柴文婷 ，李華天 ，趙珊珊 ，楊博慧 ，劉卓君 ，王新宇 ，郝昱寧 ，史小霞 ，郭子浩 ，呂晉慧 ，張春來

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801）

玉米黃素（Zeaxanthin，Zea）在葉黃素循環(huán)的脫環(huán)氧化反應(yīng)中形成，是一種具有強抗氧化活性的類胡蘿卜素，廣泛應(yīng)用于飼料、化妝品、食品和醫(yī)療等方面[1]。在陸地植物中它參與光系統(tǒng)II（PSII）中多余光能的非光化學(xué)淬滅，將多余的能量作為熱量耗散來防止光抑制[2]。玉米黃素可催化轉(zhuǎn)化為紫黃質(zhì)（Violaxanthin），這是ABA 生物合成和葉黃素循環(huán)的關(guān)鍵反應(yīng)，這一反應(yīng)不僅對于ABA 生物合成有重要作用，而且有助于類胡蘿卜素的生物合成。

玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（Zeaxanthin epoxidase,ZEP），是一種參與玉米黃素積累和轉(zhuǎn)化的酶，在植物抗?jié)B透壓和干旱脅迫、種子發(fā)育和休眠等次生代謝過程和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。ZEP 由類囊體腔中的紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶（Violaxanthin deepoxidase，VDE）催化。VDE 活性受到類囊體腔pH 值的嚴格調(diào)節(jié)，確保玉米黃素形成和NPQ 誘導(dǎo)僅在使光合電子傳輸飽和的光強度下發(fā)生[4]。

目前關(guān)于ZEP基因研究已獲得大量成果，ZEP基因主要參與類胡蘿卜素的合成代謝。LEE等[5]將橙辣椒品種與黃辣椒品種雜交進行遺傳分析，并將成熟水果中的類胡蘿卜素含量進行HPLC分析，結(jié)果表明，辣椒果實中的橙色由ZEP中單個隱性突變控制。CRUET-BURGOS 等[6]對345 種高粱種質(zhì)進行的全基因關(guān)聯(lián)分析，挖掘出玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因是控制葉黃素和β-胡蘿卜素變異的主要基因，高粱類胡蘿卜素存在寡源遺傳。SUEMATSU 等[7]通過比較黃肉栽培品種及2 個白肉突變體的轉(zhuǎn)錄組，檢測到38 個與貯藏根中類胡蘿卜素生物合成有關(guān)的基因，并對根中類胡蘿卜素成分進行分析，發(fā)現(xiàn)ZEP旁系同源物參與類胡蘿卜素的積累。此外，ZEP基因在植物響應(yīng)各種環(huán)境脅迫的反應(yīng)中起重要作用，如小麥ZEP1基因可以增強小麥對條銹病的防御能力[8]。

高粱屬于雜糧作物的一種，營養(yǎng)成分高于玉米，是有較高的葉綠素、蛋白質(zhì)和花青素含量[9-10]的雜糧。但較其他糧食作物，其類胡蘿卜素等維生素含量較低，而通過調(diào)控玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶的活性，提高籽粒類胡蘿卜素含量是當前功能農(nóng)業(yè)研究的重點。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)特色作物基因組學(xué)與遺傳改良團隊積累基因組、轉(zhuǎn)錄組、表型組資源，熟練掌握了生物信息分析與分子生物學(xué)實驗技術(shù)，解析高粱抗逆和耐瘠性狀形成機制，已經(jīng)對高粱HSF[11]、ClC[12]、NRT1[13]、NRT2/3[14]和CDL[15]進行了全基因組鑒定、表達和DNA 變異分析，而在高粱種質(zhì)中有關(guān)ZEP基因相關(guān)分子機制的研究較少。

本研究采用生物信息學(xué)方法篩選和鑒定SbZEP基因，并進行初步預(yù)測和分析，對SbZEP基因進行蛋白及基因分析和DNA 變異分析，旨在為研究SbZEP基因的功能提供必要的理論基礎(chǔ)與試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 高粱ZEP 基因成員鑒定

以擬南芥（Arabidopsis thaliana）的ZEP氨基酸序列作為參考，在Phytozome（https：//phytozomenext.jgi.doe.gov）與NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的數(shù)據(jù)庫中完成Blast 查找和對比，獲得ZEP基因蛋白序列、基因序列、CDS 序列。擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、胡蘿卜（Daucus carota）、向日葵（Helianthus annuusL.）、谷子（Setaria italica）、小果咖啡（Coffea arabica）、大豆（Glycine max）、水稻（Oryza sativax）、蓖麻（Ricinus communisL）和藜麥（Chenopodium quinoa）的ZEP蛋白序列來自Phytozome 數(shù)據(jù)庫。

