蘇林潔,鄒楠,赫翠,陳衛(wèi)軍,秦冬梅,蔡鋼

(1.石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,石河子 832000;2.石河子大學第一附屬醫(yī)院,石河子 832000;3.新疆第二醫(yī)學院中醫(yī)學院,克拉瑪依 834000)

糖尿病是全球性較為普遍的慢性疾病之一。我國糖尿病的發(fā)病率約為10%[1],主要特征是高血糖,機體若處于長期的高血糖狀態(tài)將導致機體生化代謝及防御功能紊亂[2],因此延緩糖尿病的進一步發(fā)展是關(guān)鍵,但目前臨床上尚無徹底根治糖尿病的方法及藥物,所以尋找一種高效、安全的降糖藥物對治療糖尿病具有重要意義。

傳統(tǒng)中藥材毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)是新疆維吾爾族習用藥材[3],藥理學研究表明,毛菊苣具有降血糖[4]、降血脂[5]、降尿酸[6]、保肝[7]及調(diào)節(jié)腸道菌群[8]等藥理作用。目前對毛菊苣降血糖的有效部位未進行系統(tǒng)和深入的探索,本課題組前期對維吾爾藥材毛菊苣進行深入研究,發(fā)現(xiàn)毛菊苣乙酸乙酯萃取部位(ethyl acetate extract ofCichoriumglandulosum,CEE)的主要有效成分為倍半萜類化學成分[9],該成分具有較強的生物活性作用,并且含量最高,其中山萵苣苦素是一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的天然化合物,此類酶可直接參與淀粉與糖原的代謝途徑。因此本課題組預(yù)測CEE可能具有降血糖的作用。本實驗采用四氧嘧啶誘導小鼠糖尿病的模型[10],給予CEE進行干預(yù),觀察其對糖尿病造模小鼠糖耐量和胰島素耐量的影響、血糖調(diào)節(jié)情況等,探究其降血糖可能的機制,從而研究CEE的降血糖作用。

1 材料與方法

1.1動物 無特定病原體(SPF)級昆明種小鼠70只,6周齡,體質(zhì)量20～25 g,購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2020-0003。小鼠于室溫(23±2) ℃,相對濕度約50%,12/12 h光暗交替的條件下進行飼養(yǎng),自由攝食飲水,在實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,動物實驗嚴格按照石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院實驗動物管理法規(guī)的規(guī)定和總則建議進行。

1.2藥物與試劑 毛菊苣購自新疆維吾爾自治區(qū)和田縣,經(jīng)石河子大學藥學院秦冬梅教授鑒定為菊科菊苣屬植物毛菊苣(CichoriumglandulosumBoiss.et Huet)的地下根部分,保存于新疆特種植物藥重點實驗室藥劑學研究室。鹽酸二甲雙胍(北京京豐制藥集團,批號:2012020,規(guī)格:每片0.5 g);四氧嘧啶(阿拉丁公司,含量≥98.0%,批號:2244-11-3);丙二醛(malondialdehyde,MDA,批號:20211207)、胰島素(INS,批號:20210220)、一氧化氮(nitric oxide,NO,批號:20200220)、三酰甘油 (triglyceride,TG,批號:20210318)、總膽固醇(total cholesterd,TC,批號:20210318)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C,批號:20210329)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C,批號:20210416)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供;95%乙醇(天津市河東區(qū)紅巖試劑廠,批號:20201119);乙酸乙酯(天津永晟精細化工有限公司,批號:20200106);0.9%氯化鈉溶液(石藥銀湖制藥有限公司,批號:31319010609)。

1.3儀器 5426XG型離心機(德國艾本德股份公司);BP211D型分析天平(德國賽多利斯,感量:0.01 mg);Varioskan LUX型多功能酶標儀(Thermo Fisher Scientific,USA);VORTEX0型渦旋混勻器(上海達姆實業(yè)有限公司);SKY-100B型恒溫搖床(上海天呈實驗儀器制造有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,型號:RE-2000A);羅康全活力型精密血糖儀(美國羅氏,編號:2423585);冷凍干燥器(上海比朗儀器制造有限公司,型號:LGJ-18A);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,型號:KQ-500DE)。

1.4藥材提取及配制 將毛菊苣根清洗、晾干、粉碎,用95%乙醇浸泡24 h,多次浸泡至浸泡液接近無色,合并浸泡液,三層潔凈紗布濾過,抽濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓旋蒸濃縮,得到毛菊苣提取物浸膏。將毛菊苣提取物浸膏用純化水溶解,用乙酸乙酯溶液萃取得萃取液,將萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓旋蒸濃縮,置于冷凍干燥機中真空干燥,得CEE的凍干粉。

