陳耀鑫 黎松波 方冠軍 葉國(guó)標(biāo) 劉先銀

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院骨科（廣東東莞 523000）

腰椎管狹窄（LSS）是一種與年齡相關(guān)的脊柱退行性疾?。?-2］，經(jīng)皮椎間孔鏡手術(shù)與顯微內(nèi)鏡手術(shù)能完整保留腰椎生理結(jié)構(gòu)且創(chuàng)傷小，在LSS 治療方面有顯著優(yōu)勢(shì)［3］。但椎管減壓術(shù)后不可避免發(fā)生再狹窄、LSS 復(fù)發(fā)和鄰近節(jié)段疾?。?］，術(shù)后再狹窄增加再次翻修手術(shù)概率，尋找再狹窄的因素和標(biāo)志物有助于手術(shù)治療策略調(diào)整以及術(shù)后預(yù)防。研究顯示黃韌帶受變性和軸向壓迫影響發(fā)生纖維化、肥厚和骨化是引起LSS 的主要原因，椎間盤軟骨中蛋白多糖過多引起的炎癥反應(yīng)在黃韌帶纖維化等一系列病理改變中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1（FGF-1）可通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1 信號(hào)通路恢復(fù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制成纖維細(xì)胞膠原蛋白產(chǎn)生和向肌成纖維細(xì)胞分化，緩解纖維化進(jìn)程［6］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種有效的血管生成因子，在炎癥反應(yīng)中VEGF 作為單核細(xì)胞的強(qiáng)效趨化劑，誘導(dǎo)單核細(xì)胞浸潤(rùn)和釋放炎癥細(xì)胞因子，增加血管通透性和炎性損傷［7］。然而FGF-1、VEGF 在LSS 的相關(guān)報(bào)道十分少見，如果能證實(shí)FGF-1、VEGF 與LSS的關(guān)系可能為臨床治療提供新的靶點(diǎn)，同時(shí)有助于臨床預(yù)防，完善治療方案。鑒于此，本研究擬檢測(cè)手術(shù)切除的黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達(dá)，分析其與LSS 病情以及腰椎減壓術(shù)后再狹窄的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年1 月至2022 年1 月在南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院骨科收治的138 例行腰椎減壓術(shù)治療的LSS 患者（LSS 組），男85 例，女53 例，年齡49 ～ 63 歲，平均（54.89 ± 7.42）歲，手術(shù)部位：L3-427 例，L4-594 例，L5-S117 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）腰椎CT、MRI 片顯示椎管容積明顯減小，經(jīng)臨床診斷為L(zhǎng)SS；（2）椎間盤鏡下腰椎減壓術(shù)和內(nèi)固定融合治療；（3）本地常駐居民，能配合隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腰椎嚴(yán)重不穩(wěn)或存在多節(jié)段病變；（2）血管跛行、脊柱翻修手術(shù)、假性關(guān)節(jié)病、先天性脊柱畸形；（3）腰椎創(chuàng)傷、腫瘤、感染。采用絕對(duì)跛行距離（ACD）進(jìn)行椎管狹窄程度分級(jí)［8］，根據(jù)椎管狹窄程度分級(jí)將LSS 患者分為輕度組（1-2 級(jí)，ACD ≤ 200 m，41 例）、中度組（3-4 級(jí)，ACD 201 ～ 400 m，67例）和重度組（5-6級(jí)，ACD ＞ 400 m，30 例）［8］。另選擇同期我院骨科收治的138 例行腰椎手術(shù)治療的非LSS 患者為對(duì)照組，男89 例，女49 例，年齡50 ～ 65 歲，平均（55.10 ± 7.19）歲，手術(shù)部位：L3-428例，L4-593例，L5-S117例。兩組性別、年齡、手術(shù)部位比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。本研究已經(jīng)獲得南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均知情同意簽署同意書。

1.2 黃韌帶中FGF-1、VEGF表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）法檢測(cè)黃韌帶中FGF-1、VEGF 表達(dá)：取手術(shù)切除的黃韌帶，Trizol 法（美國(guó)Thermo Fisher公司）提取組織總RNA，取1 mg總RNA，使用cDNA Synthesis kit（日本TaKaRa 公司）將其反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL cDNA 樣品加入qRT-PCR 體系，MyiQ2 雙色實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔCt計(jì)算FGF-1、VEGF 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 免疫組織化學(xué)法黃韌帶中FGF-1、VEGF 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取黃韌帶組織石蠟包埋切片，經(jīng)40 ℃溫水浸泡5 min，37 ℃恒溫箱烘干，無水乙醇梯度脫蠟。抗原修復(fù)和血清封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗，37 ℃溫箱孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，37 ℃溫箱孵育30 min。光學(xué)顯微鏡下觀察，以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，細(xì)胞質(zhì)黃染或棕染為陽性。

