張青松，楊迎旭，諶童童

鄭州市中心醫(yī)院甲狀腺外科，鄭州 450000

甲狀腺乳頭狀癌是臨床較為常見的惡性腫瘤，占所有甲狀腺惡性腫瘤的60%～90%，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。甲狀腺乳頭狀癌好發(fā)于女性，與其他病理類型的甲狀腺癌相比預后較好，但由于存在明顯的淋巴結轉移傾向，且淋巴結轉移發(fā)現(xiàn)越晚，轉移數(shù)目就會越多，若不盡早治療，易加重病情，治療效果并不理想[3]。相關研究顯示，約50%的甲狀腺乳頭狀癌患者經(jīng)手術治療后，仍然會存在明顯的淋巴結轉移傾向，存在一定的二次手術風險[4-5]。因此，早發(fā)現(xiàn)、早治療是改善甲狀腺乳頭狀癌患者預后的關鍵，但微小淋巴結轉移病灶往往不能進行早期治療而延誤最佳的手術治療時間。甲狀腺乳頭狀癌患者的預后與多種因素有關，目前關于血管內皮生長因子D（vascular endothelial growth factor D，VEGFD）、miRNA-34 的表達與甲狀腺乳頭狀癌患者預后關系的研究較少[6-7]?；诖?，本研究探討VEGFD、miRNA-34 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及與患者預后的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年5 月至2019 年7 月鄭州市中心醫(yī)院收治的甲狀腺乳頭狀癌患者。納入標準：①符合《甲狀腺微小乳頭狀癌診斷與治療中國專家共識（2016 版）》[8]中甲狀腺乳頭狀癌的診斷標準，經(jīng)病理學檢查確診；②無肝腎功能異常；③未合并其他惡性腫瘤；④臨床資料完整。排除標準：①合并代謝性疾病；②合并認知功能障礙或精神疾病；③妊娠期或哺乳期女性。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入352 例甲狀腺乳頭狀癌患者，其中男152 例，女200 例；年齡22～63 歲，平均（31.46±4.25）歲；腫瘤最大直徑1～4 cm，平均（2.32±0.23）cm；臨床分期：Ⅰ期85 例，Ⅱ期84 例，Ⅲ期91 例，Ⅳ期92例。選取同期鄭州市中心醫(yī)院收治的349 例甲狀腺結節(jié)患者，其中男118 例，女231 例；年齡21～61歲，平均（30.87±4.16）歲；結節(jié)最大直徑1～5 cm，平均（2.41±0.21）cm。甲狀腺乳頭狀癌患者與甲狀腺結節(jié)患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組化法檢測VEGFD 的表達情況

取352 例甲狀腺乳頭狀癌患者的甲狀腺乳頭狀癌組織及349 例甲狀腺良性病變患者的正常甲狀腺組織，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為3～4 μm，抗原修復，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次3 min。采用內源性過氧化物酶阻斷劑（試劑A）室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性，PBS 沖洗3 次，每次3 min。一抗采用羊抗人VEGFD 多克隆抗體，室溫孵育150 min，PBS沖洗3次，每次3 min，加入聚合酶輔助劑（試劑B），室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min。二抗采用辣根過氧化物酶標記的羊抗人免疫球蛋白G 多聚合體（試劑C），室溫孵育30 min；新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，在顯微鏡下終止顯色，復染，中性樹膠封片，光鏡下觀察。以PBS 代替一抗作為陰性對照。結果判定[9]：依據(jù)染色強度和陽性細胞所占比例進行評分。無著色計0 分，淡黃色染色計1 分，棕黃色染色計2分，棕褐色染色計3 分；陽性細胞所占比例﹤25%計1 分，陽性細胞所占比例25%～50%計2 分，陽性細胞所占比例﹥50%計3 分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘，≤2 分為陰性表達，﹥2 分為陽性表達。

1.3 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測miRNA-34 的表達情況

取352 例甲狀腺乳頭狀癌患者的甲狀腺乳頭狀癌組織及349 例甲狀腺良性病變患者的正常甲狀腺組織，提取總RNA，紫外分光光度儀和1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性，反轉錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA 為模板，使用PCR 引物進行PCR 擴增，進行反轉錄。向得到的反應液中添加不含RNA 酶的水補至50 μl，取1 μl 稀釋液進行下一步熒光定量RT-PCR：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。每個樣本設置2 個復孔，每批樣本設置1 個空白對照。采用2-△△Ct法計算miRNA-34 的相對表達量，以相對表達量0.247 為臨界值[10]，將miRNA-34 相對表達量﹥0.247 判定為陽性，≤0.247 判定為陰性。

1.4 隨訪

采用電話或門診復查方式對甲狀腺乳頭狀癌患者進行為期3 年的隨訪，隨訪時間截至2022 年7月。依據(jù)隨訪結果將甲狀腺乳頭狀癌患者分為預后良好組和預后不良組，將復發(fā)、轉移、死亡判定為預后不良，其余判定為預后良好。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；甲狀腺乳頭狀癌患者預后不良的影響因素采用多因素Logistic 回歸分析；以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VEGFD、miRNA-34 表達情況的比較

