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        CircACTR2調(diào)節(jié)miR-23a-3p/TBL1X軸對高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷的影響

        2023-10-15 17:23:02黃春艷向汨費志醫(yī)高琴
        天津醫(yī)藥 2023年10期
        關(guān)鍵詞:螢光滋養(yǎng)層劃痕

        黃春艷,向汨,費志醫(yī),高琴

        妊娠糖尿病是女性妊娠過程中發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常疾病,高齡、肥胖是其主要致病因素[1]。妊娠糖尿病易導(dǎo)致胎兒畸形、早產(chǎn)、流產(chǎn)等,增加妊娠女性發(fā)生2 型糖尿病和心血管疾病的風(fēng)險[2]。滋養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎早期著床、排除代謝物和母胎物質(zhì)交換等方面發(fā)揮重要作用,其異常易引起早產(chǎn)、流產(chǎn)等[3]。因此,深入探究滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷機(jī)制對治療妊娠糖尿病有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)對包括妊娠期糖尿病在內(nèi)的多種代謝類疾病的增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)進(jìn)程具有調(diào)控作用[4]。有研究表明,環(huán)狀RNA 肌動蛋白相關(guān)蛋白2(circular RNA actin related protein 2,circACTR2)在妊娠糖尿病患者中過表達(dá)[5]。circRNA 可充當(dāng)微小RNA(miRNA)的“海綿”來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miR-23a-3p在糖尿病患者中低表達(dá),抑制miR-23a-3p 表達(dá)可抵消白藜蘆醇對妊娠糖尿病小鼠和脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和脂質(zhì)代謝的改善作用[6]。還有研究表明,轉(zhuǎn)導(dǎo)素β1X 連鎖蛋白(TBL1X)的異常高表達(dá)與胎盤質(zhì)量增加顯著相關(guān)[7]。而circACTR2 通過調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸對高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞的影響尚不明確。因此,本研究主要探究circACTR2 對高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞的影響及可能的分子機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo 購自美國ATCC公司。CCK-8試劑盒(R2704)購自北京康瑞納生物科技有限公司;丙二醛(MDA)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;兔源一抗TBL1X、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、胱天蛋白酶3(caspase-3)以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam 公司;LipofectamineTM2000 Reagent 購自美國Invitrogen 公司;circACTR2 敲低質(zhì)粒(si-circACTR2)及對照(si-NC),miR-23a-3p 抑制劑(miR-23a-3p inhibitor)及對照(inhibitor-NC)、miR-23a-3p 模擬物(miR-23a-3p mimics)及對照(mimics-NC)、circACTR2 及miR-23a-3p 引物購自廣州RiboBio公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HTR-8/Svneo 細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中,在37 ℃、5%CO2的穩(wěn)定環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng),定期觀察,每2 d更換1次培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時,消化傳代,收集對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

        1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的HTR-8/Svneo 細(xì)胞分為NG 組(5.5 mmol/L 葡萄糖處理)、HG 組[8](25 mmol/L 葡萄糖處理)、si-NC 組(25 mmol/L 葡萄糖+轉(zhuǎn)染si-NC)、sicircACTR2 組(25 mmol/L 葡萄糖+轉(zhuǎn)染si-circACTR2)、sicircACTR2+inhibitor-NC 組(25 mmol/L 葡萄糖+si-circACTR2和inhibitor-NC 共轉(zhuǎn)染)、si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor組(25 mmol/L 葡萄糖+si-circACTR2 和miR-23a-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine?2000 Transfection Reagent操作步驟進(jìn)行。

        1.2.3 實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測circACTR2、miR-23a-3p表達(dá) 使用Trizol 試劑提取細(xì)胞中的總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后,以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列:circACTR2 上游5'-TGTGCTTTCTGGAGGTACT-3',下游5'-TGCCTCATCACCAACCATA-3' ;miR-23a-3p 上 游 5'-CAGTCTTGTCCAGTTTTC-3' ,下游5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTG-3' ;GAPDH 上游5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3',下游5'-AAGTGGTCGTGTGTGAGGAGCAATG-3';U6 上游5'-AACGCTTCACGAATTGCGT-3',下游5'-CTCGCTTCGGCACACA-3'。分別以GAPDH、U6 為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算細(xì)胞中circACTR2、miR-23a-3p的相對表達(dá)量。

