張杭穎,洪玉瑩,楊 琳,黃勃誠,陳 月,張君誠

(1.三明學(xué)院 資源化工學(xué)院,福建 三明 365004;2.三明學(xué)院 海峽理工學(xué)院,福建 三明 365004;3.藥用植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心,福建 三明 365004)

免洗洗手液兼具抑菌和護(hù)膚的功能,與傳統(tǒng)清潔產(chǎn)品相比,具有避免交叉感染和實用性較強(qiáng)的優(yōu)點[1-2]。免洗洗手液主要成分為乙醇和丙三醇,它是通過提高乙醇含量或添加鄰苯基苯酚(OPP)、三氯羥基二苯醚(DP300)等化學(xué)殺菌劑達(dá)到抑菌功能[3-4],但長期使用高濃度酒精及OPP、DP300等添加劑會造成手部皮膚干燥、粗糙等現(xiàn)象[5]。因此,利用天然產(chǎn)物作為免洗洗手液的抑菌添加劑備受關(guān)注。

五指毛桃,?？崎艑?MoraceaeFicus),源植物為粗葉榕(FicushirtaVahl),主要分布于福建、廣東、廣西等地,以根入藥,具有天然的椰子香味[6-7],主要活性成分包括補(bǔ)骨脂素、多糖、黃酮等[8-10]。有研究表明,其提取液具有抗炎、抗氧化、體外抑菌作用,是理想的洗手液天然添加劑[11-14]。

因此,本實驗選擇采用80%的乙醇-超聲波法提取五指毛桃根部的活性成分,通過非靶向測序和高效液相色譜法,檢測提取物的種類和活性成分含量,并研發(fā)制備五指毛桃免洗洗手液,以期為五指毛桃免洗洗手液的生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 醇提液制備

五指毛桃,種植于福建省三明市三元區(qū)莘口鎮(zhèn)高山村(東經(jīng)117°14′54″,北緯26°10′36″),其高約90 cm,全緣葉與缺刻葉共存,果實為青灰色,小且圓,根淺黃色,皮柔韌,有香氣。經(jīng)三明學(xué)院張君誠教授鑒定為粗葉榕。實驗中選取五指毛桃的根作為實驗材料。

將五指毛桃的根洗凈,烘干至恒重,將其碾磨成粉,過60目篩備用。參考超聲輔助乙醇提取法[15],取上述五指毛桃粉末5 g,溶于100 ml 80%乙醇,在37 ℃下,超聲提取60 min,放進(jìn)冷凍高速離心機(jī)中4 ℃,8 000 r/min離心15 min,棄沉淀,獲得五指毛桃醇提液。

1.2 醇提液非靶向檢測

使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1000D-W垂直型,日本EYELY)干燥五指毛桃醇提液,獲得五指毛桃醇提液干粉,稱取適量五指毛桃干粉。加入含2-氯-L-苯丙氨酸(4 mg/L)的甲醇600 μL,渦旋振蕩30 s,室溫超聲15 min后離心10 min。取上清液濾膜過濾后放入檢測瓶中,參照李嬌珍等色譜和質(zhì)譜條件,用于LC-MS檢測[16]。

1.3 醇提液活性成分檢測

采用高效液相色譜法測定五指毛桃醇提液補(bǔ)骨脂素含量[17]。高效液相色譜條件:Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相-乙腈-水(35∶65),流速1.0 mL/min,柱溫35 ℃;進(jìn)樣量20 μL,檢測波長245 nm。經(jīng)精密度、穩(wěn)定性和加樣回收試驗檢測均符合要求后,以補(bǔ)骨脂素為標(biāo)準(zhǔn)品,用水和乙醇分別配制成0.54 mg/mL的補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mL補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)溶液,加水或50%乙醇溶液補(bǔ)至10 mL。再使用0.45 μm針孔濾膜過濾,上樣測定,并通過線性回歸分析進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