1.2 高粱ZEP 基因生物信息學(xué)分析

采用ExPASY-ProtParam tool 數(shù)據(jù)庫（https://web.expasy.org/protparam/）對相應(yīng)基因的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)完成解析；用GSDS 在線工具（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制高粱ZEP基因結(jié)構(gòu)圖；在NCBI-CDD（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）上下載SbZEP 保守結(jié)構(gòu)域相關(guān)數(shù)據(jù)，用TBtools 進行可視化。運用SignalP-5.0 Server數(shù)據(jù)庫（https://www.services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）檢驗SbZEP 信號肽，在PSORT 數(shù)據(jù)庫（https://www.genscript.com/psort.html）對SbZEP 進行亞細胞定位。利用SOPMA 數(shù)據(jù)庫（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl）完成SbZEP 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，在Phyre2數(shù)據(jù)庫（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi）完成蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)模型的建立與分析，在SAVES v6.0 數(shù)據(jù)庫（https://saves.mbl.ucla.edu/）檢驗三級結(jié)構(gòu)是否正確。

NCBI 上下載SbZEP基因啟動子序列，利用在線軟件Plant CARE（https://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件分析。使用鄰接法（Neighbour joining，NJ）構(gòu)建高粱ZEP基因系統(tǒng)進化樹。在Phytozome 中下載相關(guān)基因表達量數(shù)據(jù)，采用TBtools 軟件繪制熱圖。同時在Phytozome 數(shù)據(jù)庫下載高粱DNA 重測序數(shù)據(jù)，完成SbZEP基因的SNP 的鑒定與注釋。通過STRING 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org），構(gòu)建高粱ZEPs互作蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 SbZEP 基因表達分析

高粱品系R111 的莖、胚珠、種子和SSA1 的種子轉(zhuǎn)錄組，在百邁客公司完成獲取表達量，并采用Exce 11 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbZEP 基因家族基本信息分析

利用高粱各組織的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，得到2 個SbZEP基因。將Sobic.006G097500和Sobic.010G1 81100分別編號為SbZEP1和SbZEP2；2 個基因分別位于6 號染色體46715530—46722401 和10 號染色體52039617—52041596 處，基因長度分別為6 873、1 980 bp（表1）。

表1 SbZEP 基因基本信息Tab.1 Basic information of SbZEP genes

2.2 SbZEP 基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析

SbZEP基因結(jié)構(gòu)顯示（圖1），SbZEP1和SbZEP2分別有15、3 個內(nèi)含子，且SbZEP1在1～3 kb 處存在比SbZEP1更長的內(nèi)含子，推測SbZEP1行使更多的基因功能。

圖1 SbZEP 基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of SbZEP genes

SbZEP 蛋白結(jié)構(gòu)域分析可知（圖2），SbZEP 蛋白共有6 種結(jié)構(gòu)域，SbZEP1 和SbZEP2 均含有UbiH 和FAD_binding_3 這2 種保守結(jié)構(gòu)域，除共有結(jié)構(gòu)域外，SbZEP1 還包含PLN02927、FHA、Ubi-OHases、COQ6，其中，F(xiàn)HA 結(jié)構(gòu)域控制葉黃素循環(huán)和脫落酸生物合成；SbZEP2 還含有Ubi-OHases，參與有氧泛醌生物的合成途徑。推測SbZEP基因與結(jié)構(gòu)域功能密切相關(guān)。

圖2 SbZEP 蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 SbZEP protein domains

2.3 SbZEP 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

從表2 可以看出，SbZEP1 和SbZEP2 蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目分別為672、436 個；分子質(zhì)量大小分別為73 907.68、47 149.42 u；理論等電點分別為8.02 和5.45，SbZEP1、SbZEP2 均為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)（＞40%）的解析顯示，SbZEP 蛋白均是不穩(wěn)定蛋白；SbZEP 蛋白的脂肪溶解系數(shù)較低，說明該蛋白的流動性較差；SbZEP1、SbZEP2 蛋白的平均親水性分別為-0.371 和-0.094，表明SbZEP 蛋白質(zhì)均為親水性蛋白。

表2 SbZEP 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Tab.2 The physicochemical properties of SbZEP proteins