1.4 術(shù)后隨訪 所有患者出院后均定期接受電話隨訪和門診復(fù)查腰椎MRI，隨訪時(shí)間截止2022年12 月，統(tǒng)計(jì)術(shù)后再狹窄的發(fā)生情況，術(shù)后再狹窄指原發(fā)病灶再次發(fā)生狹窄。收集患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、基礎(chǔ)疾病、LSS病程、臨床癥狀、LSS 側(cè)別、手術(shù)部位、手術(shù)時(shí)間、術(shù)后第6 個(gè)月以及術(shù)后1 年的Oswestry 殘疾指數(shù)（ODI）［9］和腰痛和下肢痛視覺模擬量表（VAS）評(píng)分［10］、減壓不徹底（術(shù)后MRI 復(fù)查提示腰椎存在突出物殘留）、鄰近節(jié)段病變、術(shù)后并發(fā)癥。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.00 錄入和分析數(shù)據(jù)，連續(xù)性變量均符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用單因素方差分析（兩兩對(duì)比采用LSD-t檢驗(yàn)）或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。多因素logistic 回歸分析LSS 患者腰椎減壓術(shù)后再狹窄的危險(xiǎn)因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSS 組和對(duì)照組黃韌帶組織中FGF-1、VEGF表達(dá)比較 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示LSS 組黃韌帶組織中FGF-1 蛋白陽性表達(dá)率為20.29%（28/138），低于對(duì)照組的56.52%（78/138）（χ2= 38.291，P＜ 0.001），VEGF 蛋白陽性表達(dá)率為68.12%（94/138），高于對(duì)照組的23.91%（33/138）（χ2= 54.272，P＜ 0.001）。qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示LSS 組黃韌帶組織中FGF-1 表達(dá)低于對(duì)照組（P＜ 0.001），VEGF 表達(dá)高于對(duì)照組（P＜ 0.001）。見表1。

表1 LSS 組和對(duì)照組黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達(dá)比較Tab.1 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS group and control group±s

表1 LSS 組和對(duì)照組黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達(dá)比較Tab.1 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS group and control group±s

組別LSS組對(duì)照組t值P值例數(shù)138 138 FGF-1 2.03 ± 0.42 5.39 ± 1.57-24.287＜ 0.001 VEGF 7.02 ± 1.95 4.18 ± 1.27 14.336＜ 0.001

2.2 不同椎管狹窄程度LSS 患者黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達(dá)比較 重度組黃韌帶組織中FGF-1 表達(dá)低于中度組和低度組（P＜ 0.05），且中度組低于低度組（P＜ 0.05），重度組黃韌帶組織中VEGF 表達(dá)高于中度組和低度組（P＜ 0.05），且中度組高于低度組（P＜ 0.05）。見表2。

表2 不同椎管狹窄程度LSS 患者黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達(dá)比較Tab.2 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS patients with different degree of spinal stenosis ±s

表2 不同椎管狹窄程度LSS 患者黃韌帶組織中FGF-1、VEGF 表達(dá)比較Tab.2 Comparison of FGF-1 and VEGF expression in LSS patients with different degree of spinal stenosis ±s

注：與輕度組比較，aP ＜ 0.05；與中度組比較，bP ＜ 0.05

組別輕度組中度組重度組F值P值VEGF 6.22 ± 0.16 7.02 ± 1.21a 8.11 ± 0.36ab 41.189＜ 0.001例數(shù)41 67 30 FGF-1 2.20 ± 0.21 2.05 ± 0.36a 1.75 ± 0.13ab 22.257＜ 0.001

2.3 LSS 患者腰椎減壓術(shù)后再狹窄的因素分析 中位隨訪23 個(gè)月，失訪2 例，發(fā)生再狹窄48 例。再狹窄組年齡大于無再狹窄組（P＜ 0.001），男性、吸煙史、糖尿病、LSS 椎管重度狹窄、減壓不徹底、鄰近節(jié)段病變比例高于無再狹窄組（P＜ 0.05，P＜ 0.001），LSS 病程長(zhǎng)于無再狹窄組（P＜ 0.001），術(shù)后6 個(gè)月ODI 評(píng)分、術(shù)后1 年ODI 評(píng)分、術(shù)后6 個(gè)月腰痛VAS 評(píng)分、術(shù)后1 年腰痛VAS 評(píng)分、VEGF表達(dá)高于無再狹窄組（P＜ 0.001），F(xiàn)GF-1 表達(dá)低于無再狹窄組（P＜ 0.001），兩組其他資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表3。

