鄒晶晶 郭敬強(qiáng)

胰腺癌發(fā)病率和死亡率逐年升高[1]。胰腺癌早期無(wú)特異性臨床癥狀，診斷存在一定困難。胰腺癌惡性程度高，進(jìn)展快，預(yù)后差[2]。尋找早期篩查的生物標(biāo)志物和提高早期診斷率能夠改善胰腺癌預(yù)后[3-4]。目前胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚未闡明，臨床上缺乏特異性的診斷和治療靶標(biāo)。篩查特異性、敏感的胰腺癌生物標(biāo)志物是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞周期蛋白B2（cyclin B2，CCNB2）是B 型細(xì)胞周期蛋白家族成員，位于高爾基體，是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的重要組成部分。已有研究發(fā)現(xiàn)CCNB2 在肺癌[5]、結(jié)直腸癌[6]、腦膠質(zhì)瘤[7]等多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于CCNB2 在胰腺癌中功能、預(yù)后評(píng)估的報(bào)道甚少。本研究基于生物信息學(xué)技術(shù)，探討CCNB2 基因表達(dá)與胰腺癌關(guān)系，為胰腺癌的早期診療、病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后監(jiān)測(cè)提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 GEPIA 使用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）平臺(tái)，基于癌癥基因組圖譜（The Camcer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx 數(shù)據(jù)?！癊xpression DIY”模塊分析CCNB2 基因在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)，|log2FC| Cut-off 值設(shè)置為1，Cut-off 值設(shè)置為0.01?！癇ox Plot”模塊分析臨床分期與CCNB2 基因表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CCNB2 基因表達(dá)與胰腺癌分期呈負(fù)相關(guān)；“Survival Analysis”模塊分析CCNB2 基因表達(dá)水平高低與生存指標(biāo)關(guān)系。

1.2 Ualcan 使 用Ualcan（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）平臺(tái)，在“TCGA analysis”模塊下的“TCGA gene analysis”界面，Scan by gene 輸入“CCNB2”，TCGA dataset 輸 入“Pancreatic adenocarcinoma”，選擇“Explore”，分別選擇“Expression”“Methylation”“Survival Analysis”，分析胰腺癌組織與正常胰腺組織中CCNB2 基因的表達(dá)和甲基化情況。

1.3 Timer 在Timer（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）平臺(tái)，選擇Timer 基因分析模塊，在“Gene Symbol”輸入“CCNB2”，在“Cancer Types”輸入“PAAD”，分析CCNB2 基因與胰腺癌免疫細(xì)胞之間關(guān)系，并構(gòu)建多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型。

1.4 cBbioPortal 在cBbioPortal（https://www.cbioportal.org/）平臺(tái)進(jìn)行胰腺癌CCNB2 基因突變分析?！癚uery”模塊輸入“PAAD”查詢，選擇所有數(shù)據(jù)庫(kù)，“Query By Gene”輸入“CCNB2”，點(diǎn)擊“Submit Query”“Mutations”進(jìn)行分析。共納入1 034 例樣本，來(lái)源2012 年Nature ICGC 數(shù)據(jù)99 例，2015 年Nat Commu UTSW 數(shù)據(jù)109例，2016 年Nature QCMG 數(shù)據(jù)456 例，F(xiàn)irehose Legacy TCGA 數(shù)據(jù)186 例，Pancancer Atlas TCGA 數(shù)據(jù)184 例。

1.5 STRING STRING（https:// string-db.org/）是在線可評(píng)估物種蛋白質(zhì)相互關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)。評(píng)估分?jǐn)?shù)越高，蛋白存在相互作用的可信度越高。在STRING 界面，“Protein Name”輸入“CCNB2”，“Organisms”選擇物種“Homo sapiens”，CCNB2 相互作用蛋白。同時(shí)對(duì)CCNB2 基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進(jìn)行通路富集分析，推測(cè)CCNB2在胰腺癌中的相關(guān)功能和途徑。