分別以蘆丁、沒食子酸、葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用硝酸鋁法[18]、Folin-ciocalteu法[19]和硫酸-苯酚法[20]制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定總黃酮、多酚和多糖含量,并計算五指毛桃醇提液中各種活性成分含量。計算公式為

(1)

式(1)中,A為活性成分含量(%),c為測得吸光值或峰面積對應(yīng)的活性成分濃度(mg/mL),V為溶液體積(mL),n為稀釋倍數(shù),m為稱取的五指毛桃質(zhì)量(mg)。

1.4 免洗洗手液制備

選擇配方為五指毛桃醇提液與丙三醇的比值為3∶1(乙醇含量60%),5∶1(乙醇含量66%)和7∶1(乙醇含量70%)制備免洗洗手液,與乙醇含量70%的酒精洗手液對比(市場中免洗洗手液的乙醇含量濃度均高于70%,故本實驗直接選取70%濃度的酒精作為對照組),觀察并分析其pH變化、分層情況、氣味、使用感等指標(biāo)參數(shù),綜合評價五指毛桃免洗洗手液(表1)。

表1 免洗洗手液成分四種組合 單位:mL

1.5 抑菌作用檢測

將直徑為6 mm的無菌小圓濾紙片,分別浸泡于最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同濃度的酒精洗手液、五指毛桃提取液及甘油中。挑取大腸桿菌單克隆,在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)40 min后,涂布于固體培養(yǎng)基平板上。再將固體培養(yǎng)基平板劃分4塊區(qū)域,將浸泡4種免洗洗手液的小圓濾紙片依次貼在平板的4個區(qū)域,37 ℃培養(yǎng)8 h后觀察并測量每一個平板上小圓片的抑菌圈大小。

在LB培養(yǎng)基中分別添加15%的五指毛桃免洗洗手液(五指毛桃醇提液與甘油的比例為3∶1)、酒精免洗洗手液(酒精與甘油的比例為3∶1)、五指毛桃醇取液和甘油,以LB培養(yǎng)基為空白對照,測定在接種大腸桿菌0、100、140、160、180、200、220 min條件下OD 600值的變化。

在LB培養(yǎng)基中分別添加2.5%的五指毛桃免洗洗手液(五指毛桃醇提液與甘油的比例為3∶1)、酒精免洗洗手液(酒精與甘油的比例為3∶1)、五指毛桃醇取液和甘油,以LB培養(yǎng)基為空白對照,測定在接種大腸桿菌0、60、100、120、140、150、160 min時OD 600的變化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 五指毛桃醇提液成分檢測

五指毛桃醇提液中共檢測到864種物質(zhì),主要含有黃酮類化合物(38種)、酚類化合物(35種)、糖類化合物 (76種)、香豆素類 (12種)、脂肪酰 (109種)、類固醇和類固醇衍生物 (51種)、苯和苯的衍生物 (138種)和羧酸及其衍生物 (123種)等成分,其比例分別為4.40%、4.05%、8.80%、1.39%、12.62%、15.97%和14.24% (圖1)。其中,黃酮類化合物中,檢測到表兒茶素 (EC)、木犀草素、黃芩苷等30種黃酮類組分和金雀異黃酮、2′,5,7-三羥(基)-4′-甲氧異黃酮等8種異黃酮組分。香豆素類化合物中包含五指毛桃質(zhì)量評價指標(biāo)補(bǔ)骨脂素。

圖1 五指毛桃醇提液中檢出的物質(zhì)種類

2.2 五指毛桃醇提液活性成分含量

以補(bǔ)骨脂素為標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,上海阿拉丁生化科技有限公司),測得在6～7 min之間,回歸曲線方程為Y=78.571x-35.289 (R2=0.996 0)。五指毛桃醇提液在6～7 min也出現(xiàn)峰值,確定該峰物質(zhì)為補(bǔ)骨脂素(圖1)。通過峰面積計算五指毛桃醇提液補(bǔ)骨脂素含量為0.046% (圖2)。

