王東梅，孫麗麗，鄭江濤，王利祥，郭數(shù)進(jìn)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

蕓豆（Phaseolus vulgaris.L）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)豆類作物之一，是豆科植物菜豆屬籽食性作物的總稱。蕓豆富含多酚化合物，多酚是具有有效抗氧化特性的次生代謝物，有助于減少氧化應(yīng)激引起的疾病[1]。紅蕓豆富含維生素C，鈣和鐵含量高，蛋白質(zhì)含量和B 族維生素含量高于雞肉；紅蕓豆富含花色苷和皂苷，有降低關(guān)節(jié)局部炎性組織和緩解疼痛的功效，因此，紅蕓豆是人們的理想食材，也是山西糧食出口的特色產(chǎn)品[2-4]。紅蕓豆結(jié)瘤固氮，是倒茬養(yǎng)地的重要作物，必將在種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、居民膳食結(jié)構(gòu)改善及區(qū)域糧食基本自給中發(fā)揮重要的作用；固氮不僅是保障紅蕓豆高產(chǎn)的關(guān)鍵，也是防止氮肥過度施用減輕環(huán)境問題的關(guān)鍵作物[5-7]。

近些年，許多研究報道了microRNA 調(diào)節(jié)豆科植物的結(jié)瘤固氮過程，比如在蒺藜苜蓿中，mtrmiR156通過影響苜蓿的固氮效率和苜蓿根系的再生能力調(diào)節(jié)固氮[8]；在大豆中，gma-miR172c通過靶向下游的NNC1來調(diào)節(jié)大豆結(jié)瘤起始[9]；在花生中，ahy-miR399、ahy-miR159和ahy-miR3508等microRNA 都參與調(diào)控花生結(jié)瘤[10]。MicroRNA（miRNA）是一類常見于真核生物中的內(nèi)源性非編碼RNA，一般由20～22 個核苷酸組成[11]。在植物中，miRNA 通常與靶基因內(nèi)的互補(bǔ)位點結(jié)合，實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和對逆境的響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥miR395通過靶向調(diào)控ATP 磺?；福ˋPS）編碼基因表達(dá)而影響其硫酸鹽的積累和分配[12]；水稻miR395靶向抑制硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因（AST）的表達(dá)，促進(jìn)硫酸鹽積累，miR395過表達(dá)的株系中表現(xiàn)出對細(xì)菌病原體的廣譜抗性[13]。值得注意的是，miR395是調(diào)節(jié)硫吸收和轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而硫元素作為植物的必需營養(yǎng)素，是一些氨基酸、金屬輔因子、輔酶和次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵組成元素[14]。硫饑餓會影響植物的生長、光合作用和產(chǎn)量。在豆科植物中，硫吸收正向調(diào)控結(jié)瘤固氮（SNF），硫饑餓會導(dǎo)致結(jié)瘤減少、抑制固氮效率和降低根瘤代謝等現(xiàn)象[15]，因此，推測其可能參與調(diào)節(jié)豆科植物的共生結(jié)瘤過程。

為探明miR395家族成員是否響應(yīng)根瘤菌的侵染調(diào)控共生結(jié)瘤，本研究利用生物信息學(xué)對蕓豆的miR395家族成員（pvu-miR395）進(jìn)行全基因組鑒定，并對其染色體分布、堿基保守性、二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析，預(yù)測pvu-miR395家族成員的啟動子順式作用元件和靶基因，并利用實時熒光定量PCR檢測pvu-miR395家族成員在紅蕓豆根瘤的表達(dá)和對根瘤菌侵染的響應(yīng)情況，旨在為進(jìn)一步深入研究pvu-miR395家族在蕓豆生長發(fā)育和結(jié)瘤固氮中的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試紅蕓豆品種是品金蕓4 號，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心暢建武研究員和郝曉鵬博士提供。

1.2 方法

1.2.1 蕓豆miR395的全基因組鑒定 從PmiREN[16]數(shù)據(jù)庫（https://www.pmiren.com/）獲取pvu-miR395家族成員的前體序列、成熟序列以及在染色體上的位置信息。

1.2.2 蕓豆miR395的序列及結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)在PmiREN 數(shù)據(jù)庫下載的pvu-miR395家族成員成熟序列和星標(biāo)序列，利用MEGA-X 軟件對其進(jìn)行序列比對，然后通過WebLogo（https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析pvu-miR395家族成員成熟序列和星標(biāo)序列的堿基保守性。使用RNAfold（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）預(yù)測pvu-miR395前體的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)，采用折疊算法選擇最小自由能和分配函數(shù)。

