馬德林,邢 瑜,郭仁世,王成林,張業(yè)猛

(1.青海省農(nóng)作物種子站,青海西寧 810003; 2.海西州農(nóng)業(yè)技術(shù)綜合服務(wù)中心,青海德令哈 817000; 3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100039)

小麥(TriticumaestivumL.)株高是由遺傳因子和外部環(huán)境共同影響,降低株高可提升小麥的抗倒伏能力和收獲指數(shù)[1-2]。在一定范圍內(nèi)小麥株高與產(chǎn)量呈正相關(guān),但過度矮化則會降低產(chǎn)量[3-4]。合理利用矮稈基因,深入分析其遺傳效應(yīng),有利于促進(jìn)矮稈基因的多元利用,實現(xiàn)小麥增產(chǎn)。

自1999年P(guān)eng等[5]發(fā)現(xiàn)并克隆了矮稈基因Rht-B1b(Rht1)和Rht-D1b(Rht2)后,目前已鑒定出26個小麥矮稈基因。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可加速小麥育種進(jìn)程,已廣泛應(yīng)用于多種作物育種中[6]。Ellis等[7-8]不僅設(shè)計出可以精確檢測Rht-B1b和Rht-D1b基因的STS引物,也開發(fā)出與Rht4、Rht5、Rht8等矮稈基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。利用這些特異性分子標(biāo)記,李怡鑫等[9]發(fā)現(xiàn)47份外引小麥種質(zhì)資源中,有46份含有矮稈基因,其中Rht-B1b、Rht4和Rht12的分布頻率較高;孫樹貴等[10]發(fā)現(xiàn)67份美國小麥品種中,有56份品種含有矮稈基因,其中Rht-B1b和Rht8的分布頻率分別是62.7%和43.3%;陳向東等[11]發(fā)現(xiàn)中國小麥主產(chǎn)區(qū)的117份種質(zhì)資源中,矮稈基因的分布頻率為Rht8>Rht-B1b>Rht-D1b>Rht9>Rht13。

競爭性等位基因特異性PCR(kompetitive allele-specific PCR,KASP)針對基因組DNA樣本,可以快速、準(zhǔn)確判斷SNP和InDel,已被廣泛應(yīng)用于小麥功能基因檢測和分子標(biāo)記輔助育種[12]。為了解青海春麥區(qū)小麥品種中Rht-B1b和Rht-D1b基因的類型及分布特點(diǎn),本研究利用Ramirez-gonzalea等[13]報道的小麥KASP引物,對青海春麥區(qū)歷年種植的45份小麥品種(6份地方品種、14份外引品種、25份育成品種)的矮稈基因變異類型進(jìn)行檢測,為青海省小麥矮稈育種提供技術(shù)支撐和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試45份小麥品種均系本實驗室自繁保留,審定信息來自《青海省農(nóng)作物品種志》和中國種業(yè)大數(shù)據(jù)平臺(http://202.127.42.145/bigdataNew/home/ManageOrg),詳細(xì)信息見表1。

表1 供試小麥品種信息Table 1 Information of the tested wheat varieties

1.2 田間種植及農(nóng)藝性狀測定

田間試驗于2013-2015年在青海省海西蒙古族藏族自治州香日德鎮(zhèn)(36°3′52″ N,97°47′45″ E,海拔 2 999 m)進(jìn)行,每個品種種植5行,行長2 m,行距0.2 m,每行播種50粒種子,田間管理同大田生產(chǎn)。參照《農(nóng)作物品種區(qū)域試驗技術(shù)規(guī)程:小麥》(NY/T 1301-2007)對株高、穗長、小穗數(shù)和穗粒數(shù)進(jìn)行測定。

1.3 DNA提取及KASP標(biāo)記檢測

于2015年,每份材料采集3株小麥的幼嫩葉片,混合后采用CTAB法提取基因組DNA,使用美國(Thermo)公司微量紫外分光光度計(Nano Drop 2000C)進(jìn)行DNA濃度和質(zhì)量測定。檢測Rht-B1和Rht-D1不同等位變異的KASP引物由北京佩萊技術(shù)有限公司合成,引物序列見表2。FAM-primer 5′末端連接1個FAM熒光基團(tuán)(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′),HEX-primer 5′末端連接1個HEX熒光基團(tuán)(5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′)。利用Bio-Rad CFX96 PCR儀(Bio-Rad,美國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL,包括4.78 μL DNA(5～50 ng·μL-1),5 μL KASP 5000 V4.02×Master Mix,0.14 μL KASP Assay Mix(上、下游引物混合液),0.08 μL Mg2+。PCR反應(yīng)程序為降落PCR,具體為:94 ℃ 15 min;94 ℃ 20 s,61～55 ℃ 1 min(每個循環(huán)下降0.6 ℃),10個循環(huán);94 ℃ 20 s,55 ℃ 1 min,30個循環(huán);4 ℃避光保存。

