張西梅, 焦曉林, 蘇春燕, 羅 毅, 張 蕾, 高微微

(1. 泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院，泰安 271000；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3. 北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100094；4. 河北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，石家莊 050200；5. 山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，濟南 250103)

黃曲霉毒素(aflatoxins,AFs)是由曲霉屬Aspergillus真菌產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)為二氫呋喃香豆素類的系列化合物,具有致癌、致畸、致突變等毒性。目前已發(fā)現(xiàn)的AFs有20余種,以黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)最常見,其中AFB1的毒性最強,1993 年被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)(IARC-WHO)劃定為ⅠA 級致癌物[1]。中藥材作為中醫(yī)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)在我國被廣泛應(yīng)用,藥用植物在采收后一般需要經(jīng)過各種干燥加工過程,植物不同器官加工后成為根(莖)類、葉類、花類、皮類、果實種子類等中藥材。藥用植物的采后病害主要體現(xiàn)在真菌污染導(dǎo)致的霉變,其中果實種子類藥材由于富含淀粉、多糖、脂肪和蛋白質(zhì),是中藥材中易受AFs污染的主要類別。2020版《中華人民共和國藥典》(后文簡稱為《中國藥典》)共收載144種果實種子類藥材,其來源植物及生產(chǎn)加工方式有很大差異,AFs污染的風險也有所不同。其中藥食兩用的蓮子、薏苡仁[2]、酸棗仁、柏子仁等出現(xiàn)AFs污染的情況非常普遍[3-4],控制此類中藥材AFs的污染在保障中藥材安全方面尤為重要。2010版《中國藥典》首次規(guī)定了5種藥材的AFs限量要求,至2020版增加到24種,其中果實種子類藥材有14種[5]。本文針對此類中藥材中AFs污染現(xiàn)狀、污染途徑、國內(nèi)外相關(guān)的限量標準進行綜述,并提出在采收、加工、貯藏等采后環(huán)節(jié)AFs污染的防控措施和建議,為AFs污染的防控以及相關(guān)標準的制訂提供參考。

1 果實種子類藥材黃曲霉毒素污染現(xiàn)狀

利用中國知網(wǎng)(CNKI)數(shù)據(jù)庫,用“中藥+黃曲霉毒素”進行主題檢索,共檢索到488篇相關(guān)文獻(1995年-2022年),其中果實種子類中藥材AFs污染報道的文獻共計54篇,污染藥材數(shù)量呈現(xiàn)逐年增長的趨勢(圖1)。蔡飛等綜述了從1995年至2005年中藥材AFs污染的情況,僅有7篇相關(guān)文獻,涉及此類藥材27種,AFB1檢出量普遍較高,其中薏苡仁、柏子仁、豆蔻、山茱萸、陳皮、益智仁、淡豆豉、胖大海、青皮、佛手、五味子、枳殼、枳實、羅漢果、芡實等15種藥材AFB1的最大檢出量均超過100 μg/kg,占測定藥材數(shù)量的55%,這其中五味子、青皮的檢出量甚至達到500 μg/kg以上[6]。2006年-2010年間,文獻數(shù)量雖然僅6篇,但涉及藥材增加至35種,其中益智仁AFB1的最大檢出量為202.9 μg/kg[7],其他藥材如薏苡仁、苦杏仁、酸棗仁、白芥子、砂仁檢出量均超過 5 μg/kg[7-11]。

圖1 1995年-2022年果實種子類藥材AFs污染狀況Fig.1 Aflatoxins contamination of fruits and seeds medicinal materials in 1995-2022

《中國藥典》2010年版首次規(guī)定了5種中藥材AFs的檢測方法及限量要求,開啟了國家層面對中藥AFs污染水平的管理和監(jiān)測。2011年-2015年,相關(guān)研究文獻數(shù)量增加至25篇,藥材種類增加到48種,篩查出一些AFs容易超標的高風險品種,如蓮子(AFB1檢出量1 300 μg/kg)[12]、砂仁(AFB1檢出量139.93 μg/kg)[13]、肉豆蔻(AFs檢出量290.8 μg/kg)、馬錢子(AFs檢出量158.9 μg/kg)[14],檢出量超過限量的還有薏苡仁、柏子仁、陳皮、桃仁、麥芽、決明子、瓜蔞皮、酸棗仁、苦杏仁、檳榔、使君子、枸杞子?！吨袊幍洹?015年和2020年版的監(jiān)測品種進一步增加到19種和24種,其中果實種子類的數(shù)量達到13種和14種,在這個階段報道的污染藥材新增加了梔子,而之前報道易污染的薏苡仁、蓮子、酸棗仁AFs檢出量仍保持較高水平(108～376 μg/kg)[2,15-16]。