圖2 補(bǔ)骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品和五指毛桃樣品的色譜圖

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y=11.995x-0.012 (R2=0.999 5),計算五指毛桃醇提液總黃酮含量為0.690%。以沒食酸為標(biāo)準(zhǔn)品,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=10.951x+0.032,總酚含量為1.120%。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=49.138x+0.074 (R2=0.996 0),測得多糖含量為16.968%(圖3)。

2.3 不同配方免洗洗手液的理化性質(zhì)及感官評價

2.3.1 不同配方免洗洗手液pH變化

測定四種配方免洗洗手液在0、1、3、6、12、24、48、96、144 h時pH值的變化,發(fā)現(xiàn)含五指毛桃醇提液的免洗洗手液均呈酸性,而酒精和甘油配比的免洗洗手液呈堿性(圖3)。4種配方洗手液pH均呈下降趨勢,144 h后4種免洗洗手液的pH均呈酸性。其中酒精免洗洗手液pH下降最多,達(dá)13.85%,五指毛桃醇提液與甘油比例為3∶1,5∶1和7∶1的免洗洗手液分別下降了12.44 %,9.98%和8.60%(圖3)。由此可知,含五指毛桃醇提液的免洗洗手液比酒精免洗洗手液pH穩(wěn)定,且五指毛桃醇提液含量越高,pH越穩(wěn)定。

2.3.2 不同配方免洗洗手液外觀評價

觀察4種免洗洗手液144 h后外觀變化,其中酒精免洗洗手液澄清透亮、不分成,且無沉淀物。4種免洗洗手液在144 h后均不分層。但隨五指毛桃醇提液的升高,呈現(xiàn)渾濁,且有沉淀物或油脂(表2)。

2.3.3 不同配方免洗洗手液感官評價

在免洗洗手液感官評價中,4種不同配方免洗洗手液的細(xì)膩度和延展度均較好。其中含五指毛桃醇提液的免洗洗手液伴有植物香氣且保濕度好。五指毛桃醇提液與甘油比為3∶1的免洗洗手液清爽且黏稠度低,其他免洗洗手液表現(xiàn)為油膩且黏稠。綜合各感官指標(biāo)可知,五指毛桃醇提液與甘油比為3∶1的免洗洗手液的感官評價優(yōu)于其他配方的免洗洗手液(表3)。

表3 4種配方免洗洗手液感官評價表

綜上,五指毛桃醇提液與甘油比例為3∶1配比的免洗洗手液其呈酸性,較穩(wěn)定,且長時間放置澄清透亮、不分層,且無沉淀。感官評價中清爽度、黏度、細(xì)膩度、延展度和保濕度都表現(xiàn)良好,且?guī)в兄参锵銡?是五指毛桃免洗洗手液的最佳配方。

2.4 五指毛桃免洗洗手液抑菌作用評價

2.4.1 抑菌圈檢測結(jié)果

放置浸泡最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同濃度的酒精免洗洗手液、五指毛桃提取液和甘油的小圓紙片于大腸桿菌培養(yǎng)基中,測量并統(tǒng)計平板上的抑菌圈的大小。結(jié)果顯示,浸泡五指毛桃醇提液和五指毛桃免洗洗手液的圓濾紙片抑菌圈大小分別為2.13、2.33 mm,抑菌效果較好(表4)。浸泡相同濃度的乙醇免洗洗手液抑菌圈大小為1.20 mm,低于五指毛桃免洗洗手液和五指毛桃醇提液,且差異顯著(P<0.01)。浸泡甘油的圓濾紙片未出現(xiàn)抑菌圈,表明甘油無抑菌作用(表4)。

