韓楊楊 張益維 應靜 周海東

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由多種致病因素引起的臨床綜合征，包括敗血癥、嚴重創(chuàng)傷、急性肺炎和急性胰腺炎。隨著病情加重可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1]，其中膿毒癥引起的ALI 是導致ARDS 發(fā)生的重要原因，由于缺乏有效的防治手段，ALI 發(fā)病率和病死率極高[2]。革蘭陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）已被證實可誘發(fā)ALI[3]。LPS在體內主要通過單核巨噬細胞啟動免疫炎癥反應[4]，巨噬細胞作為ALI發(fā)病機制中的關鍵因素已被廣泛證明[5]。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）具有催眠、抗焦慮、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗交感等多種作用，可減輕巨噬細胞炎癥反應，其具體機制未明。自噬幾乎在所有類型的細胞中表達，參與大量天然免疫和適應性免疫反應，并控制其炎癥反應過程[6-7]。本研究擬在觀察Dex對LPS致小鼠ALI的保護作用及肺泡巨噬細胞自噬的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 SPF 級6 周齡雄性C57BL/6 小鼠30 只[杭州子源實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK（浙）2019-0004，合格證號：20220413Abzz0105999861]，體重20～25 g。主要試劑：Dex（揚子江藥業(yè)集團有限公司，批號：21091031）；LPS（上海源葉生物科技有限公司，批號：J05GS150769）；Western blot 法檢測一抗微管相關蛋 白1 輕 鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）B 抗體（美國Abcam 公司，貨號：ab48394），二抗辣根過氧化物酶（HPR）標記的山羊抗兔抗體（杭州聯科生物技術股份有限公司，貨號：GAR0072），βacitin（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：AF0006）；免疫熒光檢測一抗LC3B 抗體（美國Abcam公司，貨號：ab192890），二抗羊抗兔IgG H＆L（美國Invitrogen 公司，貨號：A21429）；一抗CD68 抗體（美國Santa Cruz 公司，貨號：sc79761），二抗羊抗鼠IgG H＆L（美國Invitrogen 公司，貨號：A11001）；4',6-二脒基-2-苯基吲 哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國Sigma 公司，貨號：D9542）。主要儀器：電子天平（南京蘇測電子科技有限公司，SC-DC-1200AS 型）；高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，H1750R 型）；渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器，QL-861 型）；全波長酶標儀（美國Molecular Devices 公司，SpectraMax Plus 384 型）；低速自動平衡離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，TDZ4-WS 型）；輪轉式切片機（德國LEICA 公司，RM2235 型）；病理組織漂烘儀（常州市郝思琳儀器設備有限公司，tec 2500 型）；顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，BX43 型）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司，PYX-DHS500BS-Ⅱ型）；電泳系統（上海Bio-RAD 公司，Mini-Proten Tetra System）；臺式低速離心機（湖南凱達實業(yè)發(fā)展有限公司，TD5A）；激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司，LSM880 型）。