1.2.3 構(gòu)建pvu-miR395家族的進(jìn)化樹 從Pmi-REN 數(shù)據(jù)庫中下載大豆（Glycine max）、苜蓿（Medicago truncatula）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的miR395家族成員的前體序列，利用MEGA-X 軟件構(gòu)建pvu-miR395家族成員前體序列和以上4 個物種的miR395前體序列的進(jìn)化樹，采用最大似然法計算，系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

1.2.4pvu-miR395家族成員的啟動子順式作用元件分析 在PmiREN數(shù)據(jù)庫下載pvu-miR395家族成員的上游2 000 bp作為其啟動子序列，輸入PlantCARE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線數(shù)據(jù)網(wǎng)站，對其順式作用元件進(jìn)行預(yù)測分析。利用TBtools 軟件對pvu-miR395基因家族順式作用元件進(jìn)行分析并繪制熱圖。

1.2.5pvu-miR395靶基因預(yù)測 使用psRNATarget（https://www.zhaolab.org/psRNATarget/）預(yù)測pvu-miR395的靶基因，系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。選取最大期望值≤2 的基因作為靶基因，分析pvumiR395與候選靶基因的相互作用位點。此外，使用Phytozome 數(shù)據(jù)庫（https://phytozome-next.jgi.doe.gov）對所預(yù)測的靶基因進(jìn)行功能注釋。

1.2.6 RNA 提取和qRT-PCR 分析 紅蕓豆培養(yǎng)至長出三出復(fù)葉，用OD600=0.08 的蕓豆根瘤菌R.etliCFN42（Bradyrhizobium etli）[17]處理紅蕓豆幼苗，采集接菌28 d 后的根、葉和根瘤組織，檢測pvumiR395基因家族成員在這3 個組織中的相對表達(dá)水平。同時，采集接菌后0、1、3、6、12、24 h 的根組織，檢測pvu-miR395基因家族在這6 個時間點的相對表達(dá)水平。

用Trizol 法提取蕓豆的RNA[18]，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀檢測RNA 純度和含量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript?miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qPCR 檢測，上游的特異引物根據(jù)所檢測的miR395成熟序列進(jìn)行設(shè)計（表1），下游的引物均為反轉(zhuǎn)錄試劑盒自帶引物Universal miRNA qPCR Primer，用U6作為內(nèi)參基因[19]。實時熒光定量PCR 采用試劑盒PerfectStart?Green qPCR SuperMix，根據(jù)說明書對樣品進(jìn)行qRT-PCR 操作。

表1 研究所用的引物序列Tab.1 Primer sequence in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

按照公式（2－ΔΔCt，ΔCt＝Ct 目標(biāo)基因-Ct 內(nèi)參基因）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，為了保證試驗的準(zhǔn)確性，每個樣品3 個技術(shù)重復(fù)。設(shè)定處理前（0 h）的材料數(shù)據(jù)為對照進(jìn)行相對表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pvu-miR395 家族成員的鑒定及染色體定位分析

為系統(tǒng)鑒定pvu-miR395家族成員，本研究從PmiREN 數(shù)據(jù)庫搜索共獲得位于蕓豆基因組的8 個miR395家族成員，分別命名為pvu-miR395a～pvu-miR395h（表2）。其中，pvu-miR395家族成員的成熟序列和星標(biāo)序列均含有21 個堿基，成熟序列比對結(jié)果顯示，pvu-miR395a、pvu-miR395b和pvu-miR395c高度保守，pvu-miR395e、pvu-miR395f和pvu-miR395g高度保守（圖1-A）。星標(biāo)序列比對結(jié)果同樣顯示其堿基高度保守（圖1-B）。pvumiR395家族分布在第2 號和第3 號染色體上，其中，第2 號染色體上包含pvu-miR395395a、pvumiR395b、pvu-miR395c和pvu-miR395d等4 個成員，其余的pvu-miR395e、pvu-miR395f、pvumiR395g和pvu-miR395h位于第3 號染色體上。

圖1 pvu-miR395 家族成員成熟序列（A）和星標(biāo)序列（B）堿基保守性分析結(jié)果Fig.1 Conservative analysis of mature sequence（A） and star sequence（B） of pvu-miR395 family members

表2 pvu-miR395 家族成員的基本信息Tab.2 Basic information of pvu-miR395 family members

2.2 pvu-miR395 家族成員前體序列的二級結(jié)構(gòu)分析

microRNA 的前體序列決定成熟microRNA 的表達(dá)和序列。為了進(jìn)一步了解pvu-miR395家族成員的作用模式，從PmiREN數(shù)據(jù)庫獲取8個pvu-miR395家族成員的前體序列，最長的pre-pvu-miR395f為104 bp，最短的pre-pvu-miR395e為68 bp。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，所有pre-pvu-miR395均能形成穩(wěn)定的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且所有pvu-miR395家族成員的成熟microRNA 均位于前體序列的5′臂上（圖2）。