甲狀腺乳頭狀癌組織中VEGFD、miRNA-34 陽性表達率均明顯高于正常甲狀腺組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織中VEGFD、miRNA-34 表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同預后情況甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征的比較

隨訪3 年，352 例甲狀腺乳頭狀癌患者中預后良好319 例，預后不良33 例，分別作為預后良好組和預后不良組。預后良好組和預后不良組甲狀腺乳頭狀癌患者年齡、腫瘤最大直徑、性別、分化程度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）；預后良好組和預后不良組甲狀腺乳頭狀癌患者淋巴結轉移情況、VEGFD 表達情況、miRNA-34 表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。（表2）

2.3 甲狀腺乳頭狀癌患者預后影響因素的多因素分析

將2.2 中差異有統(tǒng)計學意義的淋巴結轉移情況、VEGFD 表達情況、miRNA-34 表達情況作為自變量，甲狀腺乳頭狀癌患者的預后作為因變量，納入多因素Logistic 回歸分析，結果顯示，淋巴結轉移、VEGFD 陽性表達、miRNA-34 陽性表達均是甲狀腺乳頭狀癌患者預后不良的獨立危險因素（P﹤0.05）。（表3）

表3 甲狀腺乳頭狀癌患者預后影響因素的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

甲狀腺癌是頭頸部較為常見的內分泌腫瘤，約10%的甲狀腺結節(jié)會惡化進展為甲狀腺癌，其中甲狀腺乳頭狀癌占所有甲狀腺惡性腫瘤的80%以上，與其他惡性腫瘤相比，甲狀腺乳頭狀癌生長速度較慢，預后較好，且好發(fā)于女性[11]。但由于15%左右的甲狀腺乳頭狀癌存在不同程度的惡性行為，可出現(xiàn)局部浸潤、遠處轉移，手術及放療效果并不理想。隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展及研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多基因及多階段相互作用的結果[12-13]?；诖耍柽M一步探討VEGFD、miRNA-34在甲狀腺乳頭狀癌中的作用。

目前臨床越來越重視miRNA 與甲狀腺相關聯(lián)的研究，探討miRNA 異常表達與甲狀腺癌的關系有重要意義，其中miRNA 突變、缺失及表達異常均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，參與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡過程，有助于疾病的診斷、治療及預后評估[14]。miRNA-34 編碼基因位于基因脆性位點區(qū)域，當腫瘤基因的染色體出現(xiàn)異常，會導致miRNA-34 表達水平的改變。阮圣輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34 與細胞的放射敏感性有關，放射敏感性高的細胞經(jīng)照射后，miRNA-34呈高表達，甲狀腺是放療敏感器官，放射線是目前唯一確定的甲狀腺癌危險因素，說明甲狀腺接受放射線照射會導致miRNA-34 表達上調，導致腫瘤的發(fā)生，這可能是因為miRNA-34 可通過靶向不同目的信使RNA，調控宿主蛋白的表達水平，導致細胞功能失常，從而導致組織病變甚至腫瘤的發(fā)生。本研究結果顯示，與正常甲狀腺組織比較，甲狀腺乳頭狀癌組織中miRNA-34 的表達明顯上調，提示miRNA-34 在甲狀腺乳頭狀癌細胞分化、浸潤和轉移中發(fā)揮重要作用，可能與淋巴結轉移的預測結果有關。

亓軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFD 與受體結合后可激活受體酪氨酸激酶信號通路，誘導內皮細胞增殖，促進腫瘤淋巴管生成和擴張，增加入侵細胞與淋巴管的接觸，從而促進淋巴結轉移。本研究結果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中VEGFD 的表達明顯上調，其高表達可能與腫瘤細胞通過淋巴管轉移及區(qū)域淋巴結轉移有關。

甲狀腺乳頭狀癌細胞的分化、侵襲、轉移可明顯影響患者的預后，研究認為，甲狀腺乳頭狀癌患者的預后可能與淋巴結轉移有關[17]。本研究結果顯示，預后不良的甲狀腺乳頭狀癌患者VEGFD、miRNA-34 陽性表達率較高，且多因素Logistic 回歸分析結果顯示，淋巴結轉移、VEGFD 陽性表達、miRNA-34 陽性表達均是甲狀腺乳頭狀癌患者預后不良的獨立危險因素（P﹤0.05）。表明淋巴結轉移情況、VEGFD 表達情況、miRNA-34 表達情況對甲狀腺乳頭狀癌患者的預后均有重要的參考價值，臨床需加強對上述3 個指標的監(jiān)測，以改善患者的預后。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌組織中VEGFD、miRNA-34 均呈高表達，且與患者的預后密切相關，淋巴結轉移、VEGFD 陽性表達、miRNA-34 陽性表達均是甲狀腺乳頭狀癌患者預后不良的獨立危險因素。