1.5小鼠糖尿病模型的建立 取昆明種小鼠70只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機分組。根據(jù)實驗要求將70只小鼠分為6組,為排除造模失敗和死亡率對實驗的影響,除模型對照組20只,其余各組均為10只,隨機分為正常對照組、模型對照組、CEE小劑量組(150 g·kg-1)、CEE中劑量組(300 g·kg-1)、CEE大劑量組(600 g·kg-1)和二甲雙胍組(300 mg·kg-1)。CEE治療組劑量是根據(jù)臨床原生藥應(yīng)用及藥材提取率換算得到,并結(jié)合前期毛菊苣實驗研究結(jié)果[11-12],陽性藥二甲雙胍劑量根據(jù)臨床給藥劑量換算得到。除正常對照組給予0.9%氯化鈉溶液外,其余各組腹腔注射造模藥物四氧嘧啶[13],劑量為200 mg·kg-1,注射時間限制為5 min,分別于造模第3 天和第7 天同一時間,禁食12 h,取小鼠尾靜脈血檢測血糖值,血糖≥16 mmol·L-1為造模成功。

1.6動物分組與處理 造模第7 天后,停止造模給藥,除正常對照組和模型對照組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液外,其余各組灌胃給予相應(yīng)劑量治療藥物,每日給藥1次,以5 d為時間間隔測定血糖值,并記錄小鼠每日體質(zhì)量及活動情況變化,持續(xù)30 d,利用小鼠體質(zhì)量變化率計算體質(zhì)量差異,體質(zhì)量變化率(%)=(現(xiàn)體質(zhì)量-原體質(zhì)量)/原體質(zhì)量×100%,并分析30 d后體質(zhì)量較原始體質(zhì)量差異。

1.7糖耐量實驗 在標本采集前1 d進行葡萄糖耐量實驗,各組動物禁食不禁水3～4 h,稱量小鼠體質(zhì)量并記錄,測定空腹血糖即給葡萄糖前(0 h)血糖值,CEE小、中、大劑量組及二甲雙胍組給予對應(yīng)劑量的藥物,模型對照組及正常對照組不處理,30 min后,腹腔注射1.0 g·kg-1葡萄糖,分別于注射后經(jīng)0、30、60和120 min 尾靜脈取血,用血糖測試儀嚴格按照說明書測其血糖值,并計算葡萄糖耐量曲線下面積(glucose tolerance area under curve,GAUC)。

1.8胰島素耐量實驗 各組小鼠進行胰島素耐量實驗前,需禁食不禁水6 h,預(yù)先準備50%葡萄糖溶液,防止小鼠低血糖休克。為避免實驗過程中小鼠死亡,預(yù)實驗確定胰島素劑量為0.25 U·kg-1,實驗時,首先用血糖儀檢測各組小鼠尾靜脈空腹血糖,然后腹腔注射0.25 U·kg-1胰島素,分別于15、30、60和90 min用血糖儀監(jiān)測小鼠的尾靜脈血糖濃度,并計算胰島素耐量曲線下面積(insulin tolerance area under curve,IAUC)。

1.9血清測定 實驗第30天,小鼠末次給藥后1 h,自小鼠眼眶內(nèi)眥取血1 mL,室溫下靜置30 min后,用4 ℃預(yù)冷的離心機3 000 r·min-1離心10 min(r=5.2 cm),分離血清。取已分離血清,嚴格按照相關(guān)試劑盒說明書檢測血清中INS、MDA、NO、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。

2 結(jié)果

2.1CEE對糖尿病小鼠體質(zhì)量影響 結(jié)果見圖1。從生長曲線結(jié)果可知,正常對照組小鼠體質(zhì)量增長最快,模型對照組體質(zhì)量下降最快。從小鼠30 d平均體質(zhì)量變化率可知,與正常對照組比較,模型對照組體質(zhì)量變化率呈負增長,說明小鼠體質(zhì)量顯著性降低(P<0.01),與模型對照組比較,CEE小、中劑量組及二甲雙胍組體質(zhì)量變化率均顯著降低,說明藥物干預(yù)組小鼠體質(zhì)量緩慢減輕(P<0.01)。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.二甲雙胍組;D.CEE小劑量組;E.CEE中劑量組;F.CEE大劑量組。①與正常對照組比較,t=20.93,P<0.01;②與模型對照組比較,t=5.219～13.200,P<0.01。