圖2 pvu-miR395 家族成員前體序列的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Secondary structure prediction for precursor of pvu-miR395 gene family members

2.3 pvu-miR395 家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

蕓豆與其他植物miR395家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3 所示。

圖3 蕓豆與其他植物miR395 家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of miR395 family members of Phaseolus vulgaris and other plants

為了解pvu-miR395家族成員的功能特征和進(jìn)化關(guān)系，將蕓豆的8 個miR395家族成員的前體序列與大豆、苜蓿、擬南芥和水稻中的miR395家族成員的前體序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)，在擬南芥、苜蓿、水稻、大豆中分別存在6、12、20、23 個miR395家族成員，進(jìn)化樹結(jié)果顯示（圖3），miR395家族成員共分為四大組，其中，第Ⅰ組和第Ⅳ組成員較多（23～27 個），第Ⅱ、Ⅲ組成員較少（7～12 個）。在同一亞家族內(nèi)，種內(nèi)的miR395序列比種間更容易聚類在一起。其中pvu-miR395家族成員分布于4 個組中，每個組中均包含2 個pvu-miR395家族成員。

總的來說，大豆、苜蓿和蕓豆的miR395前體序列比擬南芥、水稻更容易聚類在一起，表明蕓豆miR395家族成員與豆科類作物大豆和苜蓿的親緣關(guān)系較近，其次與雙子葉植物擬南芥較近，而與單子葉植物水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。有意思的是，Group Ⅰ的23 個家族成員96%來源于蒺藜苜蓿、大豆和蕓豆，Group Ⅲ的7 個家族成員全部來自于這3 個物種，Group Ⅰ和Group Ⅲ中包含3 個由大豆和蕓豆序列聚類而成的亞亞支，1 個由蒺藜苜蓿和蕓豆序列聚類而成的亞亞支，推測這可能是豆科植物進(jìn)化出了特異的分支，參與調(diào)控豆科植物結(jié)瘤固氮的調(diào)控。

2.4 pvu-miR395 家族成員啟動子分析

位于啟動子上的順式作用元件是決定基因表達(dá)的關(guān)鍵，為分析pvu-miR395的表達(dá)模式，首先對pvu-miR395啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示，8 個pvu-miR395均含有豐富的順式作用元件，大多數(shù)pvu-miR395啟動子包含與植物激素、脅迫、生長和發(fā)育有關(guān)的順式作用元件。生長發(fā)育元件主要包括光響應(yīng)順式作用元件G-box、Box4 和分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用元件CATbox；與植物激素相關(guān)的響應(yīng)元件主要包括參與脫落酸響應(yīng)的順式作用元件ABRE、乙烯響應(yīng)元件ERE、水楊酸響應(yīng)元件TCA 和赤霉素響應(yīng)元件Pbox；與脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件主要包括與厭氧相關(guān)的響應(yīng)元件ARE、與干旱相關(guān)的響應(yīng)元件MYB 和MYC、應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的順式元件W-box 和as-1。順式作用元件在不同pvu-miR395啟動子中不均勻分布，而在pvu-miR395家族成員的啟動子區(qū)域包含較多的MYB、MYC 元件，說明pvu-miR395可能與蕓豆耐逆相關(guān)。除此之外，pvu-miR395家族成員的啟動子區(qū)域還包含較多的與厭氧相關(guān)的響應(yīng)元件ARE 和激素響應(yīng)元件，植物激素和厭氧環(huán)境對豆科植物的結(jié)瘤和固氮非常重要，暗示了pvumiR395在蕓豆結(jié)瘤固氮中的關(guān)鍵作用。

圖4 pvu-miR395 家族成員順式作用元件分析Fig.4 cis-acting elements analysis of pvu-miR395 family members

2.5 pvu-miR395 家族成員的表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步驗證pvu-miR395是否參與蕓豆結(jié)瘤調(diào)控，采用qRT-PCR 分析pvu-miR395家族成員在紅蕓豆的根、葉及根瘤中的表達(dá)模式，結(jié)果如圖5所示，所有pvu-miR395家族成員在紅蕓豆根瘤中的表達(dá)極顯著高于根和葉中的表達(dá)量（P＜0.001，圖5-A、B、C、D）。進(jìn)一步驗證紅蕓豆pvu-miR395家族成員是否響應(yīng)根瘤菌處理，對根瘤菌處理0、1、3、6、12、24 h 的紅蕓豆的根進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果表明，紅蕓豆根中pvu-miR395的表達(dá)量隨根瘤菌處理時間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在處理6 h 時的表達(dá)量最高。但值得注意的是，在根瘤菌處理6 h時，pvu-miR395a/b/c的表達(dá)仍顯著低于對照（根瘤菌未浸染）的表達(dá)量（P＜0.05，圖5-E），而其余5 個pvu-miR395成員均極顯著高于對照（P＜0.01或P＜0.001，圖5-F、G、H），說明pvu-miR395在6 h時被根瘤菌強(qiáng)烈誘導(dǎo)，推測該miRNA 在此時發(fā)揮著重要作用。這些結(jié)果表明，所有pvu-miR395的家族成員都在結(jié)瘤早期響應(yīng)根瘤菌的侵染，參與調(diào)控蕓豆結(jié)瘤。