表2 本研究所用的KASP引物Table 2 KASP primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,對攜帶不同等位變異小麥品種的株高、穗長、小穗數(shù)和穗粒數(shù)表型進(jìn)行差異顯著性分析和方差分析(ANOVA),并利用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 株高、穗長、小穗數(shù)和穗粒數(shù)表型分析

2013-2015年,45個小麥品種的株高平均值分別為100.21、89.21和103.59 cm,變化范圍分別為72.90～131.07、65.33～125.00和70.00～134.17 cm,變異系數(shù)分別為15.08%、16.12%和16.05%;穗長平均值分別為8.55、8.91和9.40 cm,變化范圍分別為4.22～14.09、4.40～16.84和4.69～15.85 cm,變異系數(shù)分別為18.71%、22.22%和18.94%;小穗數(shù)平均值分別為17.67、16.61和17.59,變化范圍分別為14.00～21.37、13.45～21.34和14.67～21.70,變異系數(shù)分別為10.13%、10.05%和9.49%;穗粒數(shù)平均值分別為39.49、47.30和49.65,變化范圍分別為22.07～56.60、31.75～64.08和34.47～60.27,變異系數(shù)分別為20.79%、16.33%和14.36%(表3)。這些結(jié)果表明,供試45份小麥品種的株高、穗長、小穗數(shù)和穗粒數(shù)的遺傳變異豐富,具有較大的改良潛力。進(jìn)一步對不同來源品種的株高、穗長、小穗數(shù)和穗粒數(shù)表型進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)青海育成品種的穗粒數(shù)顯著高于引進(jìn)品種和地方品種;小穗數(shù)顯著高于引進(jìn)品種,而與地方品種間無顯著差異;株高和穗長與引進(jìn)品種間無顯著差異,且兩個來源品種的株高均顯著低于地方品種,穗長均顯著高于地方品種(表4)。

表3 2013-2015年小麥品種的農(nóng)藝性狀表型分析Table 3 Phenotypic analysis of agronomic characters of wheat varieties in 2013-2015

表4 不用來源小麥品種的農(nóng)藝性狀表型分析Table 4 Phenotypic analysis of agronomic traits of wheat varieties from different origins

2.2 矮稈基因不同等位變異的分布及其對農(nóng)藝性狀的影響

供試45個小麥品種中,Rht-B1位點(diǎn)上存在Rht-B1a和Rht-B1b兩種等位變異,分布頻率分別為91.11%和8.89%。攜帶Rht-B1b的品種株高顯著低于攜帶Rht-B1a的品種,而穗粒數(shù)則相反;攜帶兩種等位變異品種的穗長和小穗數(shù)無顯著差異。Rht-D1位點(diǎn)上存在Rht-D1a和Rht-D1b兩種等位變異,分布頻率分別為86.67%和13.33%。攜帶Rht-D1b的品種株高和穗粒數(shù)顯著低于攜帶Rht-D1a的品種,而穗長則相反;攜帶兩種等位變異品種的小穗數(shù)無顯著差異(表5)。進(jìn)一步對不同來源品種中矮稈優(yōu)異等位變異Rht-B1b和Rht-D1b的分布頻率進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)青海育成品種中Rht-B1b和Rht-D1b的分布頻率分別為16.00%和12.00%;外引品種中只含有Rht-D1b,分布頻率為21.43%;而地方品種不含有Rht-B1b和Rht-D1b(表6)。推測是由于青海地處干旱半干旱地區(qū),春旱嚴(yán)重,蒸發(fā)量大,株高較高的小麥品種根系發(fā)達(dá),抗旱性較強(qiáng),在小麥地方品種選育過程中,忽略了株高方面的選育,從而導(dǎo)致地方品種不含有Rht-B1b和Rht-D1b;而引進(jìn)品種不含有Rht-B1b的原因可能是育種家對小麥特異性狀的選擇,致使在育種過程中Rht-B1b逐漸丟失。

