徐 蓮 陸 雪 李 堂 戴潤(rùn)芝 江 洋

喉癌是頭頸部發(fā)生率較高的一種惡性腫瘤,目前主要通過手術(shù)、放化療和生物治療等方式進(jìn)行治療,5年生存率有所提高,但是高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率仍是預(yù)后面臨的一個(gè)重要難題,因此深入研究喉癌發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制具有重要意義[1]。去氫木香內(nèi)酯是木香揮發(fā)油中含量較高的倍半萜內(nèi)酯,也是木香具有藥理學(xué)作用的主要生物活性成分,具有廣泛的抗腫瘤活性。去氫木香內(nèi)酯可抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[2]。此外,去氫木香內(nèi)酯可使細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生活性氧,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性死亡和凋亡[3]。但是,去氫木香內(nèi)酯在喉癌中的作用需要進(jìn)一步研究。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號(hào)通路在喉癌中異常激活,小檗堿通過抑制該信號(hào)通路可抑制喉癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA SSTR5-AS1通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活化抑制喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[5]。但是去氫木香內(nèi)酯是否能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用尚未可知,因此本研究探討去氫木香內(nèi)酯對(duì)喉癌惡性生物學(xué)行為的影響及其具體機(jī)制,為降低喉癌發(fā)生率和提高喉癌患者生存率提供新的研究思路和靶點(diǎn)。

材料與方法

1.細(xì)胞系:人喉癌Hep-2細(xì)胞購自美國(guó)ATCC公司。

2.試劑和儀器:去氫木香內(nèi)酯(純度≥98%,批號(hào):A0302,成都曼思特生物科技有限公司);MTT試劑盒(批號(hào):C0009,上海碧云天生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào):G003-1-2,南京建成生物工程研究所);DMEM培養(yǎng)基以及胰蛋白酶(批號(hào):C11995500BT,25200-056,美國(guó)Gibco公司);p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog抗體(批號(hào):ab278545、ab302958、ab38449、ab8805、ab92494、ab243894、ab109250,英國(guó)Abcam公司);CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫爾特公司);Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);DYCZ-24F雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠)。

3.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:將Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2以及飽和濕度的培養(yǎng)箱中,每天更換1次培養(yǎng)基,每2天進(jìn)行消化傳代,取傳至第4代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

4.MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率:第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化,離心后,調(diào)整為5×103個(gè)/毫升的細(xì)胞密度,將100μl細(xì)胞懸液加入96孔板,重新置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,將細(xì)胞分為0、10、20和30μmol/L組,各孔分別加入含對(duì)應(yīng)濃度的去氫木香內(nèi)酯的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),分別在去氫木香內(nèi)酯處理24、48和72h后,每孔加入MTT溶液10μl,重新培養(yǎng)4h,置于酶標(biāo)儀下測(cè)量450nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值,細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照孔A值-藥物孔A值)/對(duì)照孔A值×100%。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)整為5×103個(gè)/毫升的細(xì)胞密度,將100μl細(xì)胞懸液加入96孔板,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,將細(xì)胞分為0、10、20和30μmol/L組,各孔分別加入含對(duì)應(yīng)濃度的去氫木香內(nèi)酯的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),24h后,胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,加入磷酸鹽緩沖液400μl,輕輕吹打,將細(xì)胞制成懸液,在向細(xì)胞懸液中加入Annexin-V 5μl,充分混勻,4℃避光孵育15min,再加入碘化丙啶 10μl,充分混勻,避光孵育5min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

6.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力:細(xì)胞侵襲能力檢測(cè):無血清培養(yǎng)基將基質(zhì)膠稀釋,并平鋪于上室,將經(jīng)不同濃度去氫木香內(nèi)酯培養(yǎng)24h的細(xì)胞制成1×106個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液,取200μl置于Transwell小室上室,在下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,之后將小室放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,濕棉簽輕輕擦去未穿膜細(xì)胞,甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)并拍照。細(xì)胞遷移能力檢測(cè):除Transwell小室上室不鋪基質(zhì)膠外,其余操作同細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)。

7.蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量:收集經(jīng)不同濃度去氫木香內(nèi)酯處理后的Hep-2細(xì)胞,預(yù)冷PBS清洗2次,裂解液冰上裂解30min,4℃ 12000r/min(離心半徑8cm)離心10min,收集上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度,100℃煮沸。每孔上樣20μl,設(shè)置電泳儀參數(shù)為120V 2h,蛋白分離后,將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h,將PVDF膜裁開進(jìn)行抗體孵育(4℃孵育過夜),二抗室溫孵育,TBST洗膜,ECL顯影液在成像系統(tǒng)中曝光,Image J分析條帶灰度值,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值。

結(jié) 果

1.MTT法檢測(cè):與0μmol/L組比較,10、20和30μmol/L去氫木香內(nèi)酯分別作用24、48和72h后,細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高,且具有濃度和時(shí)間依賴性(P<0.05,表1)。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)侵襲能力:與0μmol/L組(2.97%±0.85%)比較,10、20和30μmol/L去氫木香內(nèi)酯組(9.01%±0.62%、16.79%±1.35%、28.65%±1.31%)細(xì)胞凋亡率均顯著升高,且有濃度依賴性(P<0.05,圖1)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況A.0μmol/L組;B.10μmol/L組; C.20μmol/L組; D.30μmol/L組

