李云瑩 梁 棟 張偉華 呂亞楠 王 芳 劉 敬

腦梗死又稱為缺血性腦卒中,可誘導(dǎo)腦細(xì)胞損壞與凋亡[1]。近年來外泌體成為多種疾病治療的新策略[2]。有研究表明,外泌體能穿透血-腦脊液屏障,對治療腦梗死具有重要意義[3]。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多功能干細(xì)胞,間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體已被報(bào)道能治療多種腦部疾病,如人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體分泌miR-146a-5p能降低缺血腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCS)來源的外泌體通過激活SphK1/S1P1信號通路,減少Aβ沉積并改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能恢復(fù)[5]。研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-128-3p水平有助于缺血誘導(dǎo)的腦損傷神經(jīng)元的存活[6]。據(jù)報(bào)道,miR-128-3p在BM-MSCS外泌體中高表達(dá),能促進(jìn)骨愈合[7]。但是BM-MSCS外泌體源性miR-128-3p對于腦梗死是否具有調(diào)控作用仍有待于進(jìn)一步明確。

材料與方法

1.試劑與器材:TTC染色液購自北京索萊寶科技有限公司;杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基購自北京諾博萊德科技有限公司;TRlzol試劑、第1鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Green預(yù)混液、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Thermo Fisher公司;CD9抗體、Flotillin抗體、Calnexin抗體、GSK3B抗體、β-actin抗體、IgG抗體、ELISA試劑盒(TNF-α、IL-6)均購自英國Abcam公司;LC3抗體購自武漢艾美捷科技有限公司;293T細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司;RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;酶標(biāo)儀購自美國REAGEN公司;7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

2.大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)建立:使用5只6～7周齡C57BL/6J雄性大鼠建立MCAO模型,體質(zhì)量為192～213g。將大鼠安置在SPF級環(huán)境中,按照之前描述的線栓法制備模型[8]。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50mg/kg),并固定在手術(shù)臺上,消毒頸部并切開,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈,尼龍線涂上石蠟,從頸外動(dòng)脈緩慢插入右頸內(nèi)動(dòng)脈,閉塞2h。拔出尼龍線,24h后進(jìn)行縫合與消毒。假手術(shù)組(sham組)僅分離頸動(dòng)脈后便縫合傷口,未插入尼龍線。之后40mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后將其以頸椎脫位法處死,取出梗死腦組織,切成2mm的薄片備用。

3.生物信息學(xué)分析:采用GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,選中GSE29287數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析。R語言limma包對GSE29287中差異表達(dá)miRNA進(jìn)行篩選,TargetScanHuman7.1網(wǎng)站用于預(yù)測miRNA的下游靶基因。

4. BM-MSCS和外泌體的分離與鑒定:取2周齡C57BL/6J雄性大鼠提取BM-MSCS,提取方法與鑒定如之前描述[9]。將BM-MSCS在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。采用差速離心法分離外泌體。透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài),Western blot法檢測外泌體中CD9、Flotillin、Calnexin的表達(dá)。

5.動(dòng)物分組與細(xì)胞處理:尾靜脈注射100μg外泌體(3×108顆粒/微升)治療MCAO大鼠作為exo組,尾靜脈注射同劑量的外泌體抑制劑GW4869作為GW4869組。將大鼠分為sham組(假手術(shù)組)、MCAO組、exo組(MCAO大鼠尾靜脈注射BM-MSCS外泌體)、GW4869組(MCAO大鼠尾靜脈注射100μg外泌體抑制劑GW4869)、exo-miR-128mimic組(MCAO大鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染了miR-128mimic的BM-MSCS外泌體)、exo-miR-128 inhibitor組(MCAO大鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染了miR-128 inhibitor的BM-MSCS外泌體)、exo-miR-128 inhibitor+si-GSK3B組(MCAO大鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染了miR-128 inhibitor的BM-MSCS外泌體以及si-GSK3B),以上轉(zhuǎn)染借助Lipofectamine 3000試劑盒完成。