        1.2.4 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞以1×104個/孔接種到96孔板中。分別將細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后,棄去細(xì)胞上清液,向每個孔中加入含有10 μL CCK-8溶液的100 μL完全培養(yǎng)基。孵育2 h 后,使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處光密度(OD)值。

        1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集各組HTR-8/Svneo細(xì)胞,以預(yù)冷的PBS 洗滌2 次,添加100 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞,再分別添加Annexin V-FITC 和PI 染液5 μL,充分混勻,于室溫下避光染色15 min,使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

        1.2.6 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 取各組細(xì)胞,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,采用20 μL 移液器槍頭進(jìn)行劃痕,顯微鏡下記0 h 時細(xì)胞的劃痕寬度為W0,記24 h 時細(xì)胞的劃痕寬度為W24。劃痕愈合率(%)=(W0-W24)/W0×100%。

        1.2.7 MDA 水平以及LDH、SOD 活性檢測 取各組HTR-8/Svneo細(xì)胞,加入提取液,超聲破碎細(xì)胞,收集上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測MDA含量和LDH、SOD活性。

        1.2.8 Western blot檢測蛋白表達(dá) 利用RIPA裂解緩沖液冰上裂解30 min提取HTR-8/Svneo 細(xì)胞總蛋白。BCA 法定量,蛋白樣品變性后每孔50 μg加載到10%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離,100 V 恒壓轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜上,用5%的脫脂奶粉封閉2 h,將膜與一抗TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃孵育過夜,再將膜與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗(1∶5 000)在室溫下孵育2 h,棄去液體,洗滌3 次,加入ECL 試劑觀察蛋白質(zhì)印跡,Image J 軟件評估蛋白的灰度值。通過目的蛋白與GAPDH 的灰度值比,得出其蛋白相對表達(dá)量,GAPDH為內(nèi)參蛋白。

        1.2.9 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?分別構(gòu)建circACTR2野生型質(zhì)粒(circACTR2-WT)和突變型質(zhì)粒(circACTR2-MUT),TBL1X 野生型質(zhì)粒(TBL1X-WT)和突變型質(zhì)粒(TBL1XMUT),將其分別與mimics-NC 或miR-23a-3p mimics 共轉(zhuǎn)染于HTR-8/Svneo細(xì)胞,48 h后檢測螢光素酶活性。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 Graphpad Prism 7.0 軟件用于數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用SNK-q檢驗。所有實驗重復(fù)6次。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞中circACTR2、miR-23a-3p 表達(dá)比較 與NG 組相比,HG 組HTR-8/Svneo細(xì)胞中circACTR2表達(dá)升高,miR-23a-3p表達(dá)降低(P<0.05);與HG 組、si-NC 組相比,sicircACTR2組細(xì)胞中circACTR2表達(dá)降低,miR-23a-3p 表達(dá)升高(P<0.05);與si-circACTR2 組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比,si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組細(xì)胞中circACTR2 表達(dá)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),miR-23a-3p 表達(dá)降低(P<0.05),見表1。

        Tab.1 Comparison of expression of circACTR2 and miR-23a-3p in HTR-8/Svneo cells between the six groups表1 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞中circACTR2、miR-23a-3p表達(dá)比較(n=6,)

        **P<0.01;a與NG 組比較,b與HG 組比較,c與si-NC 組比較,d與si-circACTR2 組比較,e 與si-circACTR2+inhibitor-NC 組比較,P<0.05;表2—4同。

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        2.2 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞增殖能力比較 培養(yǎng)24、48、72 h后,與NG組相比,HG組HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值降低(P<0.05);與HG 組、si-NC 組相比,si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞OD450值升高(P<0.05);與si-circACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比,si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞OD450值降低(P<0.05),見表2。

        Tab.2 Comparison of proliferative ability of HTR-8/Svneo cells between the six groups表2 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖能力比較(n=6,OD450值,)

        Tab.2 Comparison of proliferative ability of HTR-8/Svneo cells between the six groups表2 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖能力比較(n=6,OD450值,)