表4 4種配方免洗洗手液抑菌特征

2.4.2 細(xì)菌生長曲線測定結(jié)果

測得添加15%最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同濃度的酒精免洗洗手液、五指毛桃提取液和甘油的LB培養(yǎng)基中大腸桿菌0、100、140、160、180、200、220 min的OD600值結(jié)果顯示,空白對照組(僅LB培養(yǎng)基)大腸桿菌生長經(jīng)歷遲緩期和對數(shù)增長期,穩(wěn)定生長,符合細(xì)菌生長特點。添加甘油的培養(yǎng)基中,大腸桿菌遲緩期時間增長,且相同時間內(nèi)大腸桿菌增值數(shù)量較空白對照組減少(圖4)。添加最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同濃度的酒精免洗洗手液和五指毛桃提取液的培養(yǎng)基,大腸桿菌培養(yǎng)液OD600值在220 min內(nèi)幾乎無變化。

圖4 添加物濃度為15%時5種培養(yǎng)基中大腸桿菌的OD600值變化

為進(jìn)一步分析相同酒精濃度下五指毛桃免洗洗手液中醇提液的抑菌效果,降低添加物濃度至2.5%,檢測0、60、100、120、140、150、160 min的大腸桿菌OD 600值,圖5顯示:最佳配方的五指毛桃免洗洗手液、相同濃度酒精免洗洗手液和五指毛桃醇提液的培養(yǎng)基均能有效延長遲緩期,其中添加五指毛桃免洗洗手液和五指毛桃醇提液的培養(yǎng)基的抑菌效果高于添加酒精免洗洗手液的培養(yǎng)基。由此可知,五指毛桃醇提液比相同濃度的酒精具有更強(qiáng)的抑菌作用。

圖5 添加物為2.5% 時三種培養(yǎng)基中大腸桿菌的OD600值變化

3 分析與討論

五指毛桃醇提液中共檢測到864種物質(zhì),主要含有38種黃酮類化合物、35種酚類化合物、76種糖類化合物、12種香豆素類、109種脂肪酰、138種苯和苯的衍生物和123種羧酸及其衍生物等成分。醇提液中總黃酮、多酚、多糖和補(bǔ)骨脂素的含量分別為0.690%、1.120%、16.968%和0.046%。五指毛桃醇提液中的補(bǔ)骨脂素、黃酮、多酚等物質(zhì)均具有明顯的抑菌及抗氧化作用[6,13],是免洗洗手液優(yōu)良的添加劑。

五指毛桃醇提液制備的免洗洗手液呈酸性,而酒精洗手液則呈堿性。有研究表明,黃酮、非揮發(fā)性有機(jī)酸、高級脂肪酸、生物堿等成分含量越高的提取物,pH越小[21]。成年人與少年人手部皮膚的pH都小于5,這是皮膚抵御微生物侵入的重要方式[22]。免洗洗手液呈堿性或中性時,會破壞皮膚的酸性環(huán)境,使肌膚感覺緊繃、干燥;皮膚表面pH值若長期處于中性或者堿性,將直接或間接影響角質(zhì)形成細(xì)胞的代謝,引發(fā)角質(zhì)細(xì)胞增生、分化的異常,導(dǎo)致皮膚屏障功能改變,角質(zhì)層致密性降低等病癥[2]。因此,含五指毛桃提取液的免洗洗手液可將表皮皮膚pH值維持在弱酸性,達(dá)到護(hù)膚的功效。

五指毛桃醇提液制備的免洗洗手液的抑菌效果優(yōu)于乙醇免洗洗手液(表4、圖5～6)。研究表明,五指毛桃提取液可通過干擾細(xì)胞壁合成,損傷胞漿膜,影響細(xì)胞蛋白合成,影響核酸合成,干擾遺傳密碼復(fù)制,對大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌均具有抑制作用[13,23]。同時,感官評價也證實五指毛桃醇提液制備的免洗洗手液優(yōu)于乙醇免洗洗手液,為研發(fā)天然提取物添加型免洗洗手液提供新的思路及方向。