表3 影響LSS 患者腰椎減壓術(shù)后再狹窄的因素分析Tab.3 Analysis of factors affecting restenosis after lumbar decompression in LSS patients±s

表3 影響LSS 患者腰椎減壓術(shù)后再狹窄的因素分析Tab.3 Analysis of factors affecting restenosis after lumbar decompression in LSS patients±s

項(xiàng)目t/χ2值P值年齡（歲）性別［例（%）］男女體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）吸煙史［例（%）］飲酒史［例（%）］基礎(chǔ)疾?。劾?）］高血壓糖尿病高脂血癥LSS病程（個(gè)月）臨床癥狀［例（%）］腰痛下肢痛間歇性跛行下肢肌力減退LSS側(cè)別［例（%）］單側(cè)雙側(cè)LSS椎管狹窄程度分級(jí)［例（%）］輕中度重度手術(shù)部位［例（%）］再狹窄組（n = 48）58.32 ± 6.02無再狹窄組（n = 88）53.02 ± 5.09 5.433 4.407＜ 0.001 0.036 35（72.92）13（27.08）23.12 ± 0.69 30（62.50）21（43.75）48（54.55）40（45.45）23.05 ± 0.51 36（40.91）30（34.09）0.673 5.797 1.236 0.502 0.016 0.266 23（47.92）30（62.50）19（39.58）10.21 ± 2.03 32（36.36）29（32.95）26（29.55）7.12 ± 1.69 1.721 11.038 1.434 9.480 0.190 0.001 0.235＜ 0.001 42（87.50）40（83.33）21（43.75）10（20.83）80（90.91）79（89.77）33（37.50）16（18.18）0.391 1.178 0.507 0.141 1.288 0.532 0.278 0.477 0.707 0.256 31（64.58）17（35.42）65（73.86）23（26.14）20.301＜ 0.001 27（56.25）21（43.75）79（89.77）9（10.23）0.213 0.899 L3-4 L4-5 L5-S1術(shù)后6個(gè)月ODI評(píng)分（分）術(shù)后1年ODI評(píng)分（分）術(shù)后6個(gè)月腰痛VAS 評(píng)分（分）術(shù)后1年腰痛VAS 評(píng)分（分）術(shù)后6個(gè)月下肢痛VAS 評(píng)分（分）術(shù)后1年下肢痛VAS 評(píng)分（分）減壓不徹底［例（%）］鄰近節(jié)段病變［例（%）］術(shù)后并發(fā)癥［例（%）］切口感染腦脊液漏FGF-1 VEGF 10（20.83）32（66.67）6（12.50）29.35 ± 6.09 17.21 ± 2.02 3.02 ± 0.95 2.05 ± 0.47 2.11 ± 0.69 1.67 ± 0.42 12（25.00）11（22.92）16（18.18）62（70.45）10（11.36）15.21 ± 3.02 11.32 ± 2.65 2.11 ± 0.69 1.25 ± 0.32 2.05 ± 0.43 1.60 ± 0.41 9（10.23）8（9.09）18.112 13.411 6.412 11.751 0.624 0.943 5.191 4.940＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001 0.534 0.347 0.023 0.026 4（8.33）2（4.17）1.85 ± 0.26 8.10 ± 0.33 6（6.82）1（1.14）2.17 ± 0.36 6.59 ± 0.37 0.150 0.291-5.430 23.607 0.699 0.590＜ 0.001＜ 0.001

2.4 影響LSS 患者腰椎減壓術(shù)后再狹窄的logistic回歸分析 多因素logistic 回歸方程，向后逐步法排除無關(guān)變量，最終LSS 椎管重度狹窄、減壓不徹底、高表達(dá)VEGF 是LSS 患者腰椎減壓術(shù)后再狹窄危險(xiǎn)因素（P＜ 0.05，P＜ 0.001），F(xiàn)GF-1 是保護(hù)因素（P＜ 0.05）。見表4。

表4 影響LSS 患者腰椎減壓術(shù)后再狹窄的多因素logistic 回歸方程Tab.4 Multivariate Logistic regression equation affecting restenosis of lumbar spine after decompression in LSS patients