2.2造模期間四氧嘧啶對小鼠血糖水平的影響 結(jié)果見表1。造模第3 天及第7天,正常對照組血糖值與其他組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),表明四氧嘧啶對小鼠血糖水平具有顯著性影響,模型對照組以及CEE各劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義,表明四氧嘧啶對小鼠血糖影響基本穩(wěn)定。按照造模小鼠總數(shù)為70只計算,在造模第3 天時,造模成功率為95.71%,死亡率為4.29%(即造模成功67只,死亡3只);在造模第7 天時,造模成功率為88.57%,死亡率為11.43%(即造模成功62只,死亡8只),在后續(xù)給藥過程中無小鼠死亡。

表1 造模期間四氧嘧啶對小鼠血糖水平的影響

2.3CEE對糖尿病小鼠血糖水平的影響 每間隔5 d測定糖尿病小鼠血糖值,結(jié)果見圖2。與正常對照組比較,隨著給藥時間延長,CEE小、中、大劑量組均表現(xiàn)出對糖尿病小鼠的有效治療作用;與模型對照組比較,二甲雙胍組及CEE各劑量組小鼠血糖水平逐漸降低,其中大劑量CEE具有顯著抑制糖尿病小鼠血糖作用(P<0.01)。

2.4CEE對糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影響 各組小鼠血糖值均在糖負荷30 min 時達到峰值,30 min后血糖值隨著時間的增加呈下降趨勢;與正常對照組比較,模型對照組GAUC顯著增大,同時血糖值在120 min時顯著性升高(P<0.01),與模型對照組比較,CEE大劑量組及二甲雙胍組GAUC顯著性降低(P<0.01),兩組血糖值在120 min時顯著性降低(P<0.01),CEE中劑量組血糖值在120 min時顯著性降低(P<0.05),說明CEE能明顯降低小鼠血糖值,提高小鼠糖耐量,并且大劑量組效果比中劑量組更佳,見圖3。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.二甲雙胍組;D.CEE小劑量組;E.CEE中劑量組;F.CEE大劑量組。①與正常對照組比較,t=-3.726,-9.347,P<0.01;②與模型對照組比較,t=9.953,12.620,P<0.01;③與模型對照組比較,t=2.906,3.395,P<0.05。

2.5CEE對糖尿病小鼠胰島素耐量的影響 小鼠的胰島素耐量在一定時間內(nèi)呈下降趨勢,結(jié)果見圖4。模型對照組小鼠空腹血糖水平顯著高于正常對照組,腹腔注射胰島素后,0～60 min內(nèi)模型對照組小鼠血糖水平下降緩慢,在60 min達到血糖最低值,且在60 min后血糖水平后逐漸回升,同時藥物干預(yù)組在30 min達到血糖最低值,30 min后血糖水平逐漸回升,說明模型對照組小鼠胰島素耐量明顯增加,自身產(chǎn)胰島素明顯不足。與正常對照組比較,模型對照組IAUC顯著增大(P<0.01),與模型對照組比較,各藥物干預(yù)組IAUC均顯著性降低(P<0.01或P<0.05),CEE大劑量組及二甲雙胍組在90 min時胰島素耐量顯著降低(P<0.05)。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.二甲雙胍組;D.CEE小劑量組;E.CEE中劑量組;F.CEE大劑量組。①與正常對照組比較,t=-11.391,-14.560,P<0.01;②與模型對照組比較,t=4.990,4.545,P<0.01;③與模型對照組比較,t=3.174～3.888,P<0.05。

2.6CEE對糖尿病模型小鼠血清INS、MDA、NO的影響 結(jié)果見圖5。結(jié)果表明,與正常對照組比較,其他組均差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與模型對照組比較,CEE各劑量組小鼠血清中INS均提高,小鼠血清中MDA和NO水平均降低,且呈劑量依賴性,其中CEE大劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.7CEE對糖尿病模型小鼠血脂水平的影響 小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平測定結(jié)果見圖6。與正常對照組比較,模型對照組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高(均P<0.01),HDL-C水平降低差異無統(tǒng)計學意義;與模型對照組比較,CEE各劑量組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低(均P<0.01),其中CEE大劑量組作用更顯著,二甲雙胍組及CEE大劑量組能顯著升高血清中HDL-C水平(P<0.01)。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.二甲雙胍組;D.CEE小劑量組;E.CEE中劑量組;F.CEE大劑量組。①與正常對照組比較,t=-3.012～-2.510,P<0.01;②與模型對照組比較,t=2.027～8.235,P<0.01。