1.2 動物分組及建模 30 只小鼠常規(guī)適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數字表法分為對照組（Con 組）、LPS 組、Dex+LPS 組，每組各10 只。模型制備前禁食12 h，參照文獻[8]腹腔注射LPS 制備ALI 模型。LPS組和Dex+LPS組小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg，Con 組腹腔注射等容量0.9%氯化鈉注射液；其中Dex+LPS 組腹腔注射LPS 前30 min 腹腔注射Dex 50 μg/kg，同時Con 組和LPS 組腹腔注射等容量0.9%氯化鈉注射液。于造模后24 h 小鼠眼眶取全血約0.6 mL，脫頸處死后取肺組織標本，將右肺組織4%甲醛固定，其余肺組織在-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MSS 評分 造模后24 h 觀察動物狀態(tài)，并行小鼠膿毒癥評分（murine sepsis score，MSS）[9]，從以下7 個方面進行評分，即外觀、意識水平、活動、對刺激的反應、眼睛、呼吸頻率及呼吸質量，根據程度按0～4 分打分，將7 項指標得分相加作為總分。（1）外觀：被毛光滑0 分；斑片狀立毛1 分；背部大部分立毛2 分；有或無立毛、身體出現“腫脹”3 分；有或無立毛、并且小鼠顯得憔悴4分。（2）意識水平：小鼠處于活動狀態(tài)0分；處于活動狀態(tài)但避免直立1 分；明顯活動減慢、仍在走動2分；活動受損，只有被激怒時才會移動并伴有震顫3分；活動嚴重受損，被激怒時保持靜止，可能會震顫4分。（3）活動：正常的活動量，小鼠正在做吃、喝、爬、跑和打架0分；活動輕微抑制，在籠子底部移動1 分；活動抑制，小鼠靜止不動，偶爾進行調查運動2 分；沒有活動，小鼠靜止3分；沒有活動，小鼠正在經歷震顫，尤其是后腿4分。（4）對刺激的反應：對聽覺刺激或觸摸反應迅速0 分；對聽覺刺激反應遲緩或無反應，對觸摸反應強烈（逃跑的動作）1 分；對聽覺刺激無反應，對觸摸中等反應（移動幾步）2 分；對聽覺刺激無反應，對觸摸輕微反應（沒有活動）3 分；對聽覺刺激無反應，觸摸時反應很少或沒有，如果被推倒無法自行糾正4 分。（5）眼睛：睜開0 分；眼睛沒有完全睜開，可能有分泌物1 分；眼睛至少半閉，可能有分泌物2 分；眼睛半閉或更多，可能有分泌物3 分；眼睛閉上或混濁不清的4 分。（6）呼吸頻率：正常、快速的呼吸0 分；呼吸輕微減少（無法用肉眼測量）1 分；呼吸中等減少（肉眼定量的上限）2 分；呼吸嚴重減少（頻率易用肉眼測量，呼吸間隔0.5 s）3 分；呼吸極度減少（呼吸間隔＞1 s）4 分。（7）呼吸質量：正常0分；短暫的呼吸困難1 分；呼吸困難，沒有喘氣2 分；呼吸困難伴間歇性喘氣3分；喘氣4分。

1.4 血清TNF-α、IL-6水平檢測 每組隨機選取5只小鼠的全血，采用ELISA 法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-6水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 肺組織病理檢查及肺損傷情況評估 每組隨機選取3只小鼠的右肺上葉組織，石蠟包埋切片后進行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。參照文獻[10]對病理切片顯示的肺組織損傷程度進行病理學半定量評分，包括以下4 項指標：（1）肺泡充血；（2）肺泡出血；（3）間隙（肺泡腔）或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；（4）肺泡間隔（肺泡壁）增厚和（或）透明膜形成。各項指標按損傷嚴重程度進行評分，無損傷或非常輕微損傷為0分，輕度損傷為1分，中度損傷為2分，重度損傷為3分，極重度損傷為4分，將4項指標得分相加作為總分。

1.6 肺組織中自噬相關蛋白（LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ）表達情況檢測 采用Western blot 法。每組隨機選取3 只小鼠的左肺上葉組織，檢測肺組織自噬相關蛋白。提取肺組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜封閉，分別與一抗LC3B 抗體（1∶2 000）及二抗羊抗兔IgG H&L（1∶5 000）孵育，TBST 洗膜后ECL化學發(fā)光顯影，采用凝膠成像系統進行曝光。采用Image J 軟件（美國NIH 公司）分析目標蛋白條帶灰度值，計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

1.7 肺組織LC3B 及CD68 表達情況的檢測 采用免疫熒光染色。每組隨機選取3 只小鼠的右肺下葉標本，進行常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中微波修復，滴加一抗自噬標志物LC3B 抗體（1∶250）、巨噬細胞標志物CD68 抗體（1∶250），4 ℃冰箱孵育過夜，轉至室溫平衡30 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次；滴加熒光二抗羊抗兔IgG H＆L（1∶100），二抗羊抗鼠IgG H＆L（1∶100），37 ℃孵育60 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次；DAPI 染核，甘油PBS 封片，熒光顯微鏡觀察各組小鼠肺組織LC3B 及CD68 表達情況，使用Image-Pro Plus 圖像分析軟件對結果進行分析，并計算LC3B 與CD68 共定位熒光面積/CD68 熒光面積。

1.8 統計學處理 采用SPSS 26.0 統計軟件及Graphpad Prism 9 軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組小鼠MSS 評分的比較 Con 組小鼠外觀、意識水平、活動、對刺激的反應、眼睛、呼吸頻率及呼吸質量正常，MSS 評分為0 分；而LPS 組與Dex+LPS 組小鼠出現了活動減慢，運動減少，呼吸頻率減慢，呼吸費力，眼睛有分泌物，對刺激反應遲鈍等現象，說明膿毒癥造模成功；LPS 組MSS 評分為（22.4±3.4）分，Dex+LPS 組MSS 評分為（21.1±3.3）分，均高于Con 組。造模后24 h 無動物死亡。