1.6 GeneMANIA GeneMANIA（http://genemania.org/）是交互式、可視化的在線蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)工具，對(duì)給定的基因查詢列表進(jìn)行分析，通過(guò)識(shí)別出功能相似的基因，來(lái)獲得目標(biāo)基因的相互作用蛋白[8]。本研究設(shè)置基因列表為CCNB2，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，以獲得相互作用蛋白。

2 結(jié)果

2.1 CCNB2 基因表達(dá)結(jié)果 采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)和Ualcan 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CCNB2 基因在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示胰腺癌組織中CCNB2 基因表達(dá)水平高于正常胰腺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1A、B（插頁(yè)）。隨著胰腺癌的進(jìn)展，腫瘤臨床分期偏遲，癌組織中CCNB2 基因表達(dá)水平下降（P＜0.05），見(jiàn)圖1C（插頁(yè)）。與正常胰腺組織比較，CCNB2 基因甲基化水平在胰腺癌組織中更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1D（插頁(yè)），說(shuō)明胰腺癌具有高甲基化水平。

圖1 胰腺癌腫瘤組織和正常胰腺組織中CCNB2 基因表達(dá)、甲基化水平和基因表達(dá)和臨床分期之間關(guān)系[A：GEPIA 分析CCNB2在胰腺癌和正常組織表達(dá)，aP＜0.05；B：Ualcan 分析CCNB2 在胰腺癌和正常組織表達(dá)；C：CCCNB2 基因表達(dá)與臨床分期的相關(guān)；D：CCNB2 基因在胰腺癌和正常組織甲基化水平]

2.2 CCNB2 基因在胰腺癌組織突變分析 6 項(xiàng)數(shù)據(jù)庫(kù)中1 034 例樣本共檢出3 例突變，包括1 例重復(fù)突變多樣本的患者，突變發(fā)生率為0.3%，見(jiàn)表1。

表1 胰腺癌組織中CCNB2 基因突變分析

2.3 胰腺癌組織CCNB2 基因表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞結(jié)果分析 胰腺癌中CCNB2 基因表達(dá)與B 淋巴細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)均呈正相關(guān)（均P＜0.05）。Kaplan-Meier 生存曲線顯示，高水平的CCNB2 患者生存率與低水平患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。同時(shí)構(gòu)建多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型見(jiàn)表2，胰腺癌預(yù)后的影響因素包括年齡和CCNB2 基因表達(dá)。

表2 胰腺癌多變量Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型

圖2 胰腺癌組織CCNB2 基因表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)果（A：腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和CCNB2 基因表達(dá)相關(guān)性；B：胰腺癌組織CCNB2 基因高低表達(dá)患者的Kaplan-Meier 生存曲線，P＜0.01）

2.4 CCNB2 基因表達(dá)與胰腺癌患者臨床預(yù)后關(guān)系高表達(dá)CCNB2 基因的胰腺癌患者的總生存時(shí)間、無(wú)病生存時(shí)間和生存率均偏低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖3（插頁(yè)）。

圖3 CCNB2 基因表達(dá)與胰腺癌患者臨床預(yù)后指標(biāo)的分析結(jié)果（A：總生存時(shí)間；B：無(wú)病生存時(shí)間；C：生存率）

2.5 CCNB2 蛋白相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)GeneMANIA 網(wǎng)站預(yù)測(cè)CCNB2 的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了包括CDK1、CDK2、CCNB1 等在內(nèi)的20 個(gè)關(guān)鍵互作分子，見(jiàn)圖4A（插頁(yè)）。使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建與CCNB2 蛋白可能存在的相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4B（插頁(yè)），發(fā)現(xiàn)與CCNB2 蛋白相關(guān)相互作用評(píng)分前10位蛋白，分別是CDC20（Score=0.999）、CDK1（Score=0.999）、CCNB1（Score=0.998）、CDK2（Score=0.998）、CKS2（Score=0.998）、PLK1（Score=0.997）、NCAPG（Score=0.996）、CKS1B（Score=0.996）、AURKA（Score=0.995）、BUB1（Score=0.995）。和GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致。同時(shí)通過(guò)富集分析可能的功能及參與的信號(hào)通路等，見(jiàn)表3、4。

