黃冠又,劉家駿,杜永貴,蘇 恒,葛學(xué)成,張 欣,甘鴻川

(貴陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科,貴陽 550081)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)起源于神經(jīng)上皮組織,是一種位于成人原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的惡性腫瘤,具有發(fā)病率高、惡性程度高、致殘致死率和復(fù)發(fā)率高等特點,嚴重威脅患者的生命健康[1-2]。目前膠質(zhì)瘤的治療方案是在手術(shù)切除腫瘤的基礎(chǔ)上,結(jié)合病理和分子病理結(jié)果,輔助放療和(或)化療。但由于腫瘤異質(zhì)性、耐藥性及血腦屏障等因素,導(dǎo)致患者對各種治療的敏感性差異較大。據(jù)報道,低級別膠質(zhì)瘤患者5年生存率為60%～74%[3],而高級別的膠質(zhì)瘤患者的中位生存時間僅為15個月左右,5年生存率低于6%[4]。因此,深入了解膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的特點和分子機制,發(fā)現(xiàn)新的分子標記物,對于開發(fā)更好的膠質(zhì)瘤治療方法至關(guān)重要。

甲基化CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)是甲基化結(jié)合蛋白家族中的主要成員,是維系大腦功能所必需的,并參與神經(jīng)元的成熟和突觸發(fā)生,在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[5]。當MeCP2基因功能異常時,不能對相應(yīng)的下游靶基因產(chǎn)生抑制作用,會造成DNA甲基化改變,進而影響DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而使基因的表達異常,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),并促進腫瘤細胞的增殖和遷移,如肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等[6-7]。目前關(guān)于MeCP2與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究較少,其在膠質(zhì)瘤中的具體作用和機制仍不明確。

本研究基于對癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫進行挖掘分析,同時結(jié)合GTEx數(shù)據(jù)集,分析mRNA在膠質(zhì)瘤(低級別膠質(zhì)瘤LGG和高級別膠質(zhì)瘤GBM)和正常腦組織的表達差異,目的在于分析MeCP2在膠質(zhì)瘤患者中的表達與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系,通過對樣本數(shù)據(jù)的挖掘,探討MeCP2在膠質(zhì)瘤中的潛在作用,為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及臨床資料

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)中下載神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者基因表達譜數(shù)據(jù)(TCGA-GBMLGG、level3、RNA-seq)及臨床和生存信息,共獲得696例膠質(zhì)瘤患者組織和5例癌旁組織mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。納入標準:(1)有完整的患者臨床和基因表達數(shù)據(jù);(2)病理結(jié)果為LGG或GBM。對TCGA數(shù)據(jù)庫中基因表達水平的標準化是通過對FPKM值以2為底(log2)取對數(shù)實現(xiàn)的。本研究獲貴陽市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(審批號:202153)。

1.2 MeCP2的表達情況與膠質(zhì)瘤臨床病理和預(yù)后關(guān)系

從UCSC XENA數(shù)據(jù)庫(https://xenabrowser.net/datapages/s)經(jīng)Toil流程[8]統(tǒng)一處理的TCGA和GTEx的TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù),提取TCGA中GBM、LGG(696例)和GTEx中對應(yīng)的正常組織(1 157例)數(shù)據(jù)。對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后進行膠質(zhì)瘤和正常腦組織樣本間的表達比較。

696例膠質(zhì)瘤臨床數(shù)據(jù)中,男398例,女498例;≤60歲553例,>60歲143例;WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)分類中,WHO Ⅱ級224例,WHO Ⅲ級243例,WHO Ⅳ級168例;IDH突變者440例,野生型246例;1p/19q聯(lián)合缺失171例,非聯(lián)合缺失518例。經(jīng)合并后分析GBM和LGG兩組數(shù)據(jù)中MeCP2表達量的中位值為4.114,將>4.114設(shè)置為高表達組,≤4.114為低表達組,繪制Kaplan-Meier生存曲線,對MeCP2不同表達組進行總生存期(overall survival,OS)和疾病特異生存期(disease specific survival,DSS)分析。

1.3 差異表達基因的篩選和富集分析

應(yīng)用R軟件(4.1.3)limma包進行數(shù)據(jù)歸一化和標準化進行差異表達基因篩選,按基因表達差異倍數(shù)的絕對值(logFC>2,P<0.05)的標準,得到有統(tǒng)計學(xué)意義的差異基因。基于R軟件使用ggplot2包對于差異基因進行GO功能富集和KEGG信號通路富集分析。