2.2 3 組小鼠血清TNF-α、IL-6水平的比較 LPS 組及Dex+LPS 組小鼠血清中TNF-α、IL-6 水平均高于Con 組小鼠（均P＜0.01），但Dex+LPS 組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平均明顯低于LPS組小鼠（均P＜0.01），見表1。

表1 3 組小鼠血清TNF-α、IL-6 水平的比較（pg/mL）

2.3 3 組小鼠肺組織病理檢查結果及肺損傷評分的比較 與Con 組小鼠比較，LPS 組小鼠肺泡結構紊亂，肺組織內出血、損傷嚴重，肺泡及肺間質有滲出物，且有大量中性粒細胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚；Dex+LPS 組小鼠肺組織損傷程度較輕，肺泡間隔有一定程度的增厚，且中性粒細胞浸潤程度也明顯低于LPS 組小鼠，見圖1（插頁）。

圖1 3 組小鼠肺組織病理檢查所見

Con 組、LPS 組及Dex+LPS 組小鼠肺損傷評分分別為（2.1±0.6）、（10.8±0.8）、（8.2±0.5）分，LPS組及Dex+LPS 組小鼠肺損傷評分均高于Con 組（均P＜0.01），且Dex+LPS組小鼠肺損傷評分低于LPS組小鼠（P＜0.01）。2.4 3 組小鼠肺組織LC3 蛋白表達的比較 與Con 組小鼠比較，LPS 組小鼠中肺組織的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調（P＜0.01），Dex+LPS 組小鼠肺組織的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值低于LPS 組小鼠（P＜0.01），見圖2、3。

圖2 3 組小鼠肺組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的比較

圖3 3 組小鼠肺組織LC3 蛋白表達的電泳圖

2.5 3 組小鼠肺組織免疫熒光染色結果比較 免疫熒光染色結果顯示，LC3B 呈紅色熒光，CD68 呈綠色熒光，核呈藍色熒光，見圖4（插頁）。

圖4 3 組小鼠肺組織肺泡巨噬細胞自噬的免疫熒光染色所見

Con 組、LPS 組及Dex+LPS 組小鼠肺組織LC3B 與CD68 共定位熒光面積/CD68 熒光面積分別為0.17±0.06、0.38±0.03 及0.22±0.10，與Con 組小鼠比較，LPS組小鼠中LC3B與CD68共定位熒光面積/CD68熒光面積明顯增加（P＜0.01），提示LPS引起肺泡巨噬細胞自噬增強。而與LPS 組小鼠比較，Dex+LPS 組小鼠中LC3B 與CD68共定位熒光面積/CD68熒光面積減少（P＜0.05）。

3 討論

LPS 是革蘭陰性菌的細胞壁組成成分之一，是膿毒癥最重要的致病因子之一，是在體和離體膿毒癥模型最常用的誘導劑。本研究參照文獻采用小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg 成功建立ALI 模型[8，11-12]。在注射LPS 24 h后，與Con 組比較，LPS 組MSS 評分及肺損傷評分均升高。LPS 組小鼠在造模24 h 后出現活動減慢，運動減少，呼吸頻率減慢，呼吸費力，眼睛有分泌物，對刺激反應遲鈍，體重減輕等現象；病理形態(tài)學表現為ALI，肺泡結構紊亂，肺組織內出血、損傷嚴重，肺泡及肺間質有滲出物，且有大量中性粒細胞浸潤，肺間隔明顯增厚。Con 組肺組織肺泡壁也存在部分斷裂，考慮是切片制備過程導致。肺泡內出血、滲出及炎性浸潤少，視野內斷裂會更加明顯。這與Zhang等[8]研究結果相符。