2.4 SbZEP 蛋白質(zhì)信號肽及亞細胞定位分析

根據(jù)蛋白質(zhì)信號肽分布（表3），SbZEP1 和SbZEP2蛋白質(zhì)信號肽分值分別為0.004 5和0.264 3，小于0.5 為非分泌性蛋白。蛋白質(zhì)的亞細胞定位預(yù)測證實，SbZEP1 蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，SbZEP2 蛋白定位在葉綠體上。

表3 SbZEP 蛋白質(zhì)亞細胞定位Tab.3 Subcellular localization of SbZEP proteins

2.5 SbZEP 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

SbZEP 蛋白的二級結(jié)構(gòu)解析結(jié)果如表4 所示。

表4 SbZEP 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析Tab.4 Secondary structure analysis of SbZEP protein %

從表4 可以看出，高粱ZEP 家族各成員中均含有4 種二級結(jié)構(gòu)，其中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲占比最高，這2 種形式涵蓋的氨基酸比例＞70%，由此證明，該基因蛋白主要由這2 種構(gòu)成；而β-折疊和延伸鏈含量較少。以上結(jié)果表明，α-螺旋與無規(guī)則卷曲為SbZEP 蛋白的主要結(jié)構(gòu)成分，延伸鏈與β-折疊則分散在蛋白質(zhì)里。

2.6 SbZEP 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建

SbZEP 蛋白的三級結(jié)構(gòu)組成部分如圖3 所示，其中，α-螺旋與無規(guī)則卷曲所占比例較大，且SbZEP1和SbZEP2 蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型有所差異；使用Ramachandran plot analysis 軟件建立SbZEP 蛋白三級結(jié)構(gòu)模型，可信度＞90.00%。

圖3 SbZEP 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of SbZEP proteins

2.7 高粱ZEP 基因系統(tǒng)進化樹分析

對高粱、擬南芥、胡蘿卜、玉米、向日葵、谷子、小果咖啡、大豆、水稻、蓖麻和藜麥共24 個的ZEP基因家族進行聚類分析（圖4）。

圖4 ZEP 基因家族成員的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ZEP gene family members

圖4 表明，ZEP基因家族可分為4 個亞族，其中，第Ⅰ亞族內(nèi)分布有3 個藜麥和2 個小果咖啡，均為雙子葉植物，擬南芥分布在第Ⅳ亞族，高粱分布在第Ⅱ、Ⅳ亞族中；SbZEP1與Rc30115.m001209、SbZEP2與Seita.7G116800互為直系同源基因，證明高粱和谷子的ZEP基因在演化過程中同源性差異更??；試驗結(jié)果中單子葉植物如玉米、高粱、水稻、谷子與向日葵、藜麥、蓖麻、擬南芥等雙子葉植物對比得知，二者大多不能聚合在同一分支下，說明ZEP基因在進化過程中出現(xiàn)單子葉和雙子葉分化的現(xiàn)象。

2.8 SbZEP 順式作用元件分析

由圖5 可知，SbZEP家族啟動子共預(yù)測到14 種順式作用元件，其中，SbZEP1和SbZEP2均有參與激素響應(yīng)（TGACG-motif、CGTCA-motif 茉莉酸甲酯、ABRE脫落酸）、光響應(yīng)（G-box、GATA-motif、TCT-motif）、MBS 干旱誘導(dǎo)、ARE 厭氧誘導(dǎo)表達和O2-site 玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)元件。此外，SbZEP1還含有CAT-box 與分生組織表達相關(guān)調(diào)控元件，表明SbZEP基因可能參與光反應(yīng)和防御反應(yīng)過程，且SbZEP1可能參與誘導(dǎo)分生組織表達過程。

圖5 SbZEP 基因啟動子區(qū)順式作用調(diào)控元件的功能注釋Fig.5 Functional annotation of the cis-acting regulatory elements of gene promoters of SbZEP

2.9 SbZEP 基因表達分析

SbZEP基因表達熱圖分析顯示（圖6），SbZEP基因在高粱不同生育期不同器官內(nèi)表達水平存在差異；SbZEP1在生育期內(nèi)部分部位的表達水平相對高一些，普遍在莖部和葉片表達，在葉輪生中間時期表達水平最高，同時在葉上部和葉下部區(qū)域表達水平較高。通過SbZEP1基因的完整表達時期結(jié)果可以得出，表達水平由高到低依次為葉輪生中間時期、葉上部和葉下部部位、上輪生葉；在根部和花序中表達水平較低。SbZEP2表達總體低于SbZEP1，且在各部位表達水平均較低。