1.4 MeCP2表達與免疫浸潤和腫瘤微環(huán)境的相關(guān)性

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)瘤的免疫浸潤情況進行評估,通過CIBERSORT工具分析免疫浸潤狀況。通過Wilcoxon秩和檢驗比較和分析MeCP2低表達組和高表達組之間免疫細胞浸潤差異。每個樣本的腫瘤免疫微環(huán)境(TME)評分,包括基質(zhì)評分、免疫評分和ESTIMATE評分,通過Restimate包來確定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

使用R軟件(版本4.1.2)進行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗,多組見比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗;log-rank檢驗MeCP2與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系,并繪制Kaplan-Meier生存曲線;采用單因素和多因素Cox回歸模型分析相關(guān)臨床病理因素和MeCP2表達與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系;相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MeCP2在膠質(zhì)瘤組織中表達情況

TCGA數(shù)據(jù)庫及GTEx數(shù)據(jù)集聯(lián)合分析結(jié)果表明,與正常腦組織相比,MeCP2基因在膠質(zhì)瘤組織中明顯上調(diào),兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖1。

***:P<0.001。圖1 MeCP2在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達

2.2 MeCP2的表達情況與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

對TCGA數(shù)據(jù)庫中與膠質(zhì)瘤患者相關(guān)的臨床病理特征數(shù)據(jù)進行分析,結(jié)果表明MeCP2表達與性別無關(guān),但與年齡、病理分級和分子分型相關(guān)。MeCP2高表達與低齡(≤60歲)、低級別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅱ、Ⅲ級)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)突變型和1p/19q共缺失相關(guān)(P<0.01或P<0.001),見圖2。

ns:差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中MeCP2基因表達與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征關(guān)系

2.3 MeCp2表達水平對膠質(zhì)瘤患者生存期的影響

對696例膠質(zhì)瘤患者進行Kaplan-Meier生存分析顯示,MeCP2高表達組(紅線)患者的生存曲線在低表達組(藍線)之上,即MeCP2低表達組OS較MeCP2高表達組明顯縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖3。

圖3 MeCP2在TCGA數(shù)據(jù)庫中的生存分析

2.4 MeCP2表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系

將患者的MeCP2表達水平及相關(guān)臨床病理因素納入Cox單因素、多因素風(fēng)險比例回歸模型分析,結(jié)果顯示高齡(>60歲)、WHO分級(Ⅲ、Ⅳ級)和IDH突變型是膠質(zhì)瘤患者生存的獨立影響因素。單因素分析顯示MeCP2的危險度(HR)=0.412(95%CI:0.319～0.533),見表1。

表1 MeCP2表達水平與患者預(yù)后的單因素和多因素分析

2.5 MeCP2的差異表達基因和富集分析

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中696個膠質(zhì)瘤樣本,比較樣本中MeCP2高表達和低表達組中基因轉(zhuǎn)錄水平差異,進行差異分析,篩選條件為基因差異倍數(shù)的絕對值(logFC>1,P<0.05),共篩選到1 025個差異表達基因,表達水平升高的有266個,表達水平降低的有759個。GO分析顯示,這些差異表達基因參與生物學(xué)過程包含白細胞遷移、細胞外結(jié)構(gòu)/基質(zhì)組織、細胞趨化等。KEGG信號通路分析顯示,差異表達基因參與的分子信號通路包括細胞因子受體相互作用、神經(jīng)活性配體受體相互作用、趨化因子信號通路等。

2.6 MeCP2表達與膠質(zhì)瘤中免疫細胞浸潤和腫瘤微環(huán)境相關(guān)性

CIBERSORT分析結(jié)果表明,MeCP2基因高表達組中靜止樹突狀細胞、中性粒細胞和M2巨噬細胞較多(P<0.05或P<0.001),而低表達組中記憶B細胞、初始B細胞和漿細胞較多(P<0.01)。與MeCP2高表達組相比,低表達組的免疫評分、基質(zhì)評分和ESTIMATE評分都較高(P<0.001),見圖4。

圖4 膠質(zhì)瘤中MeCP2高表達和低表達組中免疫相關(guān)評分

3 討 論

膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與的異常復(fù)雜過程,一些重要基因的缺失或改變能導(dǎo)致細胞異常增殖,該過程可能涉及癌基因EGFR激活和抑癌基因如p53、p16等失活改變或異常表達。此外,與膠質(zhì)瘤風(fēng)險增加相關(guān)的基因,如表皮生長因子受體EGFR基因擴增/突變、1p/19q缺失、IDH突變、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)啟動子突變等,這些基因突變也是膠質(zhì)瘤發(fā)病機制的重要因素和判斷預(yù)后的重要標志物[9-10]。由于膠質(zhì)瘤高度異質(zhì)性,其致病基因突變復(fù)雜,針對膠質(zhì)瘤的特異性靶點仍需更多研究,為其個性化治療提供依據(jù)。