蔡飛等[6]綜述了2010年之前我國有關(guān)中藥材及中成藥AFs污染狀況,報道 2次以上的果實種子類藥材有12種,其中山茱萸、五味子、豆蔻、柏子仁、益智仁、桃仁、薏苡仁、陳皮、青皮、胖大海中AFB1檢出量均超過藥典限量的10倍以上。2011年至2022年,共30種藥材中報道檢測到AFs。報道10次以上的藥材有柏子仁、薏苡仁、酸棗仁3種,其中柏子仁、酸棗仁中AFB1最高檢出量均超過藥典限量(5 μg/kg)的15倍以上;報道6～9次的有桃仁、蓮子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、苦杏仁、決明子7種,其中肉豆蔻、蓮子中AFB1最高檢出量分別超過藥典限量的15倍、260倍以上;報道2～5次的藥材有7種,其中砂仁、馬錢子污染最為嚴重,AFs最高檢出量均超過藥典限量(10 μg/kg)的13倍以上;另外,只有1次報道的補骨脂AFB1及AFs,瓜蔞皮的 AFB1檢出量超過藥典限量(表1)。

表1 2011年-2022年國內(nèi)報道AFs污染超過藥典限量的果實種子類中藥材1)Table 1 Fruit and seed medicinal materials with AFs content exceeding the pharmacopoeia limit reported in China in 2011-2022

2 國內(nèi)外黃曲霉毒素的限量標準

建立限量標準和法規(guī)是實現(xiàn)AFs風險性管理的有效措施。我國從2010年版《中國藥典》開始增加AFs測定方法,并在5種中藥材檢查項下增加了AFs限量,其中包括4種果實種子類藥材(陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海),至2020年版AFs限量的果實種子類藥材增加到14種。使用中藥較多的國家和地區(qū)也對部分中藥材及其相關(guān)制品制定了AFs限量標準。我國臺灣地區(qū)規(guī)定了13種藥材AFs總量的限量標準,其中包括10種果實種子類藥材;韓國食品醫(yī)藥品安全廳對15種藥材規(guī)定了AFB1和AFs總量的限量,其中果實種子類藥材共9種; 歐盟和越南規(guī)定了胡椒和肉豆蔻的AFs限量標準(表2)。

表2 國內(nèi)外對中藥材中AFB1和AFs的限量標準1)Table 2 Maximum allowed levels of AFB1and total AFs in medicinal plants in and outside China

肉豆蔻、蓮子、大棗、桃仁、檳榔、酸棗仁、胡椒在多個國家和地區(qū)均有AFs限量的規(guī)定,可以認為這些藥材的AFs污染較為普遍,是重點控制的種類;有些藥材僅在某一國家或地區(qū)有限量標準,例如八角茴香、大腹皮、女貞子、小茴香、山茱萸、山楂和枸杞子僅在我國臺灣有限量標準,而巴豆、白扁豆和瓜蔞僅在韓國有規(guī)定,表明這些藥材上AFs污染受地域影響。就限量標準而言,AFB1多為5 μg/kg,包括中國、歐盟和越南;對于AFs總量的限量,中國臺灣和韓國的規(guī)定均為15 μg/kg,而中國、歐盟和越南較為嚴格,限量值為10 μg/kg(表2)。

3 黃曲霉毒素的產(chǎn)生菌及影響因素

3.1 黃曲霉毒素的產(chǎn)生菌

目前文獻報道的AFs產(chǎn)生菌至少有20種,均為曲霉屬Aspergillus真菌,其中黃綠組Flavi中有14種,分別為花生曲霉A.arachidicola、家蠶曲霉A.bombycis、黃曲霉A.flavus、微小隱裂曲霉A.minisclerotigenes、A.mottae、集蜂曲霉A.nomius、寄生曲霉A.parasiticus、A.parvisclerotigenus、假稻曲霉A.pseudocaelatus、A.pseudonomius、假溜曲霉A.pseudotamarii、A.sergii、A.togoensis、A.transmontanensis;Ochraceorosei組中有2種,分別為A.ochraceoroseus、A.rambellii;巢狀組Nidulantes中有4種,包括A.astellatus、A.miraensis、A.olivicola、A.venezuelensis[52]。其中黃曲霉A.flavus和寄生曲霉A.parasiticus是主要的AFs產(chǎn)生菌,通常情況,A.flavus只產(chǎn)生AFB1和AFB2,而A.parasiticus可以產(chǎn)生AFB1、AFB2、AFG1和AFG2[53]。

