能是針對(duì)糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥的治療靶點(diǎn)[24]。本研究結(jié)果顯示,使用小白菊內(nèi)酯與地塞米松共同處理MC3T3-E1細(xì)胞后,Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高,且呈濃度依賴性,提示小白菊內(nèi)酯可能激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,而使用Wnt抑制劑DKK1后,成骨細(xì)胞ALP活性、礦化結(jié)節(jié)顯著降低,RUNX2、OCN、BMP2、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平受到抑制,證實(shí)小白菊內(nèi)酯可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,減輕地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化的抑制作用,促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖與分化。

綜上所述,小白菊內(nèi)酯通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,減輕地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞增殖與分化的抑制作用,但本研究?jī)H對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè),其具體作用機(jī)制仍需結(jié)合動(dòng)物模型做進(jìn)一步研究。