MeCP2基因是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,能夠調(diào)控基因表達,具有轉(zhuǎn)錄激活或抑制雙重作用。神經(jīng)元中MeCP2缺失會導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙、Rett綜合征及主要的神經(jīng)精神疾病(例如自閉癥和精神分裂癥)[11]。MeCP2可以在DNA中結(jié)合甲基化的CpG二核苷酸,有研究認為MeCP2通過招募轉(zhuǎn)錄抑制因子Sin3A和組蛋白脫乙?；?HDAC)作為轉(zhuǎn)錄抑制啟動子[12]。除了在神經(jīng)元中的作用外,MeCP2還在膠質(zhì)細胞(星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和微膠質(zhì)細胞)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,MeCP2基因調(diào)節(jié)失調(diào)會損害膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元功能[13]。KIM等[14]研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸可以使C6膠質(zhì)瘤細胞中褪黑激素MT1受體、HDAC 1、HDAC 2、HDAC 3和MeCP2的mRNA表達出現(xiàn)明顯的時間依賴性變化。BIAN等[15]研究揭示MeCP2是腦膠質(zhì)瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的1個新的調(diào)節(jié)因子,提示抑制MeCP2可能是抑制腦膠質(zhì)瘤EMT的治療選擇。從以上研究報道可知,MeCP2可能是膠質(zhì)瘤中治療的一個新的靶點,但其在膠質(zhì)瘤中的作用目前鮮有相關(guān)研究。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)集分析MeCP2在膠質(zhì)瘤和正常腦組織間表達的差異性,結(jié)果顯示MeCP2在膠質(zhì)瘤中表達水平高于正常腦組織,且表達水平與患者年齡、病理分級和分型相關(guān),在低齡(<60歲)、低級別膠質(zhì)瘤、IDH突變型和1p/19q共缺失中表達水平明顯增高。通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn),MeCP2的表達水平可以反映預(yù)后,表現(xiàn)為MeCP2高表達水平的患者預(yù)后總生存時間明顯高于MeCP2低水平患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]在上述因素中膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較好,該結(jié)果同MeCP2表達上調(diào)預(yù)示患者預(yù)后較好相吻合。研究表明表達抑制或缺失是MeCP2在惡性腫瘤中的主要表達失調(diào)形式[16],本研究中,MeCP2在GBM患者中表達水平低于LGG,表明其表達水平隨著膠質(zhì)瘤的發(fā)展有逐步下降趨勢,提示MeCP2的表達抑制可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。但通過Cox風(fēng)險比例回歸模型分析,并未證實MeCP2是影響膠質(zhì)瘤患者生存的獨立影響因子,提示MeCP2并不能簡單地歸結(jié)為腫瘤抑制因子,MeCP2高表達改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的機制尚需進一步研究證實。

對MeCP2高表達和低表達組篩選出的差異表達基因進行GO和KEGG富集分析,結(jié)果顯示,差異表達基因明顯富集在白細胞遷移和趨化的生物學(xué)過程及相關(guān)分子信號通路,如細胞因子和趨化因子信號通路等。研究證實多種趨化因子及受體與膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān),并在膠質(zhì)瘤中表達升高,抑制趨化因子及受體的表達有助于膠質(zhì)瘤的抗血管生成治療[17-18]。并且一些細胞因子和趨化因子具有免疫調(diào)節(jié)作用,能影響GBM的腫瘤微環(huán)境,有望成為GBM免疫治療靶向的候選分子[19]。因此,MeCP2可能參與調(diào)控細胞因子或趨化因子信號通路并在膠質(zhì)瘤中起作用,為今后膠質(zhì)瘤的免疫靶向治療提供新的靶點。

目前已知,腫瘤微環(huán)境對免疫治療有重要影響,因此,本研究最后還分析了MeCP2表達與膠質(zhì)瘤免疫浸潤和腫瘤微環(huán)境的關(guān)系。結(jié)果表明,低表達組有更多的免疫細胞浸潤和更高的免疫評分,表明低表達組患者可能對免疫療法有更好的治療反應(yīng),提示MeCP2可能是膠質(zhì)瘤的一個免疫治療靶點。

綜上所述,高級別膠質(zhì)瘤中,MeCP2表達水平低于低級別膠質(zhì)瘤,其低表達水平預(yù)示膠質(zhì)瘤惡性程度高,患者生存期短。MeCP2參與調(diào)控細胞因子或趨化因子信號通路,并與免疫細胞浸潤密切相關(guān),MeCP2可能與膠質(zhì)瘤的侵襲和發(fā)展有關(guān),可能是一個潛在的膠質(zhì)瘤基因治療靶點。但MeCP2在膠質(zhì)瘤中的具體生物學(xué)功能和作用機制還需進一步研究證實。