值得關(guān)注的是,A.flavus中存在產(chǎn)毒菌株和不產(chǎn)毒菌株。最新研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒基因缺失或單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是造成A.flavus不能產(chǎn)生AFs的原因之一[54-55]。根據(jù)以往的研究報道和我們前期調(diào)查結(jié)果,發(fā)現(xiàn)從中藥材分離的A.flavus產(chǎn)毒菌株的比率較低,但花生上分離的A.flavus產(chǎn)毒菌株的比率可達69%,而甘草、罌粟等中藥材上分離的產(chǎn)毒菌株僅占31%[56],酸棗仁上分離的產(chǎn)毒菌株僅占9%[57]。

3.2 影響產(chǎn)毒菌生長和產(chǎn)毒的因素

3.2.1環(huán)境因素

真菌毒素的合成受環(huán)境溫度、濕度、pH、二氧化碳含量[58]等外在因素影響,其中溫度和濕度是影響菌株生長和AFs產(chǎn)生的主導(dǎo)因素。適合A.flavus的生長和AFs產(chǎn)生的溫度和相對濕度的范圍分別為26.7～43.3℃和62%～99%,最適溫度和相對濕度分別為30℃和85%[59]。適合A.parasiticus的生長和產(chǎn)毒的溫度和相對濕度的范圍分別為25～35℃和14%～80%,最適溫度和相對濕度分別為25℃和74%[60-61]。因此,生長在較為干旱地區(qū)的作物,可能更容易污染A.parasiticus。

3.2.2寄主特征

藥材種類、化學(xué)成分、藥材水分含量也與霉菌的生長和代謝活動密切相關(guān)。種子果實類藥材的某些特殊結(jié)構(gòu),如檳榔、山茱萸、胖大海等果實類藥材外面包裹著多汁、含糖的果肉,增加了這些藥材被真菌污染風險;種子的種胚代謝活動強,包含有機物的種類多,霉菌容易繁殖,早期往往是胚部先出現(xiàn)霉斑[62];有些藥材種子外面有堅硬的內(nèi)果皮,如酸棗仁,加工過程中破除棗核(內(nèi)果皮)時不可避免的損傷棗仁,從而增加污染真菌的概率[57];霉菌的菌絲和孢子數(shù)量因藥材表面粗糙程度和裂隙大小而異,表面光滑的藥材,如白果,一般不易觀察到霉變特征[62]。

果實種子類藥材富含淀粉、多糖、脂肪等,為產(chǎn)毒真菌的繁殖提供了營養(yǎng)。如蓮子、薏苡仁等淀粉含量較高,胖大海、決明子等富含多糖,而柏子仁、酸棗仁、桃仁、使君子等脂肪含量較高,從而AFs污染的幾率較高。植物次生代謝產(chǎn)物影響AFs污染報道較多的是揮發(fā)油類成分對產(chǎn)毒真菌的抑制作用[63],富含揮發(fā)油的果實種子類藥材往往不易被A.flavus污染,如花椒,所含的花椒精油體積分數(shù)為0.5%時,對A.flavus的生長、分生孢子萌發(fā)、AFs的產(chǎn)生均有抑制作用[64]。

藥材的水分含量是影響A.flavus生長以及AFs產(chǎn)生的主要因素。2020版《中國藥典》有AFs的限量的14種果實種子類藥材中,除大棗外,其他13種藥材均有水分含量要求[5],但對這些藥材的水分限量值差異較大,其中柏子仁(6.0%)、酸棗仁(9.0%)、桃仁(7.0%)的含水量限量最為嚴格,同時這3種藥材也是AFs污染報道最多的藥材(表1)。胖大海(16.0%)、陳皮(13.0%)、蓮子(14.0%)、使君子(13.0%)、麥芽(13.0%)、決明子(15.0%)、薏苡仁(12.0%)、馬錢子(13.0%)的含水量限量在12%～16%,在規(guī)定的含水量下是否可以控制污染,目前極少有報道。與水分含量相比,水活度是更有效反映食品品質(zhì)的熱力學(xué)概念指標,水活度代表基質(zhì)中自由水的量,是微生物生長繁殖能利用的水分,已被廣泛作為食品安全控制和質(zhì)量控制的指標,但在藥材安全相關(guān)的研究和應(yīng)用方面相對缺乏[65],藥事法規(guī)中還沒有相關(guān)規(guī)定。