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        2.3 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞凋亡情況比較 與NG組相比,HG 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與HG 組、si-NC 組相比,si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與sicircACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比,si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),見圖1。

        Fig.1 Comparison of HTR-8/Svneo cell apoptosis and apoptosis rate between the six groups圖1 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞凋亡情況及凋亡率比較

        2.4 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞遷移能力比較 與NG組相比,HG 組細(xì)胞劃痕愈合率降低(P<0.05);與HG組、si-NC組相比,si-circACTR2組細(xì)胞劃痕愈合率升高(P<0.05);與 si-circACTR2 組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比,si-circNFATC3+miR-183-5p inhibitor 組細(xì)胞劃痕愈合率降低(P<0.05),見圖2。

        Fig.2 Comparison of HTR-8/Svneo cell migration and scratch healing rate between the six groups圖2 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移情況及其劃痕愈合率比較

        2.5 各組HTR-8/Svneo 細(xì)胞MDA 水平以及LDH、SOD 活性比較 與NG 組相比,HG 組HTR-8/Svneo細(xì)胞中MDA 水平升高,LDH 活性增強(qiáng),SOD 活性減弱(P<0.05);與HG組、si-NC 組相比,si-circACTR2組HTR-8/Svneo 細(xì)胞MDA 水平降低,LDH 活性減弱,SOD活性增強(qiáng)(P<0.05);與si-circACTR2組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比,si-circNFATC3+miR-183-5p inhibitor組細(xì)胞MDA水平升高,LDH活性增強(qiáng),SOD活性減弱(P<0.05),見表3。

        Tab.3 Comparison of MDA level,LDH,SOD activities of HTR-8/Svneo cells between the six groups表3 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞MDA水平以及LDH、SOD活性比較(n=6,)

        Tab.3 Comparison of MDA level,LDH,SOD activities of HTR-8/Svneo cells between the six groups表3 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞MDA水平以及LDH、SOD活性比較(n=6,)

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        2.6 各組TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較 與NG 組相比,HG 組HTR-8/Svneo細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低,TBL1X、caspase-3表達(dá)升高(P<0.05);與HG組、si-NC 組相比,si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)升高,TBL1X、caspase-3 表達(dá)降低(P<0.05);與si-circACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比,si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo 細(xì)胞PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低,TBL1X、caspase-3表達(dá)升高(P<0.05),見圖3、表4。

        Fig.3 Western blot detection of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 protein expression in HTR-8/Svneo cells圖3 Western blot檢測HTR-8/Svneo細(xì)胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)

        Tab.4 Comparison of protein expression of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 in HTR-8/Svneo cells between the six groups表4 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)比較 (n=6,)

        Tab.4 Comparison of protein expression of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 in HTR-8/Svneo cells between the six groups表4 各組HTR-8/Svneo細(xì)胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達(dá)比較 (n=6,)

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        2.7 雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果 Starbase 網(wǎng)站預(yù)測circACTR2與miR-23a-3p的結(jié)合位點見圖4A,miR-23a-3p 與TBL1X 的結(jié)合位點見圖5A。在circACTR2-WT 中,與轉(zhuǎn)染mimics-NC 相比,轉(zhuǎn)染miR-23a-3p mimics 后細(xì)胞螢光素酶活性降低(P<0.05),在circACTR2-MUT的細(xì)胞中螢光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4B。與轉(zhuǎn)染mimics-NC 相比,轉(zhuǎn)染miR-23a-3p mimics 后,同時轉(zhuǎn)染TBL1X-WT 的細(xì)胞螢光素酶活性降低(P<0.05),而同時轉(zhuǎn)染TBL1X-MUT 的細(xì)胞螢光素酶活性變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖5B。

        Fig.4 Binding sites of circACTR2 to miR-23a-3p and Results of dualluciferase assay圖4 circACTR2與miR-23a-3p的結(jié)合位點及雙螢光素酶檢測結(jié)果

        Fig.5 Binding sites of miR-23a-3p to TBL1X and Results of dualluciferase assay圖5 miR-23a-3p與TBL1X的結(jié)合位點及雙螢光素酶檢測結(jié)果