3 討論

本研究首次證實(shí)LSS黃韌帶組織中FGF-1表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)GF-1 蛋白陽性表達(dá)率降低，VEGF 表達(dá)明顯上調(diào)，VEGF 蛋白陽性表達(dá)率升高，隨著椎管狹窄程度增加FGF-1表達(dá)降低，VEGF表達(dá)升高，回歸分析結(jié)果證實(shí)高表達(dá)VEGF是LSS患者腰椎減壓術(shù)后再狹窄危險(xiǎn)因素，F(xiàn)GF-1是保護(hù)因素，提示FGF-1表達(dá)缺失、VEGF 過表達(dá)可能促使黃韌帶肥厚，與LSS腰椎椎管狹窄程度加重以及術(shù)后再狹窄有關(guān)。

椎管減壓術(shù)后因減壓不足、術(shù)前腰椎不穩(wěn)定、鄰近節(jié)段腰椎退變等因素導(dǎo)致再狹窄和LSS 復(fù)發(fā)［11］。研究顯示［12］LSS患者椎管減壓融合術(shù)后病灶復(fù)發(fā)率達(dá)48.8%。再次手術(shù)率為（11.22 ± 4.25）%［13］。若LSS 復(fù)發(fā)再次接受手術(shù)治療術(shù)后疼痛和腰椎功能改善程度明顯差于首次手術(shù)［14］。黃韌帶細(xì)胞及其周圍組織分泌的多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子在黃韌帶纖維化激活中發(fā)揮不可替代的作用［15］。FGF-1具有抗炎和抗纖維化作用，通過促進(jìn)TGF-β 受體1降解，減弱TGF-β1 下游Smad 信號(hào)通路，抑制肌成纖維細(xì)胞分化，減弱肝臟［16］和肺［7］的纖維化。FGF-1 還可抑制核因子-κB 和c-Jun N 端激酶信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，降低炎性損傷［17］。本研究發(fā)現(xiàn)FGF-1 表達(dá)缺失與LSS 腰椎椎管狹窄程度加重以及術(shù)后再狹窄有關(guān)，推測(cè)可能的機(jī)制為：機(jī)械拉伸作用下黃韌帶組織中白細(xì)胞介素（IL）-6 表達(dá)促使黃韌帶組織炎癥，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致黃韌帶纖維化和肥大［18］，而FGF-1 可下調(diào)IL-6、IL-8、環(huán)氧化酶2/前列腺素E2的表達(dá)，限制機(jī)械力誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變［19］，緩解纖維化進(jìn)程。

本研究發(fā)現(xiàn)VEGF 過表達(dá)可能促使黃韌帶肥厚，VEGF 可能是腰椎管狹窄癥的發(fā)病機(jī)制之一。HUR 等［20］報(bào)道也顯示LSS 患者外周血VEGF 水平較非LSS 對(duì)照組顯著增高，且與黃韌帶厚度呈正相關(guān)，LAKEMEIER 等［21］研究也顯示黃韌帶組織中VEGF 表達(dá)增高與MRI 測(cè)量的椎間盤黃韌帶橫截?cái)嗝娣e增大有關(guān)。分析原因?yàn)闄C(jī)械應(yīng)激和炎癥反應(yīng)刺激下，VEGF 表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)血管新生增加和黃韌帶肥大和纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致腰椎椎管狹窄［20］。VEGF 及其受體VEGFR-1 和VEGFR-2 在椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1、腫瘤壞死因子-α 誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)，有助于LSS 機(jī)械應(yīng)激引起的肥大黃韌帶中血管生成［22］，進(jìn)而加劇椎管狹窄程度。

本研究局限性在于樣本例數(shù)偏少，可能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚，其次為單中心研究，可能樣本不具有普遍性，難以直接證實(shí)FGF-1、VEGF 與椎間管狹窄程度的關(guān)系，仍需擴(kuò)大樣本例數(shù)，開展大樣本、多中心臨床研究以及基礎(chǔ)研究加以證實(shí)。

綜上所述，檢測(cè)黃韌帶組織中FGF-1、VEGF表達(dá)有助于了解黃韌帶病變情況，評(píng)估術(shù)后再狹窄風(fēng)險(xiǎn)。FGF-1、VEGF 有望作為L(zhǎng)SS 治療的潛在靶點(diǎn)。

【Author contributions】CHEN Yaoxin： Design a research plan，implement the research process，and write a paper.LI Songbo，LIU Xianyin： Propose research ideas，analyze experimental data，and review papers； YE Guobiao，F(xiàn)ANG Guanjun： Implementing the research process，collecting and organizing data，and revising papers； Conduct statistical analysis.