4 黃曲霉毒素的污染環(huán)節(jié)及防控措施

產(chǎn)毒真菌廣泛存在于空氣、水源、土壤中,是造成中藥材及其相關(guān)產(chǎn)品AFs污染的主要來源。不恰當?shù)姆N植、采收、儲藏、加工及運輸?shù)炔僮?極易導(dǎo)致中藥材滋生產(chǎn)毒真菌,一旦產(chǎn)生AFs污染便很難除去,因此,限制產(chǎn)毒菌的生長和繁殖是控制AFs污染的關(guān)鍵。

4.1 田間生物防控

生物防控技術(shù)是利用非產(chǎn)毒菌的生存競爭和微生物之間的拮抗作用來抑制產(chǎn)毒真菌的侵染和產(chǎn)毒。目前美國、澳大利亞已經(jīng)將非產(chǎn)毒菌株應(yīng)用到花生、玉米等大田作物中來抑制AFs的形成,利用非產(chǎn)毒的A.flavus和A.parasiticus處理花生種植田,花生中AFs含量降低97%～98%[66],美國環(huán)境保護署(United States Environmental Protection Agency,EPA)已經(jīng)批準2株非產(chǎn)毒A.flavus作為花生和棉花上控制AFs污染的生物菌劑[67]。

利用拮抗菌防控AFs污染也有很多研究。室內(nèi)抑菌試驗篩選出的乳酸菌Lactobacillusspp.[68]、芽胞桿菌Bacillusspp.[69]、假單胞菌Pseudomonasspp.、伯克氏菌Burkholderiaspp.等細菌,以及假蜜環(huán)菌Armillariatabescens[70]、黑曲霉Aspergillusniger[71]等真菌具有抑制A.flavus生長或產(chǎn)毒的作用。在田間試驗中,嗜麥芽黃單胞菌Xanthomonasmaltophila[72]和洋蔥假單胞菌P.cepacian[73]分別能夠抑制花生和棉籽上A.flavus的生長和AFs的產(chǎn)生。人工接種黃曲霉(菌株GIM3.17)的盆栽花生在收獲前使用綠色木霉Trichodermaviride發(fā)酵液灌根,土壤中黃曲霉孢子數(shù)量降低97%[74]。釀酒酵母Saccharomycescerevisiae通過生物吸附作用可部分清除AFB1[75],平菇Pleurotusostreatus[76]除了抑制黃曲霉的生長,其分泌的胞外酶能夠降解稻草和玉米芯的AFB1[77]。目前篩選出的絕大多數(shù)生防菌都處在實驗室研究階段,多為農(nóng)作物上的報道,由于中藥材藥效成分的特殊性,距離生產(chǎn)應(yīng)用還有較長的路要走。

4.2 規(guī)范加工工藝

在中藥材成為藥品之前,往往需要經(jīng)過獨特、復(fù)雜的加工工藝,開放式的加工環(huán)境和繁長的加工過程是造成中藥材AFs污染的重要原因。常見的果實種子類藥材加工工序包括分揀、洗滌、揉撞、干燥、脫皮、碾磨等。調(diào)研發(fā)現(xiàn),新鮮藥材采收后經(jīng)常存在晾曬不及時的現(xiàn)象,例如酸棗采收后需經(jīng)過一段時間堆漚去除果肉,再開始酸棗仁的加工,高含水量的酸棗以及相對密封的存放環(huán)境極易導(dǎo)致霉菌的滋生及毒素的積累;另一方面,中藥材產(chǎn)地加工環(huán)境和條件受加工戶、藥材企業(yè)自身條件的限制,加工設(shè)施不齊全,防曬、防雨、防鼠蟲等設(shè)施不完整,以及加工過程中使用的水質(zhì)不清潔,常常會引發(fā)霉變,造成中藥材的嚴重污染[78-79]。因此,規(guī)范藥材產(chǎn)地初加工工藝,例如鮮品除雜、清除病害部位、藥材分級等,飲片加工使用清潔流動水、快速烘干等,是從源頭上防止藥材AFs污染的關(guān)鍵措施。