3.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲能力:與0μmol/L組(446.89±30.20個(gè))比較,10、20和30μmol/L去氫木香內(nèi)酯組(364.82±33.12、259.51±33.06、161.56±29.25個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)減少,且具有濃度依賴性(P<0.05,圖2)。

4.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力:與0μmol/L組(491.31±41.89個(gè))比較,10、20和30μmol/L去氫木香內(nèi)酯組(432.66±45.36、358.02±35.92、158.05±24.23個(gè))遷移細(xì)胞數(shù)減少,且有濃度依賴性(P<0.05,圖3)。

5.蛋白印跡法檢測(cè):與0μmol/L組比較,10、20和30μmol/L去氫木香內(nèi)酯組p-PI3K、p-Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05),且有濃度依賴性。各組間PI3K和Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2,圖4)。

圖4 不同濃度去氫木香內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響A.0μmol/L組;B.10μmol/L組;C.20μmol/L組;D.30μmol/L組

表2 各組細(xì)胞中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

討 論

近年來,喉癌的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì),但是,對(duì)于喉癌發(fā)生的具體機(jī)制尚不明確,普遍認(rèn)為其與吸煙、飲酒、接觸有害粉塵以及乳頭狀瘤病毒感染等多種因素有關(guān),其發(fā)生和惡化進(jìn)程是個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過程,涉及多條信號(hào)通路的調(diào)控作用[6]。去氫木香內(nèi)酯是從云木香的干燥根莖中提取的一種含有α-亞甲基-γ-內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的倍半萜類化合物,該結(jié)構(gòu)能與含有巰基的酶及其功能性蛋白酶發(fā)生反應(yīng),進(jìn)而干擾細(xì)胞的代謝過程,是具有多種藥理學(xué)活性的化合物[7]。研究發(fā)現(xiàn),去氫木香內(nèi)酯通過抑制胃泌素瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期以及造成DNA損傷和線粒體膜電位降低,從而發(fā)揮抗胃泌素瘤作用[8]。去氫木香內(nèi)酯通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗乳頭瘤作用[9]。馬強(qiáng)等[10]研究發(fā)現(xiàn),去氫木香內(nèi)酯可抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。由此可見去氫木香內(nèi)酯具有廣泛的抗腫瘤活性,因此,本研究旨在探討去氫木香內(nèi)酯是否具有抗喉癌作用及其具體機(jī)制。

腫瘤形成是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過程,其生長(zhǎng)取決于細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡,抗腫瘤藥物主要通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度去氫木香內(nèi)酯均可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,且具有濃度依賴性。此結(jié)果說明,去氫木香內(nèi)酯具有抗喉癌作用。癌細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲是腫瘤患者預(yù)后不良的重要原因,也是導(dǎo)致患者5年生存率降低的主要因素,因此阻斷細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲對(duì)提高患者5年生存率至關(guān)重要。癌細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程,研究發(fā)現(xiàn),喉癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度去氫木香內(nèi)酯可降低Hep-2細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量,說明去氫木香內(nèi)酯具有抑制喉癌遷移和侵襲的作用。

研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號(hào)通路活化在喉癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用,miR-509-3p過表達(dá)通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可抑制喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[12]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA SSTR5-AS1通過降低p-PI3K和p-Akt表達(dá)抑制喉癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[13]。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)去氫木香內(nèi)酯通過抑制PI3K和Akt活化從而抑制重組HPV-18 HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,可能是一種新的治療尖銳濕疣的潛在藥物。

本研究中蛋白印跡法結(jié)果顯示,不同濃度去氫木香內(nèi)酯均可降低p-PI3K和p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量,說明去氫木香內(nèi)酯可抑制喉癌細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路活化。癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)能夠?qū)崿F(xiàn)自我更新,而且產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤,CSCs具有無限增殖能力,可以維持腫瘤細(xì)胞群的活力[13]。研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA PINT通過調(diào)控miR-425-5p/PTCH1軸抑制喉癌細(xì)胞干細(xì)胞特性從而抑制喉癌發(fā)生[14]。Sox-2、CD44、CD133和Nanog是干細(xì)胞特異性標(biāo)志物[15]。因此本研究通過蛋白印跡法檢測(cè)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示,不同濃度去氫木香內(nèi)酯可降低Sox-2、CD44、CD133和Nanog蛋白相對(duì)表達(dá)量,且具有濃度依賴性,說明去氫木香內(nèi)酯可抑制喉癌干細(xì)胞特性,抑制癌細(xì)胞增殖。

綜上所述,去氫木香內(nèi)酯可抑制喉癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,同時(shí)可抑制喉癌干細(xì)胞特性,其可能是通過阻礙PI3K/Akt信號(hào)通路活化發(fā)揮作用,為臨床治療喉癌提供理論依據(jù)。