膿毒癥ALI 中，各種吞噬細胞如巨噬細胞，大量聚集于肺中，產生大量炎癥因子和趨化因子，引起肺組織過度炎癥反應，引起ALI，最終導致ARDS[13]。在膿毒癥早期，巨噬細胞被過度激活并釋放大量的炎癥因子，如IL-6、IL-1、TNF-α 和大量趨化因子如趨化因子配體8-11（CCL8-11）、趨化因子配體2-4（CCL2-4），引起Th1 細胞介導的免疫反應，從而導致炎癥反應失控、休克、器官損害[14-15]。自噬又名Ⅱ型程序性細胞死亡，是真核細胞的一個高度保守過程，對維持細胞的正常功能起著至關重要的作用[16]。LC3 是參與形成自噬體膜的重要結構蛋白，在發(fā)生自噬過程中，Atg4 將LC3 斷開，形成LC3-Ⅰ；LC3-Ⅰ在Atg3 和Atg7 的作用下與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）共價綁定形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ結合于自噬體膜上[17]。LC3-Ⅱ是組成自噬體膜的重要結構蛋白，因此可以用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值來反映自噬水平的高低[17]。本研究中，與Con 組比較，免疫熒光結果顯示LPS 組巨噬細胞數量顯著增多，外周血血清TNF-α、IL-6 水平均升高。Western blot 法檢測結果顯示LPS 組肺組織的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調，提示LPS 導致小鼠ALI 出現全身炎癥反應增強，自噬增強。

Dex 是一種高選擇性的α2 腎上腺素能受體激動劑。本研究參照文獻[18-19]，選擇在造模前30 min腹腔注射Dex 50 μg/kg。Dex 對LPS 導致的小鼠ALI 具有保護作用[20]。本研究發(fā)現，與LPS 組比較，Dex+LPS組小鼠膿毒癥評分及肺組織肺損傷評分降低，同時外周血血清TNF-α、IL-6 水平下降，提示Dex 能夠減輕小鼠LPS 導致的ALI，抑制炎癥反應。目前關于Dex 對LPS 導致的ALI 保護作用的機制研究很多，但沒有統一的研究結論。有研究發(fā)現Dex 改善LPS 導致的ALI，包括肺的炎癥反應、氧化應激以及凋亡，這些保護作用部分與PI3K/Akt/FoxO1 信號通路相關[19]。也有研究證實Dex 通過調節(jié)HIF-1α/HO-1 信號通路來維持線粒體融合/分裂的動態(tài)平衡，從而改善LPS 誘導的ALI[21]。而另有研究者發(fā)現Dex 通過靶向miR-381 介導的NLRP3 表達減輕小鼠LPS 導致的ALI[22]。Ding等[23]發(fā)現Dex 和3-甲基腺嘌呤可逆轉LPS 導致的ALI，通過減輕炎癥反應及自噬，并且抑制TLR4-NF-κB 信號途徑。本研究發(fā)現，與LPS 組比較，Dex+LPS 組Western blot 法檢測結果顯示肺組織的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下調，自噬減輕；免疫熒光結果顯示LC3B、CD68熒光強度減小，提示Dex 抑制自噬增強及巨噬細胞的增多；Merge 圖中結果顯示，與LPS 組比較，Dex+LPS 組的巨噬細胞自噬減輕。表明Dex 通過抑制炎癥反應及巨噬細胞自噬的過度激活對LPS導致的ALI起保護作用。

Dex 通過調控自噬對臟器的保護作用的研究很多，其中Li 等[24]發(fā)現Dex 可能通過激活PI3K/Akt 通路上調Beclin1 磷酸化水平，進而減少Atg14L-Beclin1-Vps34 復合物的相互作用，從而減輕心肌過度自噬和心肌損傷。另有研究發(fā)現，Dex 預處理可以通過增強自噬抑制炎癥反應，改善大鼠腎臟結構和功能，減輕LPS 誘導的AKI，其機制可能與激活a2-AR/AMPK/mTOR 信號通路抑制NLRP3 炎癥小體的激活相關[12]。Zhang 等[25]報道在大鼠的肺缺血再灌注損傷模型中，Dex 預處理通過上調HIF-1α 及下調BNIP3 和BNIP3L抑制自噬，從而預防肺損傷。這些研究為Dex調控巨噬細胞自噬保護LPS導致的ALI提供了理論基礎。

綜上所述，在小鼠LPS 所致ALI 中，Dex 能有效減輕炎癥反應，減少肺損傷，該作用可能與Dex 抑制肺泡巨噬細胞自噬的過度激活有關，需要進一步研究來尋找Dex 抑制肺泡巨噬細胞自噬過度激活，保護LPS 所致ALI 的分子機制。