4.3 加強貯藏管理

通過控制環(huán)境溫、濕度,改善貯藏條件,同時控制藥材含水量是目前中藥貯藏過程中最常見和實用的抑制霉菌方法。Zhao等[80]采用中心復(fù)合設(shè)計-響應(yīng)面法研究儲藏溫度和濕度對益智仁中AFs積累的影響,結(jié)果顯示,在溫度低于25℃,相對濕度低于85%時AFs污染水平最低。陳建茹等[81]通過測定不同儲藏條件下柏子仁的AFs檢出量,給出柏子仁在10、25℃時采用塑料袋及真空包裝儲藏期不宜超過1個月的建議?！吨袊幍洹?2020年)中規(guī)定的藥材及飲片的貯藏條件一般描述為“置通風干燥處,防蛀”[5],而水分含量的檢查僅對部分藥材種類有規(guī)定。目前,在貯藏條件的選擇上,糧食和食品通常儲存于污染菌生長的臨界溫度、含水量或水活度以下。臨界控制點的設(shè)置多通過數(shù)學(xué)模型進行,模擬的參數(shù)通常為影響真菌生長的環(huán)境及寄主內(nèi)在因素。目前,在農(nóng)產(chǎn)品[82]、食品[83]、堅果類[84]等基質(zhì)中產(chǎn)毒菌生長和產(chǎn)毒的模擬研究較為成熟,在中藥材上還少有應(yīng)用,由于中藥材成分組成方面的獨特性,建立中藥材基質(zhì)上產(chǎn)毒菌生長和產(chǎn)毒的模型,可以為中藥材科學(xué)合理的貯藏規(guī)范提供理論依據(jù)。

5 展望

果實種子類藥材中包含很多藥食兩用的產(chǎn)品,人群的日常攝入量大,以往的研究報道表明AFs污染情況不容樂觀,勢必導(dǎo)致藥品的安全性、有效性受到嚴重威脅,已引起業(yè)內(nèi)的高度重視。主要AFs的污染菌為黃曲霉和寄生曲霉,研究發(fā)現(xiàn)污染菌群中AFs產(chǎn)毒菌株的比例雖然不高,但AFs污染仍然很嚴重,產(chǎn)毒菌群的生存及產(chǎn)毒機制值得深入探討。我國從2010版《中國藥典》開始規(guī)定AFs限量,在中藥行業(yè)對污染的認識及控制起到極大的推動作用,如陳皮、胖大海在2010之前報道檢出量較高,之后污染情況得到明顯控制。另外,砂仁、補骨脂、枸杞子雖然目前還沒有AFs限量標準,但已有報道表明AFs檢出量超出10 μg/kg的情況,在今后應(yīng)重點關(guān)注。國際上已有多個國家藥典對果實種子類藥材的AFs限量進行規(guī)定,隨著中藥國際貿(mào)易量的增加,標準會更加嚴格,對我國尚未建立標準的藥材需引起充分重視。

大部分果實種子類中藥材實現(xiàn)了人工種植,如大棗、陳皮、薏苡仁、蓮子、麥芽等,這些藥材產(chǎn)地來源較為清晰,藥材加工工藝相對簡單,質(zhì)量基本能達到穩(wěn)定可控。但是有些來源于野生的藥材,如柏子仁、酸棗仁,產(chǎn)地多且各地采收時間存在差別,農(nóng)戶采收時存在“搶青”現(xiàn)象,原材料成熟度不一致,加工出的藥材質(zhì)量參差不一,AFs的檢出率與檢出量均較高,防控的關(guān)鍵要按照產(chǎn)地、成熟度、批次等進行分類加工。加工過程的防控可以通過材料的快速干燥、分級篩選、去皮脫除表面霉變層及毒素等物理方法,而通過吸附、化學(xué)脫除、生物抑制等農(nóng)產(chǎn)品及飼料加工上應(yīng)用的技術(shù),是否適用于中藥材還有待探討,在實際應(yīng)用時存在一定的局限性。在“十三五”期間,我國在甘肅隴西、山西平順等多個中藥材主產(chǎn)地建立了大型中藥材倉儲物流基地,實現(xiàn)了環(huán)境清潔、溫濕度可控的現(xiàn)代中藥材倉儲,顯著提升了中藥材安全的保障水平。另外,從來源豐富、無殘留、低成本的植物中開發(fā)天然防霉劑,如山蒼子油等[85],用于中小型倉儲也取得了很多研究成果,將有抑菌作用的精油制成微囊、緩釋片、氣霧劑等劑型,不僅能達到緩釋或控釋的長效防霉效果,也便于實際操作,具有廣闊的應(yīng)用前景。