        3 討論

        3.1 高糖可誘導(dǎo)HTR-8/Svneo 細(xì)胞損傷 妊娠糖尿病是妊娠期發(fā)生的一種嚴(yán)重危害母嬰健康的疾病[9]。妊娠糖尿病發(fā)生的主要原因是糖代謝異常,高糖處理能使滋養(yǎng)層細(xì)胞的微絨毛排列紊亂,出現(xiàn)疏密不均等現(xiàn)象,促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,抑制細(xì)胞增殖和遷移[10]。本研究用25 mmol/L 葡萄糖處理HTR-8/Svneo 細(xì)胞,結(jié)果表明細(xì)胞增殖和遷移能力、SOD 活性減弱,MDA 含量升高,LDH 活性、凋亡能力增強(qiáng)。

        3.2 敲低circACTR2 可抑制高糖誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo 細(xì)胞損傷 circRNA 是一類具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、表達(dá)豐富、內(nèi)源性競爭等特點的非編碼RNA,其可參與到妊娠糖尿病的多種生物學(xué)過程中[11]。有研究表明,circ_0008285 在妊娠糖尿病患者中表達(dá)顯著上調(diào),敲低circ_0008285 促進(jìn)了高糖誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[12]。而在妊娠糖尿病患者的胎盤和血漿中circ_0005243 表達(dá)顯著降低,敲低circ_0005243可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和遷移能力[13]。circACTR2 在高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),可參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡[14],而孕婦血漿中circACTR2 水平升高可預(yù)測妊娠糖尿病,妊娠糖尿病患者血漿circACTR2 水平升高可預(yù)測宮內(nèi)死亡、胎兒畸形等多種不良事件[5]。本研究結(jié)果顯示,敲低circACTR2 可使HTR-8/Svneo 細(xì)胞增殖能力、PCNA、MMP-2、MMP-9 表達(dá)、SOD 活性升高,circACTR2 和caxpase-3 表達(dá)、凋亡率、MDA 含量、LDH 活性明顯降低,提示敲低circACTR2 可促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo 細(xì)胞增殖和遷移能力,抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

        3.3 敲低circACTR2 可通過靶向miR-23a-3p 抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞損傷 miRNA在妊娠糖尿病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[15]。與健康妊娠者相比,妊娠糖尿病患者血清中的miR-195-5p 表達(dá)顯著增加,miR-195-5p 可作為妊娠糖尿病的診斷生物標(biāo)志物[16]。circRNA 可靶向miRNA 對妊娠糖尿病起調(diào)控作用,如circ-PNPT1 可通過直接吸附miR-889-3p 調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞功能障礙[17]。本研究結(jié)果顯示,敲低circACTR2 可靶向上調(diào)miR-23a-3p 表達(dá),且抑制miR-23a-3p減弱了敲低circACTR2對HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖和遷移能力的促進(jìn)作用,增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。故提示敲低circACTR2可能通過上調(diào)miR-23a-3p 促進(jìn)HTR-8/Svneo 細(xì)胞增殖和遷移,抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

        3.4 敲低circACTR2 可通過調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞損傷 miRNA可通過靶向抑制其特定mRNA翻譯或促進(jìn)降解來調(diào)控基因表達(dá),從而參與細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等多種生物學(xué)過程。有研究表明,miR-345-3p 通過靶向BAK1抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[18]。本研究表明,miR-23a-3p 可靶向負(fù)調(diào)控TBL1X 表達(dá),下調(diào)miR-23a-3p 減弱了敲低circACTR2 對TBL1X蛋白表達(dá)的抑制作用。

        綜上所述,敲低circACTR2 可通過調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸,進(jìn)而抑制高糖誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷,從而發(fā)揮保護(hù)作用。circACTR2/miR-23a-3p/TBL1X 軸可能成為治療妊娠糖尿病的一個新的靶點。然而本研究尚存在不足之處,僅在細(xì)胞水平上驗證了circACTR2/miR-23a-3p/TBL1X 軸對HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和氧化應(yīng)激的影響,后續(xù)研究將會在動物體內(nèi)進(jìn)一步探索。

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