6.RT-qPCR:TRlzol試劑用于提取組織中總RNA,使用第1鏈cDNA合成試劑盒將1μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用引物與SYBR Green預(yù)混液,在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上對miR-128與GSK3B的表達(dá)量進(jìn)行檢測,程序反應(yīng)設(shè)定為:50℃ 2min,95℃ 2min;95℃ 15s、52℃ 15s、72℃ 1min循環(huán)40次。以GAPDH與U6作為內(nèi)部參考,采用2-ΔΔCt公式計(jì)算相對表達(dá)量。miR-128上游引物:5′-GATACGAGCAGCTACAGC-3′,下游引物:5′-AAGCTACGAGCGCGTAAAGCC-3′。GSK3B上游引物:5′-AATCGACGCGCGCGCGAAAGC-3′,下游引物:5′-CCCATCGAGGAAGGGAGATATATAC-3′。GAPDH上游引物:5′-TTAGCGCGAGAGAGTTAGATCG-3′,下游引物:5′-AATGCGCGAAGTCTATGCGGC-3′。U6上游引物:5′-TAATTAGCAGCGAGCAAACCCC-3′,下游引物:5′-CGGCGATCTATCTGCGTTCGGTGC-3′。

7.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):借助StarBase在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-128與GSK3B的靶向結(jié)合位點(diǎn),使用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-128與GSK3B的靶向關(guān)系。擴(kuò)增GSK3B中含有miR-128序列的3′UTR片段,克隆到pmirGLO載體上,命名為GSK3B-WT,對GSK3B中含有miR-128結(jié)合位點(diǎn)的片段進(jìn)行定點(diǎn)突變,擴(kuò)增并克隆到pmirGLO載體上,命名為GSK3B-MUT。使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將GSK3B-WT、GSK3B-MUT分別與miR-128NC、miR-128mimic共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,在培養(yǎng)箱中孵育48h,按照雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒說明書的要求對各組細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

8.Western blot法檢測:使用RIPA裂解液裂解組織中蛋白,BCA法檢測總蛋白的濃度,將提取的蛋白用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉。之后加入一抗CD9(1∶2000)、Flotillin(1∶10000)、Calnexin(1∶20000)、LC3-Ⅰ(1∶2000)、LC3-Ⅱ(1∶2000)、GSK3B(1∶10000)、β-actin(1∶10000),TBST洗膜,使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗IgG(1∶1000)孵育1h。TBST洗膜,使用ECL試劑檢測蛋白信號,借助Image J軟件對蛋白信號進(jìn)行分析。

9.ELISA:將組織剪碎,取2ml放入玻璃勻漿器,加入10ml預(yù)冷的PBS充分研磨,超聲破碎,5000×g離心5min,收集上清液使用ELISA檢測TNF-α、IL-6的表達(dá)。檢測步驟按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀測定450nm的吸光度(A)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算濃度。

結(jié) 果

1.BM-MSCS外泌體鑒定:透射電子顯微鏡觀察外泌體發(fā)現(xiàn)其呈典型杯狀或囊泡狀結(jié)構(gòu)(圖1A),Western blot法實(shí)驗(yàn)顯示外泌體標(biāo)志物CD9、Flotillin均表達(dá)陽性,Calnexin表達(dá)陰性(圖2B)。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)BM-MSCS源性外泌體分離成功。

圖1 BM-MSCS與外泌體鑒定A.透射電子顯微鏡觀察出典型的外泌體形態(tài);B.Western blot法檢測外泌體標(biāo)志物的表達(dá)