3 討論

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病,由胰腺的胰島素分泌不足、或相對不足,或胰島素作用障礙所致。本研究以四氧嘧啶為造模藥物,其中給藥途徑、劑量和次數(shù)等因素均對小鼠造模過程有較大的影響[13];研究選擇以200 mg·kg-1的劑量腹腔注射,是較為理想且經(jīng)濟的造模方法,最終造模成功率為88.57%,死亡率為11.43%,各組體質(zhì)量均呈下降趨勢,表明造模藥四氧嘧啶對小鼠體質(zhì)量具有顯著影響。二甲雙胍為臨床治療2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)的一線推薦藥物,近年來已逐漸應(yīng)用于1型糖尿病(type 1 diatetes,T1DM)的治療,并取得顯著療效。在我國,二甲雙胍已批準用于T1DM治療。二甲雙胍的降糖機制主要是通過抑制糖異生作用降低肝葡萄糖輸出。目前在T1DM中主要作為輔助治療手段,起到減少胰島素用量、減輕體質(zhì)量增加的效果,同時具有心血管獲益的功能[14],可作為本研究的陽性對照藥。

CEE的主要有效成分為毛菊苣倍半萜類化合物[15],其中山萵苣苦素,是碳水化合物水解的關(guān)鍵酶,能從碳水化合物分子鏈末端依次切開α-1,4糖苷鍵,緩慢水解α-1,6糖苷鍵[16-17]。而α-葡萄糖苷酶抑制劑則可抑制α-葡萄糖苷酶活性,降低多糖降解,延緩腸道對碳水化合物的吸收,達到改善高血糖的效果[18],

實驗中小鼠血糖檢測結(jié)果顯示,CEE各劑量組均可抑制糖尿病小鼠血糖水平,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

糖耐量是臨床糖尿病診斷及衡量藥效的重要指標,將糖耐量曲線轉(zhuǎn)化為曲線下面積而得到固定的數(shù)值,通過對曲線下面積進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析,可以更精確地判斷糖尿病患者或?qū)嶒瀯游锏奶悄土縖19]。糖耐量實驗結(jié)果表明,各組小鼠的血糖值均在糖負荷30 min時達到峰值,120 min時血糖值基本回落,CEE大劑量組GAUC顯著性降低,且血糖值在120 min時顯著性降低(P<0.01),表明大劑量CEE明顯增加小鼠對葡萄糖的利用能力,并且效果與二甲雙胍相近。胰島素耐量實驗結(jié)果表明,藥物干預(yù)組在30～60 min達到血糖最低值,60 min后血糖水平逐漸回升,與模型對照組比較,CEE大劑量組在90 min時胰島素耐量顯著降低(P<0.05),說明CEE高劑量可明顯增加小鼠對葡萄糖的利用能力,降低糖尿病小鼠的胰島素耐量。但其作用機制是增加胰島素敏感性還是降低胰島素抵抗有待進一步研究。

為進一步明確CEE的降血糖效果及機制,本研究檢測小鼠血清中INS、MDA及NO水平,結(jié)果顯示模型對照組小鼠血清中INS水平顯著低于正常對照組,表明模型對照組中胰島β細胞的分泌功能出現(xiàn)異常,造模成功,且CEE中、大劑量組小鼠血清中INS的水平顯著增加,表明CEE可能會促進胰島β細胞的分泌功能。胰島β細胞也是體內(nèi)氧化應(yīng)激的重要靶點,ROS通過損傷胰島β細胞,促進β細胞凋亡,還可通過影響INS信號轉(zhuǎn)導通路間接抑制β細胞功能。β細胞一旦受損,INS分泌水平降低、分泌高峰延遲,最終導致體內(nèi)血糖波動加劇。機體脂質(zhì)過氧化也會影響糖尿病的發(fā)生,MDA可促進脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,反映機體脂質(zhì)過氧化的程度[20]。研究結(jié)果顯示,CEE能降低MDA含量,表明CEE可明顯改善糖尿病小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng),改善小鼠的糖尿病病情,增強小鼠抗氧化能力。除此之外,糖尿病的發(fā)病機制與體內(nèi)NO水平也有一定的聯(lián)系,并且呈負相關(guān)[21]。本研究實驗結(jié)果顯示,模型對照組NO水平顯著高于正常對照組,而CEE大、中劑量組以及二甲雙胍組NO水平均不同程度降低,說明CEE可通過調(diào)節(jié)NO水平發(fā)揮降血糖作用。

糖尿病血脂異常在DM患者中非常普遍,通常與胰島素抵抗相關(guān)[22]。糖尿病小鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高,HDL-C水平降低,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥后,CEE各劑量組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平下降,其中CEE大劑量組作用更顯著,二甲雙胍組及CEE大劑量組能顯著升高血清中HDL-C水平,因此CEE可通過調(diào)節(jié)糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝來發(fā)揮降糖作用。

綜上所述,CEE對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠有顯著的降血糖作用,其機制可能是顯著抑制α-葡萄糖苷酶的活性,同時調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂,增強機體抗氧化能力。CEE作為天然產(chǎn)物,成分復(fù)雜,其降血糖的主要有效活性成分及機制仍有待進一步研究。