表3 CCNB2 蛋白KEGG 通路富集分析

表4 CCNB2 蛋白GO 富集分析

圖4 CCNB2 蛋白相互作用蛋白分析（A：GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)CCNB2 的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；B：STRING 數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)CCNB2 的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)）

3 討論

胰腺癌預(yù)后較差，發(fā)現(xiàn)特異度強(qiáng)、靈敏度高的標(biāo)志物，對(duì)改善其預(yù)后至關(guān)重要[9]。CCNB2 在多種癌組織中高表達(dá)，與腫瘤患者病情密切相關(guān)[10-12]。目前，CCNB2 在胰腺癌功能及機(jī)制方面的研究報(bào)道極少。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)分析CCNB2 在胰腺癌組織中表達(dá)情況，系統(tǒng)評(píng)估其在胰腺癌的發(fā)病及預(yù)后中的價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中CCNB2 表達(dá)高于正常胰腺組織。與CCNB2 低表達(dá)胰腺癌患者比較，CCNB2 高表達(dá)患者總生存時(shí)間、無(wú)病生存時(shí)間和生存率均偏低。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析發(fā)現(xiàn)，CCNB2 高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后更差，表明CCNB2 高表達(dá)可能在胰腺癌的發(fā)病過(guò)程中起到作用。同時(shí)分析胰腺癌組織中CCNB2 啟動(dòng)子甲基化的水平和基因突變情況，顯示胰腺癌組織中為高甲基化水平，基因突變率只有0.3%，表明CCNB2 基因的高甲基化可能是胰腺癌的一種潛在致病機(jī)制CCNB2 基因的突變可能不是胰腺癌發(fā)病的主要機(jī)制。可見(jiàn)CCNB2 可能是胰腺癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子。

胰腺癌的免疫治療效果差強(qiáng)人意，可能與腫瘤微環(huán)境免疫抑制有關(guān)[13]。胰腺癌腫瘤微環(huán)境募集調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（regulatory cells，Tregs）或分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成Tregs。Tregs 抑制效應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用，同時(shí)分泌顆粒酶、穿孔素促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡，降低CD8+T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞作用[13-14]。胰腺癌組織可見(jiàn)巨噬細(xì)胞，以M2 型巨噬細(xì)胞居多。在小鼠的肝細(xì)胞肝癌模型中，巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-10，促進(jìn)程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）表達(dá)，抑制T 細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞[15]。巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β 促使腫瘤微環(huán)境募集Tregs，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制；同時(shí)促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞表面PD-1 等抑制性分子表達(dá)，幫助腫瘤細(xì)胞逃逸[16]。極化的M2 型巨噬細(xì)胞抑制T 細(xì)胞抗腫瘤能力，降低胰腺癌小鼠模型對(duì)于化療的敏感性，藥物抑制M2 型巨噬細(xì)胞極化，顯著提高化療效果[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和胰腺癌中CCNB2 基因表達(dá)呈正相關(guān)。構(gòu)建多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型發(fā)現(xiàn)CCNB2 高表達(dá)患者預(yù)后更差。

CCNB2 在胰腺癌中發(fā)揮功能的具體機(jī)制不明。袁藝標(biāo)等[18]報(bào)道MKL1 的小RNA 干擾轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，CCNB2 啟動(dòng)子的表達(dá)顯著降低，從而抑制肺癌轉(zhuǎn)移。通過(guò)蛋白相互作用GO 富集分析發(fā)現(xiàn)CCNB2 相關(guān)的蛋白，主要富集在有絲分裂細(xì)胞周期過(guò)程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)等，這些與CCNB2 參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。KEGG 富集分析預(yù)測(cè)CCNB2 基因可能通過(guò)有p53 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)揮功能。除此之外，還可能通過(guò)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期、人類免疫缺陷病毒1 感染等途徑參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展，需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，基于生物信息學(xué)分析工具，本研究分析了CCNB2 表達(dá)在胰腺癌病情和預(yù)后的作用。發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中CCNB2 高表達(dá)和高甲基化，可能在胰腺癌病情中發(fā)揮重要作用，與胰腺癌預(yù)后不良相關(guān)，有望成為胰腺癌早期診治的切入點(diǎn)。