程 晶

（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州 362000）

銀杏科銀杏屬植物銀杏的外種皮，種子即白果，樹皮均可以入藥，本次研究銀杏葉，其主要活性成分包括：銀杏葉黃酮類化合物、銀杏葉萜內(nèi)酯化合物、銀杏葉聚戊烯醇內(nèi)酯、銀杏葉多糖類、銀杏葉烷基芬酸類化合物、銀杏葉有機酸類、銀杏葉精油的化學(xué)成分及銀杏葉其他營養(yǎng)成分。

銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extract，GBE）具有抗氧化、改善微循環(huán)及腦保護等作用。已經(jīng)有證據(jù)指出，GBE 對社會隔離小鼠行為學(xué)具有改善作用。

本課題挑選三周齡剛斷奶的青年仔鼠作為實驗動物而建立青少年期久坐乏運動的實驗動物模型，通過優(yōu)化提取溶劑獲得較優(yōu)的提取條件，并使用該條件下獲得的提取物探討銀杏葉提取物對青少年期久坐乏運動大鼠行為學(xué)的影響，揭示相關(guān)調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路。該項目的成功實施有利于銀杏葉提取物藥用價值的開發(fā)，為銀杏葉提取物在臨床干預(yù)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

銀杏葉（野外采摘）；蘆丁對照品（江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司）；乙醇（AR）、甲醇（AR）、丙酮（AR）（西隴化工有限公司）；SD 大鼠（維通利華動物實驗責(zé)任有限公司）。

DHG-9140A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200B 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水儀（Millipore 公司）；ME104E 型電子天平[梅特勒托利多科技（中國）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉提取物的制備

新鮮摘取的銀杏葉，挑選無蟲害，無化肥，無蟲藥噴灑過，清洗自然風(fēng)干后于65℃烘干至重量恒定，粉碎后過60目篩。參考馮金霞等的方法，取10 g 干燥銀杏葉，按銀杏葉與溶劑的質(zhì)量比為1∶8加入溶劑，回流提取3 h，真空干燥，溫度控制在60℃后稱重，測總黃酮含量。

1.2.2 提取溶劑的選擇和優(yōu)化

根據(jù)制備方法，通過單因素實驗，選用不同濃度的三種溶劑，乙醇（10%~90%）、甲醇（10%~90%）及丙酮（10%~90%）進行提取，以提取物的提取率作為評價指標(biāo)。提取率=（提取物質(zhì)量/干燥銀杏葉質(zhì)量）×100%

采用L9（34）表進行正交試驗，因素水平見表1，選取溶劑比例（A）、浸提次數(shù)（B）和浸提時間（C）作為考察因素進行正交優(yōu)化試驗，以提取物的總黃酮含量為評價指標(biāo)，確定銀杏葉提取物的提取優(yōu)化工藝條件。參照黃曉冬等[18]的方法測定總黃酮含量，總黃酮含量以蘆丁計。

表1 正交實驗因素水平

2 結(jié)果與討論

銀杏葉提取物的制備：選擇三種不同溶劑，乙醇（10%~90%）、甲醇（10%~90%）及丙酮（10%~90%）進行提取，以提取物的提取率作為評價指標(biāo)。結(jié)果表明，以乙醇作為提取溶劑時，60%~80%的乙醇一次提取率趨于穩(wěn)定，均在68%以上；以甲醇作為提取溶劑時，60%的甲醇一次提取率最高，約為60%；以丙酮作為提取溶劑時，60%的丙酮一次提取率最高，約為72%，但后續(xù)處理困難。因此選用60%~80%的乙醇作為提取溶劑。

采用正交試驗，優(yōu)化各因素不同水平下銀杏葉提取物的最優(yōu)制備方法，以總黃酮含量作為評判指標(biāo)。正交設(shè)計與實驗結(jié)果的直觀分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析

從表2、表3 可以看出，影響銀杏葉提取物提取工藝的因素依次是溶劑比例、浸提次數(shù)、浸提時間。獲得的最佳工藝組合為A2B3C2，即溶劑比例為70%，浸提次數(shù)為3次，浸提時間為3 h。由表3可知，各因素銀杏葉提取物提取工藝均無顯著性影響。在此條件下，重復(fù)3次試驗，銀杏葉提取物中總黃酮含量平均為57.04%，RSD 為0.75%。