圖6 在高粱不同發(fā)育時期不同器官SbZEP 的表達Fig.6 Expression of SbZEP at various tissues at different developmental stages

SbZEP在高粱種子、胚珠和莖的表達如圖7 所示，在莖、胚珠中的基因表達水平較高，2 個基因間表達水平有差異，SbZEP1的整體表達水平高于SbZEP2，SbZEP1的表達水平20 d 種子高于10 d。SbZEP2的表達水平SSA1 10 d 種子明顯高于20 d。

圖7 SbZEP 在高粱種子、胚珠和莖的表達水平Fig.7 Expression levels of SbZEP in sorghum seed，ovary，and stem

2.10 SbZEP 基因的DNA 變異分析

根據(jù)Phytozome 數(shù)據(jù)庫內(nèi)重測序結(jié)果得到24 個高粱品種SbZEP的SNP（表5），共篩選出9 個SNP 變異位點，不同品系對應(yīng)不同位點的突變；其中，Std-Broomcorn 品系的SbZEP1在SBI-06的46716082、46716091、46716132、46720862 非同義編碼SNP 變異，分別由甘氨酸Gly 變?yōu)楣劝滨０稧ln，由精氨酸Arg 變?yōu)橘嚢彼酟ys，由酪氨酸Tyr 變?yōu)榻z氨酸Ser，賴氨酸Lys 變?yōu)樘K氨酸Thr；E-Tian 和Keller 品系中SbZEP1在SBI-06的46717731 和46717733 上的突變，分別由蘇氨酸Thr 變?yōu)楸彼酇la；賴氨酸Lys 變?yōu)樘K氨酸Thr；在Ji2731 品系中，SbZEP1在SBI-06的46716260 處的突變，由天冬氨酸Asp 變?yōu)楣劝彼酖lu。Tx642 和Segaolane 品系中SbZEP2在SBI-10的52040014、52040426 位點處，分別由組氨酸His 變?yōu)樘於０稟sn；絲氨酸Ser 變?yōu)楸彼酇la。這些氨基酸的改變，會導(dǎo)致翻譯后做得到的蛋白質(zhì)與之前有差異，將有一定概率影響到蛋白結(jié)構(gòu)與功能。高粱籽粒的DNA 變異數(shù)據(jù)，在之后的試驗中可被用在基因克隆和分子標記篩選。

2.11 SbZEP 蛋白互作分析

SbZEP全基因組的蛋白互作顯示如圖8所示，平均聚類系數(shù)為0.924；PPI富集P值為2.43×10-5。其中，SbZEP1分別與Sobic.06G049200（VDE domaincontaining protein）、Sobic.06G182200（sterol desaturase family）和Sobic.04G074000（Lycopene betacyclase）蛋白互作；SbZEP2分別與Sobic.06G049200和Sobic.10G276400（Chloroplast phytoene synthase 1）蛋白互作；根據(jù)基因功能預(yù)測顯示（表6），Sobic.06G049200參與類胡蘿卜素代謝過程。其中，Sobic.04G074000、Sobic.06G188200 和Sobic.10G2764 00 參與類胡蘿卜素的生物合成與代謝。由此證明，SbZEP基因可能與類胡蘿卜素的含量變化有關(guān)。

圖8 SbZEP 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Network of SbZEP protein interaction

表6 STRING 預(yù)測SbZEP 互作蛋白功能注釋Tab.6 Function annotation of SbZEP interaction protein by STRING prediction

3 結(jié)論與討論

高粱是抗逆性較強的作物之一，且抗逆境的能力比玉米、小麥等更強，提高高粱籽粒類胡蘿卜素含量變成了當前功能農(nóng)業(yè)研究的重點。目前，在煙草[16]和萬壽菊[17]、擬南芥、水稻、玉米等植物中已經(jīng)對其ZEP基因進行克隆和解析[18]。通過從全基因組水平上對SbZEP基因進行分析研究，完成了高粱種質(zhì)中籽粒類胡蘿卜素的全基因組關(guān)聯(lián)分析[19-20]。