圖5 pvu-miR395 家族基因在不同組織和響應(yīng)根瘤菌侵染的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of pvu-miR395 family members in different tissues and in response to rhizobia infection

2.6 pvu-miR395 家族成員的靶基因預(yù)測及功能注釋

MicroRNA 通常通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用，為了進(jìn)一步驗證pvu-miR395家族在結(jié)瘤固氮中的功能，通過psRNATarget 在線預(yù)測結(jié)果，共獲得3 個pvu-miR395可能的靶基因（表3），2 個硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和1 個硫酸腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶。

表3 pvu-miR395 家族成員的靶基因預(yù)測及功能注釋Tab.3 Target gene prediction and functional annotion of pvu-miR395 family members

3 結(jié)論與討論

紅蕓豆是山西的特產(chǎn)，其具有豐富的營養(yǎng)價值和較高的藥用價值。作為一種豆科植物，其生長發(fā)育離不開共生結(jié)瘤與固氮，當(dāng)豆科植物被根瘤菌侵染時，植物會產(chǎn)生類黃酮類物質(zhì)，誘導(dǎo)根瘤菌形成結(jié)瘤因子，進(jìn)而促使根毛彎曲和侵染線形成，以此誘導(dǎo)根瘤發(fā)育和共生固氮[20]。近年研究表明，除了大量的功能基因參與調(diào)控豆科植物的結(jié)瘤固氮，一系列的非編碼基因比如microRNA 也參與調(diào)控豆科植物的結(jié)瘤固氮過程[21-26]，本研究首次系統(tǒng)鑒定了pvu-miR395家族成員，并初步探究了pvu-miR395在紅蕓豆結(jié)瘤固氮中的作用，發(fā)現(xiàn)pvu-miR395家族成員在紅蕓豆根瘤中高表達(dá)，并受根瘤菌侵染的誘導(dǎo)，同時也預(yù)測到其有3 個罰分為2 以下的靶基因，分別是硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和硫酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶，pvu-miR395家族成員可能通過調(diào)節(jié)這些靶基因表達(dá)水平來影響蕓豆的生長發(fā)育，這與已報道的擬南芥和水稻中miR395的靶基因預(yù)測結(jié)果一致[12-13]。前人研究發(fā)現(xiàn)，硫與碳一樣對共生固氮的調(diào)節(jié)和功能至關(guān)重要，固氮酶的生物合成依賴于高濃度硫酸鹽吸收。硫是植物中必需的營養(yǎng)元素，可以提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)。在豆科植物中，硫供應(yīng)可以增強(qiáng)豆科植物的固氮能力，與共生固氮呈正相關(guān)[15,27]。進(jìn)一步佐證pvu-miR395通過靶向硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和硫酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶在結(jié)瘤固氮過程中起到關(guān)鍵作用。

本研究通過生物信息學(xué)從蕓豆基因組中鑒定出8 個miR395的家族成員，這些miR395分布在第2、3 號染色體上，依次命名為pvu-miR395a～pvumiR395h。pvu-miR395成熟序列和星標(biāo)序列堿基高度保守，8 個miR395成員均可形成較穩(wěn)定的二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員可能參與植物激素、脅迫、生長和發(fā)育等過程。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，pvu-miR395的家族成員與大豆和苜蓿的親緣關(guān)系更近。qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，pvu-miR395家族成員在蕓豆的根瘤中高表達(dá)，且pvu-miR395家族成員的表達(dá)顯著抑制根瘤菌的侵染。靶基因預(yù)測表明，pvu-miR395家族成員可能靶向硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白（Phvul.001G250700.1、Phvul.008G170700.1）和硫酸腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶（Phvul.007G062900.1）參與調(diào)控蕓豆的共生結(jié)瘤。通過基因工程手段改造pvu-miR395和靶基因的表達(dá)，將有助于提升紅蕓豆的固氮效率，在提升紅蕓豆的產(chǎn)量的同時減少氮肥的使用，提高農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。