3 討論

隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展，越來越科技化、簡單化、便捷化的生活形式使得人們體力活動缺乏甚至消失，結(jié)腸癌、2型糖尿病、肥胖綜合征等的出現(xiàn)增加罹患心血管疾病的風(fēng)險。Laufs 等[6]首先通過動物單一運動量實驗證實能引起動物內(nèi)皮功能受損，傳統(tǒng)的誘發(fā)心血管疾病的風(fēng)險因子有氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，而在乏運動干預(yù)的研究中，模擬人類的久坐，少運動的生活習(xí)性，對于沒有基礎(chǔ)疾病的人也能引起血管功能內(nèi)皮障礙。本課題組前期研究發(fā)表的《銀杏葉提取物對青春缺乏運動大鼠行為學(xué)的影響》中模擬大鼠單一運動，久坐不運動，中強度運動等模式，干擾大鼠的正常生活習(xí)性，發(fā)現(xiàn)缺乏運動組大鼠腦實質(zhì)氧化應(yīng)激程度呈現(xiàn)過氧化失衡狀態(tài)，銀杏葉提取物注射后SOD 活性上調(diào)，MDA 含量降低，逆轉(zhuǎn)機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。此外，You 等[8]首次在上述實驗中加入一定時間的獨處行為模式，既減少動物的運動行為，又孤立個體。獨處孤立無外交行為的生活方式所致的心理因素也可能引起動物機體免疫系統(tǒng)功能改變，通過丘腦-垂體-腎上腺素軸等調(diào)控機制引起一系列行為動作上的改變甚至機體病理生理改變，這方面應(yīng)該予以重視。

林麒等[11]進行皮膚感覺、肌力、腱反射、增加正中神經(jīng)、腓總神經(jīng)運動傳導(dǎo)速度和感覺傳導(dǎo)速度的相關(guān)實驗研究，觀察各種數(shù)據(jù)指標(biāo)，聯(lián)合用藥。通過兩者之間的協(xié)同作用治療糖尿病神經(jīng)病變，聯(lián)合用藥可以改善周圍神經(jīng)組織的微循環(huán)，促進神經(jīng)組織修復(fù)。陳紅輝等[13]利用水迷宮及避暗試驗，研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物給藥一段時間后能有效改善老齡癡呆大鼠模型在水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶障礙，增加大腦海馬區(qū)乙酰膽堿的含量。動物行為學(xué)已經(jīng)是一門應(yīng)用于各個領(lǐng)域的判斷動物行為改變、恢復(fù)并輔助治療疾病矯正訓(xùn)練的工具學(xué)科。有研究報道指出，銀杏葉提取物配合康復(fù)鍛煉能有效改善輕度認知障礙患者的認知功能及生活自理能力。銀杏葉提取物對社會隔離小鼠行為學(xué)亦具有改善作用。

20世紀60年代，德國和法國科學(xué)家從一株中國古老銀杏樹里提取出銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯后驗證其具有抗心腦血管疾病功效，于是國際醫(yī)藥市場上即時地出現(xiàn)了以銀杏葉提取物為主要制劑的藥品，其中以“梯保寧”和“金納多”為代表被廣泛運用于國際市場。臨床上用銀杏葉提取物輔助治療糖尿病、心腦血管疾病、血管性癡，其主要原因是它能明顯地抗氧化保護腦組織改善微循環(huán)。由于銀杏葉提取物注射給藥青少年缺乏運動模型后出現(xiàn)的行為學(xué)改變鮮少有報道。因此實驗研究通過新鮮銀杏葉的制備，在提取工藝不同、時間不同、溶劑不同的情況下挑選制備最佳黃酮含量的方法，并將得到的制備物作用于青少年期久坐缺乏運動實驗動物模型中，模型是將24只4周齡SD 雄鼠完全隨機分為正常群居飼養(yǎng)組（GH）、乏運動獨籠飼養(yǎng)組（AS）、銀杏葉提取物獨籠干預(yù)組（GBE），干預(yù)性飼養(yǎng)至8周齡，探討銀杏葉提取物對青少年期久坐缺乏運動大鼠行為學(xué)的影響，同時通過多個行為學(xué)的檢測的指標(biāo)：礦場試驗、新物體識別試驗、入侵試驗、強迫游泳試驗，分析該黃酮含量對其行為學(xué)的改變。分析得出：曠場試驗中，AS 組大鼠安靜時間減少，在曠場中央?yún)^(qū)域停留時間和次數(shù)減少。新物體識別試驗中，AS 遠離新物體，不碰觸不探究情況居多。入侵實驗中AS 組的攻擊性明顯高于其他兩組。強迫游泳實驗中，同樣的時間內(nèi)，AS 組游泳的圈數(shù)更多，應(yīng)激反應(yīng)更強烈。8周GBE 干預(yù)后，AS 組的晝夜活動情況、安靜時間得到逆轉(zhuǎn)，焦慮情緒緩解。初步揭示本實驗制備的銀杏葉提取物改善久坐缺乏運動大鼠行為學(xué)機制。

4 結(jié)論

銀杏葉提取物的藥理活性與溶劑比例、浸提次數(shù)、浸提時間有關(guān)，選擇乙醇作為溶劑后，黃酮的一次性提取率優(yōu)于其他兩種溶劑，使得藥物活性成分發(fā)揮優(yōu)異效果，有利于銀杏葉提取物藥用價值的開發(fā)，為銀杏葉提取物在臨床干預(yù)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。