2.miR-128在MACO大鼠腦組織中表達(dá)下調(diào):GSE29287數(shù)據(jù)集中顯示miR-128在腦卒中神經(jīng)祖細(xì)胞中表達(dá)降低(圖2A)。由于BM-MSCS一般在疾病中發(fā)揮治療作用,因此本研究關(guān)注在腦卒中中表達(dá)下調(diào)的miRNA,查閱文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)miR-128在腦缺血中發(fā)揮保護(hù)作用因此將其納入研究。與sham組比較,MCAO大鼠腦組織中miR-128表達(dá)下調(diào)(圖2B,P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)說明,異常表達(dá)的miR-128可能在腦梗死發(fā)展中具有重要意義。

3.BM-MSCS外泌體能抑制MCAO大鼠自噬與炎性細(xì)胞因子分泌:與sham組比較,MCAO大鼠組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)以及TNF-α、IL-6濃度增高(P均<0.05)。與MCAO組比較,exo組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)下降,TNF-α、IL-6濃度降低(P均<0.05)。與exo組比較,GW4869組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)以及TNF-α、IL-6濃度升高(P均<0.05, 圖3)。

圖3 BM-MSCS外泌體能抑制MCAO大鼠自噬與炎性細(xì)胞因子分泌A、B.自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá);C.各組TNF-α、IL-6水平。與sham組比較,*P<0.05;與MCAO組比較,#P<0.05;與exo組比較,ΔP<0.05

4.BM-MSCS外泌體通過miR-128發(fā)揮治療作用:與 sham組比較,MCAO組中miR-128表達(dá)下調(diào),與MCAO組比較,exo組中miR-128表達(dá)上調(diào),加入GW4869后miR-128的表達(dá)被抑制(圖4A,P均<0.05)。功能實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示,與MCAO組比較,exo-miR-128mimic組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)下降,而exo-miR-128 inhibitor組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)升高(圖4中B、C,P均<0.05)。與MCAO組比較,exo-miR-128mimic組中TNF-α、IL-6濃度均下調(diào),而exo-miR-128 inhibitor組中TNF-α、IL-6濃度提高(圖4D,P均<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)說明,在外泌體中下調(diào)miR-128能抑制外泌體的治療作用,提示外泌體通過miR-128發(fā)揮作用。

圖4 BM-MSCS外泌體通過miR-128發(fā)揮治療作用A.qRT-PCR檢測miR-128的表達(dá);B、C.自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá);D.各組TNF-α、IL-6水平。與sham組比較,*P<0.05;與MCAO組比較,#P<0.05;與exo組比較,ΔP<0.05

5.miR-128靶向調(diào)控GSK3B:借助Targetscan靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-128和GSK3B存在特異性結(jié)合位點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示較GSK3B-WT+miR-128NC組,GSK3B-WT+miR-128mimic組的熒光素酶活性下降(P<0.05,圖5A)。此外,與sham組比較,MCAO大鼠腦組織中GSK3B的mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P均<0.05,圖5中B、C)。

圖5 miR-128與GSK3B的靶向關(guān)系驗(yàn)證A.GSK3B和miR-128的特異性結(jié)合位點(diǎn)以及靶向關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果;B、C.MCAO大鼠腦組織中GSK3B的表達(dá)檢測結(jié)果

6.敲減GSK3B能部分挽救exo-miR-128 inhibitor發(fā)揮的作用:Western blot法和ELISA結(jié)果顯示(圖6),與MCAO組比較,exo-miR-128 inhibitor組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)升高,TNF-α、IL-6濃度上調(diào),而較exo-miR-128 inhibitor組,exo-miR-128 inhibitor+si-GSK3B組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)下降,TNF-α、IL-6濃度降低(均P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),下調(diào)外泌體中miR-128的表達(dá)能抑制外泌體的治療作用,但轉(zhuǎn)染si-GSK3B后外泌體的治療作用得到部分恢復(fù)。

圖6 敲減GSK3B能部分挽救exo-miR-128 inhibitor發(fā)揮的作用A、B.各組自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表達(dá);C.各組TNF-α、IL-6水平。與sham組比較,*P<0.05;與MCAO組比較,#P<0.05;與exo-miR-128 inhibitor組比較,ΔP<0.05