本研究在高粱全基因組中鑒定出2 個SbZEP基因，定位于高粱6 號與10 號染色體上，與大洋南綠藻中鑒定的ZEP基因個數(shù)相同[21]。高粱ZEP 蛋白含有UbiH 和FAD_binding_3 這2 種保守結(jié)構(gòu)域，且ZEP1比ZEP2存在更多的結(jié)構(gòu)域和內(nèi)含子，表明SbZEP1基因存在更多的功能。系統(tǒng)進化分析表明，高粱與玉米的親緣關(guān)系更近，ZEP基因進化過程中存在單雙子葉分化現(xiàn)象。研究表明，NoZEPs基因的過表達可增加大洋南綠藻中紫黃質(zhì)及其下游類胡蘿卜素的含量，而導(dǎo)致玉米黃質(zhì)含量的減少[21]。SbZEP 蛋白互作分析表明，ZEP 蛋白調(diào)控類胡蘿卜素生物合成與代謝，但在高粱中ZEP 蛋白參與調(diào)控胡蘿卜素和玉米黃素合成代謝相關(guān)具體分子機制還有待進一步研究。

SbZEP基因啟動子多數(shù)含有響應(yīng)光反應(yīng)和防御反應(yīng)的元件，包括茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACGmotif、CGTCA-motif）和脫落酸響應(yīng)元件ABRE。已有研究表明，玉米黃素在葉綠體中具有重要的光保護功能，強光條件下在類囊體膜中積累[22]，也是SbZEP2在葉綠體內(nèi)表達的原因之一。且脫落酸（ABA）是一種重要的類胡蘿卜素衍生植物激素，是環(huán)境脅迫條件下調(diào)節(jié)生理過程的植物脅迫信號生物合成的關(guān)鍵酶[13]，在植物對生物和非生物脅迫的反應(yīng)以及各種生理和發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[23]。GaZEPs調(diào)節(jié)抗病性和對非生物脅迫的響應(yīng)，如干旱、熱沖擊、低溫、鹽脅迫等[24]。這些結(jié)果預(yù)示了ZEP基因在高粱非生物脅迫的響應(yīng)及光反應(yīng)中的作用。

熱圖分析表明，SbZEP基因都在葉中高表達，在其他部位表達水平較低或不表達，這與LOU等[25]的分析結(jié)果基本一致。擬南芥ZEP 蛋白水平變化受干旱脅迫影響，ZEP 蛋白在ABA 生物合成和葉黃素循環(huán)中的不同功能，導(dǎo)致ZEP 蛋白的組織和應(yīng)激特異性積累，最高水平的ZEP 存在于葉和根中[26]。在亞洲棉花中，葉中GaZEP表達水平與脫落酸水平呈正相關(guān)[23]。由此預(yù)測，SbZEP的表達水平可能受ABA 調(diào)控影響。

SbZEP基因的DNA 變異分析表明，SbZEP在多個位點存在不同的突變，不同突變位點引起氨基酸的改變，這種突變可能與類胡蘿卜素的合成及代謝相關(guān)。玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶不僅是玉米黃質(zhì)變異的主要基因，也是葉黃素和β-胡蘿卜素變異的主要基因，類胡蘿卜素為單基因及多基因變異[27]。擬南芥和高粱野生型OR 中單個氨基酸的改變大大增強了其促進類胡蘿卜素積累的能力[28]。因此，推測高粱不同突變位點對類胡蘿卜素的合成產(chǎn)生不同作用，類胡蘿卜素含量存在遺傳多樣性。

高粱ZEP基因表達分析顯示，高粱在莖、胚珠表達水平較高，結(jié)合熱圖分析可以看出，與SCHWARZ 等[26]和CRUET-BURGOS 等[29]的研究結(jié)果具有較高的一致性。SCHWARZ 等[26]通過對AtZEP 蛋白寡肽的特異性抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析，研究了AtZEP 蛋白在野生型植物不同組織中的分布，在葉片中的蛋白質(zhì)含量最高，其次是莖，根和種子中含量略低。類胡蘿卜素生物合成和降解途徑的大多數(shù)候選基因在高粱種子發(fā)育階段之間存在差異表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在不同高粱品系中，SbZEP基因在種子內(nèi)表達水平不同。AtZEP基因表達在種子發(fā)育過程中受到發(fā)育調(diào)節(jié)，mRNA 水平在種子發(fā)育的后期強烈增加，然后在成熟后的干燥種子內(nèi)降低[30]。在高粱SSA1和R111品系中，SbZEP1的表達水平20 d 種子高于10 d，可能是種子發(fā)育過程中受發(fā)育調(diào)節(jié)引發(fā)的結(jié)果。

本研究中確定的SbZEP基因與類胡蘿卜素含量顯著關(guān)聯(lián)，可用于生物強化工作，以提高高粱的營養(yǎng)質(zhì)量。以上研究成果為玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因功能研究提供了基礎(chǔ)理論，也為研究該基因在葉黃素循環(huán)中的作用機制提供了相關(guān)理論成果。