表5 矮稈基因的不同等位變異對小麥品種農(nóng)藝性狀的影響Table 5 Effect of different allelic variations of dwarf genes on agronomic traits of wheat varieties

表6 不同來源小麥品種Rht-B1b和Rht-D1b等位變異的分布頻率Table 6 Distribution frequency of Rht-B1b和Rht-D1bof wheat varieties from different origins

2.3 不同基因型組合對小麥農(nóng)藝性狀的影響

供試45份小麥品種中,共發(fā)現(xiàn)Rht-B1a/Rht-D1a、Rht-B1a/Rht-D1b和Rht-B1b/Rht-D1a三種等位變異組合類型,分布頻率分別為77.78%、13.33%和8.89%。攜帶Rht-B1a/Rht-D1b品種的株高顯著低于攜帶Rht-B1a/Rht-D1a和Rht-B1b/Rht-D1a的品種,攜帶Rht-B1b/Rht-D1a品種的株高也顯著低于攜帶Rht-B1a/Rht-D1a的品種。其中,Rht-B1b/Rht-D1a組合類型不僅可使株高降低,也可增加小穗數(shù)和穗粒數(shù)(表7)。

表7 不同等位變異組合對小麥農(nóng)藝性狀的影響Table 7 Effect ofdifferent allelic variation combinations on agronomic traits of wheat varieties

3 討論

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾暮坦阮愖魑镏?約有40%的人口以其作為主要的糧食來源[14]。因此,高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)是小麥育種的主要目標(biāo)。株高作為小麥生產(chǎn)上重要的農(nóng)藝性狀,與小麥的形態(tài)建成以及田間群體構(gòu)成密切相關(guān),且與小麥高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)具有直接的關(guān)系[3,15]。在一定程度上降低小麥株高,可充分利用耕地、增強(qiáng)小麥光合效率和抗倒伏能力,從而保證小麥穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)[16]。矮稈基因多為隱性基因,且小麥株高易受到環(huán)境條件的影響,在育種過程中選擇比較困難,因此結(jié)合分子標(biāo)記檢測,明確矮稈基因在小麥種質(zhì)中的分布,可加快育種進(jìn)程[11]。

小麥株高和產(chǎn)量均是由多基因控制的綜合性狀, 僅依靠單個基因進(jìn)行分子輔助育種很難達(dá)到提升小麥產(chǎn)量的目的,需要結(jié)合傳統(tǒng)表型選育雜交技術(shù),將多個優(yōu)勢基因聚合,從而實現(xiàn)多基因聚合育種,全面提升小麥產(chǎn)量。本研究采用KASP標(biāo)記對青海春麥區(qū)45份小麥資源進(jìn)行矮稈基因檢測,未發(fā)現(xiàn)同時含有Rht-B1b和Rht-D1b矮稈基因的品種,該結(jié)果與徐晶晶等[2]的研究結(jié)果一致。但我國其他麥區(qū)對Rht-B1b和Rht-D1b的利用率明顯高于青海育成品種[17]。徐 晴等[18]檢測了來自中國不同麥區(qū)的211份小麥資源,發(fā)現(xiàn)Rht-B1b和Rht-D1b的分布頻率分別為38.39%和47.39%;而西北春麥區(qū)這兩個基因的分布頻率僅分別為7.14%和14.29%。值得注意的是,Rht-D1b的利用會降低穗粒數(shù),原因可能是Rht-D1b的降稈效應(yīng)較大,使胚芽鞘長度降低,影響幼苗生長勢和群體密度,最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降[19]。這也是本研究供試材料中未發(fā)現(xiàn)Rht-B1b/Rht-D1b等位變異組合類型的原因。

矮稈基因是小麥育種過程中重要的基因資源之一,明確小麥資源中矮稈基因的分布,能有效促進(jìn)矮稈基因的利用,拓寬矮稈基因遺傳基礎(chǔ)。本研究分析了青海春麥區(qū)部分骨干品種中Rht-B1b和Rht-D1b的分布,分別篩選出含有Rht-B1b和Rht-D1b的小麥品種4份(青海育成品種)和6份(3個青海地區(qū)育成和3個引進(jìn)品種),為矮稈高產(chǎn)小麥品種的選育提供了新的材料。