討 論

近年來BM-MSCS在缺血性腦病治療方面取得良好成效。研究表明BM-MSCS釋放的外泌體能維持缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞存活[10]。此外,間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠分泌miR-542-3p抑制TLR4來抑制炎癥發(fā)生并預(yù)防腦梗死[11]。本研究首先結(jié)合生物信息學(xué)篩選在急性腦梗死中差異表達(dá)的miRNA,由于BM-MSCS一般在疾病中發(fā)揮治療作用,因此本研究選擇在急性腦梗死中低表達(dá)的miRNA進(jìn)行研究。Mao等[6]研究發(fā)現(xiàn),miR-128-3p表達(dá)降低會增加小鼠腦梗死體積而增強(qiáng)miR-128-3p的表達(dá)有利于促進(jìn)缺血性腦損傷中神經(jīng)元的存活。本研究進(jìn)一步對MCAO大鼠模型腦組織中miR-128的表達(dá)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)miR-128在MCAO大鼠腦組織中的表達(dá)被抑制,這與Mao等[6]的研究結(jié)果一致。此外,加入BM-MSCS外泌體后miR-128表達(dá)增強(qiáng),提示BM-MSCS外泌體中miR-128高表達(dá)。

研究顯示,自噬在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用,長期自噬能導(dǎo)致細(xì)胞死亡,也稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[12]。已有研究證實(shí),短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型和缺氧/糖剝奪/再灌注細(xì)胞模型中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表達(dá)升高[13]。此外,腦梗死會誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥也與腦損傷相關(guān),促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1會促進(jìn)炎性發(fā)生[14]。本研究通過功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了將外泌體注射進(jìn)大鼠體內(nèi)能顯著抑制大鼠體內(nèi)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表達(dá)水平以及TNF-α和IL-6的濃度,改善MCAO大鼠的自噬與炎性反應(yīng),但下調(diào)miR-128后外泌體的治療作用被抑制,說明外泌體是通過分泌miR-128對MCAO大鼠發(fā)揮治療作用,因此本研究認(rèn)為BM-MSCS外泌體中高表達(dá)的miR-128可能是腦梗死的潛在治療靶點(diǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)miR-128能調(diào)控 GSK3B發(fā)揮作用。既往研究表明,GSK3B異常激活可觸發(fā)tau蛋白磷酸化,導(dǎo)致阿爾茨海默病的神經(jīng)元損傷和認(rèn)知功能受損[15]。此外也有研究揭示了GSK3B抑制劑YQ138能夠通過激活Nrf2信號通路來預(yù)防谷氨酸和腦缺血引起的神經(jīng)元損傷[16]。本研究證實(shí)了GSK3B和miR-128之間存在靶向關(guān)系且GSK3B在MCAO大鼠腦組織中高表達(dá)。進(jìn)一步設(shè)計(jì)挽救實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GSK3B在腦梗死中的作用發(fā)現(xiàn),當(dāng)在外泌體中敲減miR-128抑制外泌體的治療作用后,下調(diào)GSK3B能部分恢復(fù)外泌體的功能。進(jìn)一步揭示了BM-MSCS源性外泌體通過分泌miR-128調(diào)控GSK3B發(fā)揮細(xì)胞自噬與炎性抑制作用。

本研究仍存在一定不足,如未對大鼠體內(nèi)的自噬進(jìn)行原位檢測,外泌體中發(fā)揮功能的分子除了miRNA,還有其他非編碼RNA如LncRNA或者circRNA,以及編碼RNA等,這都將是以后繼續(xù)研究的方向。

綜上所述,BM-MSCS外泌體源性miR-128可能通過靶向GSK3B抑制腦梗死自噬與炎性反應(yīng)發(fā)生,過表達(dá)miR-128可能是緩解腦梗死缺血性損傷的潛在靶點(diǎn)。